Name: electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors
Uploaded: 2017-06-13T13:00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors at JoVE.com

Den eksperimentelle del af denne forskning blev støttet af tilskud fra den amerikanske og israelske Bi National Science Foundation (til BM og IL), Israels videnskabsstiftelse (ISF), Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP) (til BM) og bioteknologien Og Biologisk Forskningsråd (BBSRC Grant-nummer: BB / M007006 / 1 og BB / D007585 / 1) til RCH

<ol>
	<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recordings+of+the+light+induced+current+in+dissociated+Drosophila+photoreceptors:+evidence+for+feedback+by+calcium+permeating+the+light-sensitive+channels.">Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).</li><li>Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+mutant+defective+in+extracellular+calcium-+dependent+photoreceptor+deactivation+and+rapid+desensitization.">A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization.</a> Nature. 354, 230-232 (1991).</li><li>Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calphotin:+a+Drosophila+photoreceptor+cell+calcium-binding+protein.">Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+and+Ca2++buffering+are+essential+for+prevention+of+light-induced+retinal+degeneration.">Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration.</a> J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation,+adaptation,+and+cell+survival+functions+of+the+Na+++/Ca+2++exchanger+CalX.">Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX.</a> Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).</li><li>Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-activated+potassium+channels+in+blowfly+photoreceptors+and+their+role+in+light+adaptation.">Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation.</a> J. Physiol. Lond. 440, (1991).</li><li>Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+blue-+and+green-sensitive+photoreceptors+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus.">Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).</li><li>Nasi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+clamp+of+dissociated+photoreceptors+from+the+eye+of+Lima+scabra.">Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra.</a> J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).</li><li>Nasi, E., Gomez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+ion+channels+in+solitary+photoreceptors+of+the+scallop+Pecten+irradians.">Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians.</a> J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).</li><li>Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+2++limits+the+development+of+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors.">Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).</li><li>Kohn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Cooperation+between+the+IP3+Receptor+and+Phospholipase+C+Secures+the+High+Sensitivity+to+Light+of+Drosophila+Photoreceptors+In+Vivo.">Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo.</a> J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).</li><li>Hevers, W., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+modulates+the+voltage+dependence+of+delayed+rectifier+and+Shaker+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors.">Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+photon+responses+in+Drosophila+photoreceptors+and+their+regulation+by+Ca+2.">Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2.</a> J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).</li><li>Scott, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Drosophila+phototransduction+cascade+into+a+signalling+complex+shapes+elementary+responses.">Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses.</a> Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).</li><li>Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+of+G+betae+over+G+qalphae+in+vivo+prevents+dark,+spontaneous+activity+of+Drosophila+photoreceptors.">Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors.</a> J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).</li><li>Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C-Mediated+Suppression+of+Dark+Noise+Enables+Single-Photon+Detection+in+Drosophila+Photoreceptors.">Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).</li><li>Hardie, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+amplification+in+Drosophila+phototransduction.+Roles+for+G+protein,+phospholipase+C,+and+diacylglycerol+kinase.">Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase.</a> Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).</li><li>Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+the+Drosophila+light-sensitive+channels,+TRP+and+TRPL.">In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL.</a> Neuron. 19, 1249-1259 (1997).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+and+manipulation+of+the+Ca+2++selectivity+filter+in+the+Drosophila+transient+receptor+potential+channel.">In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel.</a> J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).</li><li>Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+bovine+rhodopsin+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).</li><li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo.">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+2++-dependent+metarhodopsin+inactivation+mediated+by+calmodulin+and+NINAC+myosin+III.">Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III.</a> Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).</li><li>Cook, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C+and+termination+of+G-protein-mediated+signalling+in+vivo.">Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo.</a> Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).</li><li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors.">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors.">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).</li><li>Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+light-induce+response+of+the+central+retinular+cells+from+the+electroretinogram+of+Drosophila.">Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila.</a> J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trp+gene+is+essential+for+a+light-activated+Ca2++channel+in+Drosophila+photoreceptors.">The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 8, 643-651 (1992).</li><li>Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+light-activated+conductance+is+composed+of+the+two+channels+TRP+and+TRPL.">The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL.</a> Cell. 85 (5), 651-659 (1996).</li><li>Huber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transient+receptor+potential+protein+(Trp),+a+putative+store-+operated+Ca+2++channel+essential+for+phosphoinositide-mediated+photoreception,+forms+a+signaling+complex+with+NorpA,+InaC+and+InaD.">The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD.</a> EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).</li><li>Shieh, B. H., Niemeyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+protein+encoded+by+the+InaD+gene+regulates+recovery+of+visual+transduction+in+Drosophila.">A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila.</a> Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).</li><li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade.">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li><li>Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+transform+glucose+to+alanine,+which+fuels+the+neurons+in+the+honeybee+retina.">Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina.</a> J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+activation+of+light-sensitive+channels+in+Drosophila+photoreceptors.">Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors.</a> J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).</li><li>Agam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+stress+reversibly+activates+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL+in+vivo.">Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo.</a> J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).</li><li>Agam, K., Frechter, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Drosophila+TRP+and+TRPL+channels+requires+both+Ca2++and+protein+dephosphorylation.">Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation.</a> Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).</li><li>Delgado, R., Mu&#241;oz, Y., Pe&#241;a-Cort&#233;s, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors.">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li><li>Parnas, M., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+channel+block+by+Ca2++underlies+the+voltage+dependence+of+Drosophila+TRPL+channel.">Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).</li></ol>

Forfatterne har intet at afsløre.

Anvendelsen af ​​helcelleoptagelser til D. melanogasterfotoreceptorer tilladt til opdagelsen og funktionel belysning af nye signalproteiner, såsom TRP-kanaler 27 , 28 , 29 og INAD 30 , 31 , 32 stilladsprotein. Lige siden den indledende introduktion af denne teknik gjorde det muligt at løse langsigtede grundlæggende spørgsmål vedrørende den ioniske mekanisme og spændingsafhængigheden af ​​lysresponsen. Dette skete på grund af den tildelte evne til nøjagtigt at kontrollere membranspændingen og den ekstracellulære og intracellulære ioniske sammensætning 19 , 28 . En stor hindring for patch-klemmeteknikken i D. melanogaster har været skrøbelighed hos den isolerede ommatidia preparationere. Detaljerede undersøgelser har afsløret, at fototransduktionsmaskineriets integritet er kritisk afhængig af den kontinuerlige forsyning af ATP, især under lyseksponering, hvilket fører til et stort forbrug af ATP. Desværre eliminerer den mekaniske stripning af pigmentet ( dvs. glia) cellerne, som er nødvendig for at nå fotoreceptormembranen med patchpipetten, den vigtigste kilde til metabolitter, der er nødvendige for ATP-produktion 33 . Anvendelse af exogen ATP i registreringspipetten opfylder kun delvis kravet om store mængder ATP. En kort forsyning af ATP fører til spontan aktivering af TRP-kanalerne og dissociationen af ​​fototransduktionsmaskineriet fra de lysaktiverede kanaler, hvilket forårsager en stor forøgelse af cellulær Ca 2+ og afskaffelsen af ​​det normale respons på lys 34 , 35 . Denne rækkefølge af begivenheder skyldes ikke skade påFotoreceptorer ved dissektionsproceduren, men snarere til den cellulære udtømning af ATP. For at forhindre denne forekomst af hændelser og for at opretholde normale lysresponser, bør fotoreceptorerne ikke udsættes for intense lys, der forbruger store mængder ATP. NAD skal også inkluderes i registreringspipetten, formodentlig at lette ATP-produktion i mitokondrierne 18 , 36 . Til måling af spontane og kvantumstød er ovennævnte sværhedsgrad minimal, fordi der kun anvendes dimlampe. I praksis kan en stabil helcelleoptagelse opretholdes i ~ 20-25 minutter, selvom der er en tendens til, at reaktionskinetikken sænker over denne periode. Et enkelt præparat af dissocieret ommatidia kan forblive levedygtig i op til 2 timer. En yderligere mangel på det isolerede ommatidia-præparat er utilgængeligheden af ​​microvilli, som oversætter utilgængeligheden af ​​TRP ogTRPL kanaler til optagelsespipetten, hvilket forhindrer enkeltkanaloptagelser. Ved hjælp af en metode, de udviklede, lykkedes Bacigalupo og kolleger at optage enkanalaktivitet direkte fra rhabdomere 37 . Denne kanalaktivitet adskiller imidlertid sig fra den af ​​TRPL-kanaler, der heterologt udtrykkes i vævskulturceller 38, og fra TRP-kanalaktivitet afledt af skudstøjanalyse opnået fra isoleret ommatidia 34 . Formentlig beskadigede dissektionsproceduren fotoreceptorcellerne væsentligt ved anvendelse af denne metode.

Omfattende genetiske undersøgelser af frugtflyve , Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , der blev indledt for mere end 100 år siden, har etableret D. melanogaster- flyve som en yderst nyttig eksperimentel model til genetisk dissektion af komplekse biologiske processer. Den nedenfor beskrevne metode kombinerer den akkumulerede effekt af D. melanogaster molekylær genetik med det høje signal-til-støjforhold for fuldcelle patch clamp-optagelser. Denne kombination muliggør undersøgelsen af D. melanogaster- fototransduktion som en model for inositol-lipid-signalering og TRP-kanalregulering og -aktivering både i det oprindelige miljø og ved den højeste opløsning af enkeltmolekyler. Anvendelse af helcelleoptagelsesmetoden til D. melanogaster fotoreceptorer har revolutioneret undersøgelsen af ​​invertebratfototransduktion. Denne metode blev udviklet af Hardie 1 og indepEndelig af Ranganathan og kolleger for 2 ~ 26 år siden og var designet til at udnytte de omfattende genetiske manipulationsværktøjer af D. melanogaster og bruge dem til at afdække mekanismer for fototransduktion og inositol-lipid signalering. I starten led denne teknik af en hurtig reduktion i lysfølsomhed og et lavt udbytte af ommatidier under dissektionsprocessen, hvilket forhindrede detaljerede kvantitative undersøgelser. Senere øgede tilsætningen af ​​ATP og NAD til patchpipetten dramatisk hæftelsen af ​​præparatet til længerevarende kvantitative optagelser. Derefter blev omfattende karakterisering af signaltransduktionsmekanismen på molekylniveau realiseret. I øjeblikket er D. melanogaster- fototransduktion et af de få systemer, hvor phosphoinositidsignalerings- og TRP-kanaler kan studeres ex vivo ved enkeltmolekylopløsning. Dette gør D. melanogaster fototransduktion og migThodology udviklet til at studere denne mekanisme et meget følsomt modelsystem. Denne protokol beskriver, hvordan man dissekerer D. melanogaster retina og mekanisk striper den isolerede ommatidia fra de omgivende pigment (glia) celler. Dette muliggør dannelsen af ​​en giga-tætning og en helcelle patch klemme på fotoreceptor celle legemer. Heldigvis er de fleste signalproteiner begrænset til rhabdomere og diffunderer ikke. Derudover er der en immobil Ca 2+ buffer kaldet calphotin, der er placeret mellem signalkammeret og cellekroppen 3 , 4 og et højt ekspressionsniveau for Na + / Ca 2+ -veksleren (CalX) i mikrovilli 5 . Sammen giver proteinindeslutning til rhabdomeren, calphotin-bufferen og den høje ekspression af CalX mulighed for relativt langvarig ( dvs. op til ~ 20 min) helcelleoptagelser uden tab af væsentlige komponenterAf fototransduktionsprocessen og samtidig opretholde høj følsomhed over for lys. Den følgende protokol beskriver, hvordan man får isoleret ommatidia og udfører helcelleoptagelser, der synes at bevare fototransduktionskaskadens native egenskaber. Hele-celle patch clamp eksperimenter på dissocieret kakerlak ( Periplaneta americana ) 6 og cricket ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia blev udført tilsvarende som beskrevet for D. melanogaster . Desuden blev patch clamp eksperimenter på dissocierede fotoreceptorer af filen clam, ( Lima scabra ) og jakobsmuslinger ( Pecten irradians ) udført på en lidt anden måde end den, der blev udført på D. melanogaster , hvilket tillader både helcelle 8 og enkeltkanal målinger 9 . Her beskrives de vigtigste resultater opnået i D. melanogaster under anvendelse af denne teknik. Diskussionen iHerunder beskrivelse af nogle faldgruber og begrænsninger af denne teknik.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1363">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:292px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:508px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">5 ml syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">1 ml syringe with elongated tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Silicone dissection dish/block</td>
			<td align="left">Dow Corning</td>
			<td align="left">Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td align="left">Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60&#7506;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Syringe filters</td>
			<td align="left">Millex</td>
			<td></td>
			<td align="left">22 &#181;m PVDF filter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Capillaries (for omatidia separation)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Polyethylene Tubing</td>
			<td align="left">Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td align="left">1.57 x 1.14 mm (35 cm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">&#160;2 small beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">50 ml or less</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">2 paraffin film sheets</td>
			<td align="left">Parafilm M</td>
			<td></td>
			<td align="left">~5 x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Bath chamber</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Cover slips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">22 x 22 mm No. 0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Paraplast Plus</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td align="left">Paraffin &#8211; polyisobutylene mixture</td>
			<td align="left">To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Ground</td>
			<td align="left">Warner Instruments&#160;</td>
			<td align="left">64-1288</td>
			<td align="left">Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Headless micro dissection needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Entomology, 12 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Micro dissecting needle holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Vise</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">2 fine tweezers + 1 rough tweezers</td>
			<td></td>
			<td align="left">Dumont #5, Biology&#160;</td>
			<td align="left">0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Stereoscopic zoom Microscope&#160;</td>
			<td align="left">Nikon</td>
			<td align="left">SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Cold light source</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">KL1500 LCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter (Color) for cold light source</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">RG620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Delicate wipers</td>
			<td align="left">Kimtech</td>
			<td></td>
			<td align="left">Kimwipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Electrode holder</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td align="left">QSW-T10P</td>
			<td align="left">Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Silver Wire</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td align="left">0.25 mm diameter, needs to be chloridized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">MP 85</td>
			<td align="left">Huxley-Wall Style Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Faraday cage</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td align="left">Electromagnetic noise shielding and black front curtain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Anti-vibration Table</td>
			<td align="left">Newport</td>
			<td align="left">VW-3036-OPT-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Osilloscope</td>
			<td align="left">GW</td>
			<td align="left">GOS-622G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Perfusion system</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td align="left">VC-8P</td>
			<td align="left">Pinch valve control system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Perfusion valve controller</td>
			<td align="left">Scientific instruments</td>
			<td align="left">BPS-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td align="left" height="20" style="height:20px;">Suction system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Amplifier</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">Axopatch-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Head-stage</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">CV - 4</td>
			<td align="left">Gain: x 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">A/D converter</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Clampex</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td dir="LTR">10</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">pCLAMP</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td>10</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light source (Xenon Arc lamp)</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">Lambda LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light detector</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td align="left">phototransistor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter wheel and shutter controller</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filters (Natural density filter)</td>
			<td align="left">Chroma</td>
			<td align="left">6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter (Color)</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">OG590, Edge filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Xenon Flash Lamp system</td>
			<td align="left">Dr. Rapp OptoElecftronic</td>
			<td align="left">JML-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light guide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Quartz&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Pulse generator</td>
			<td align="left">AMPI</td>
			<td align="left">Master 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td align="left">Olympus</td>
			<td align="left">IX71, Inverted</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Red illumination filter (Microscope)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">RG630 / RG645 &#248;45mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Microscope objective</td>
			<td align="left">Olympus</td>
			<td align="left">X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">CCD Camera</td>
			<td align="left">Andor</td>
			<td align="left">iXon DU885K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">NIS Element&#160;</td>
			<td align="left">Nikon</td>
			<td align="left">AR</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td align="left" height="24" style="height:24px;">Ca+2 indicator</td>
			<td align="left">Invitrogen</td>
			<td align="left">Calcium green 5N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Excitation &#38; emission filters and dichroic mirror</td>
			<td align="left">Chroma</td>
			<td align="left">19002 - AT - GFP/FITC Longpass set</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Vertical pipette puller</td>
			<td align="left">Narishige&#160;</td>
			<td align="left">Model PP83</td>
			<td align="left">Use either vertical or horizontal puller, as preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Horizontal pipette puller</td>
			<td align="left">Sutter Instrument&#160;</td>
			<td align="left">Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filament</td>
			<td align="left">Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td align="left">3 mm trough or square box</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Capillaries</td>
			<td align="left">Harvard Apparatus</td>
			<td align="left">borosilicate glass capillaries</td>
			<td align="left">1 x 0.58 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors

Hele celle spænding clamp optagelser fra Drosophila melanogaster fotoreceptorer har revolutioneret området for invertebrat visuel transduktion, hvilket muliggør brugen af D. melanogaster molekylær genetik til at studere inositol-lipid signalering og transient receptor receptor potentielle (TRP) kanaler på single-molekylen niveau. En håndfuld laboratorier har mestret denne kraftfulde teknik, som gør det muligt at analysere de fysiologiske reaktioner på lys under højt kontrollerede forhold. Denne teknik tillader kontrol over det intracellulære og ekstracellulære medium; Membranspændingen; Og hurtig anvendelse af farmakologiske forbindelser, såsom en række ioniske eller pH-indikatorer, til intra- og ekstracellulære medier. Med et usædvanligt højt signal-til-støjforhold gør denne metode det muligt at måle mørke spontane og lysinducerede enhedsstrømme ( dvs. spontane og quantum humle) og makroskopiske lysinducerede strømme (LIC) fra syndGle D. melanogaster fotoreceptorer. Denne protokol beskriver detaljeret alle de vigtigste trin, der er nødvendige for at udføre denne teknik, som omfatter både elektrofysiologiske og optiske optagelser. Flyvehindehindefordelingsproceduren til opnåelse af intakt og levedygtig ex vivo- isoleret ommatidia i badekammeret er beskrevet. Det udstyr, der er nødvendigt for at udføre helcelle- og fluorescensbilledmålinger, er også detaljerede. Endelig forklares faldgruberne ved brug af dette delikate præparat under udvidede eksperimenter.

Den beskrevne metode har muliggjort den nøjagtige registrering af de grundlæggende enhedsstrømme, som genererer spontane og lysfremkaldte kvantebumps, som summen producerer det makroskopiske respons på lys under definerede betingelser. Det tillod ligeledes sammenligningen mellem vildtype og mutant fluer, der har defekter i kritiske signalmolekyler ( figur 3 og 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Desuden afslørede evnen til at måle reverseringspotentiale under bi-ioniske forhold de grundlæggende biofysiske egenskaber af TRP- og TRP-lignende (TRPL) kanalerne 18 , 19 . Det muliggjorde også måling af virkningerne af aminosyresubstitutioner i poreområdet af TRP, der modificerede dets Ca 2+Permeabilitet 20 . Det lysrespons, der opnås ved hjælp af patchclamp-helcelleoptagelser afhænger lineært af lysintensiteten i mindst 4 størrelsesordener. Dette kunne ikke løses ved hjælp af ERG og intracellulære optagelsesmetoder. Følgelig afslørede en serie af reaktioner på korte blinkninger med stigende intensitet og en plot af intensitetsresponsfunktionen en streng linearitet af flashresponset med stigende lysintensitet. Den strenge linearitet varer op til mindst flere hundrede pA, men det er diskutabelt, om det derefter er linearitet eller klemkontrol, der bryder sammen ( figur 6 ). Disse resultater tyder på, at de makroskopiske responser på lys er en lineær opsummering af de ensartede responser til lys ( dvs. kvantumstød). Det har været veletableret ved brug af spændingsoptagelser, som dæmper lysstimulering indUces diskrete spændingsudsving ( dvs. kvantebump) hos de fleste hvirvelløse arter. D. melanogaster kvantebumpene skyldes den samordnede åbning af ~ 15 TRP kanaler og ~ 2 TRPL kanaler ved toppen af ​​bumpen 18 . Hver bump genereres ved absorptionen af ​​en enkelt foton, mens det makroskopiske svar på mere intense lys er summationen af ​​disse elementære reaktioner 14 , 21 . Bumpene varierer betydeligt i latens, tidskurs og amplitude, selvom stimulusbetingelserne er ens. Bump generation er en stokastisk proces beskrevet af Poisson statistikker, hvor hver effektivt absorberet foton udløser kun en bump. Single-foton-enkelt-bump forholdet kræver, at hvert trin i kaskade ikke kun omfatter en effektiv &quot;turn-on&quot; mekanisme, men også en lige så effektiv &quot;off-off&quot; mekanisme. Den funktionelle fordel er produktionen af ​​aMeget følsom fotonetæller med et hurtigt forbigående svar, der er meget velegnet til både følsomheden og den tidsmæssige opløsning, der kræves af det visuelle system. Kravet om en effektiv afbrydningsmekanisme er afsløret, når enten den aktive fotopigment ( dvs. metarhodopsin, M) eller dens mål, G q α, ikke inaktiverer og fører til kontinuerlig produktion af bump, langt efter at lyset er slukket ( figur 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 . Bumpen repræsenterer TRP / TRPL-kanalernes kooperative aktivitet i en microvillus. Som sådan bør enhver hypotese af kanalaktivering også forklare kooperativ kanalaktivering. For nylig har Hardie og kolleger vist at lys fremkalder hurtige sammentrækninger af fotoreceptorerne, hvilket tyder på, at lysfølsomE-kanaler (TRP / TRPL) kan være mekanisk indhegnet 25 . Denne mekaniske aktivering, sammen med de observerede protoner frigivet ved PLC-medieret PIP 2- hydrolyse, fremmer åbningen af ​​TRP / TRPL-kanalerne og forklarer kooperativets karakter af bumpproduktion 26 . I øjeblikket er D. melanogaster fotoreceptorer et af de få systemer, hvor phosphoinositidsignalerings- og TRP-kanaler kan studeres in vivo , hvilket gør D. melanogaster- fototransduktion og den metodologi, der udvikles til at studere denne mekanisme et yderst værdifuldt model system. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig3.jpg" /> Figur 3: InaC P209 og inaD P215 mutanter afslører langsomme reaktionsterminering af det makroskopiske respons til lys og af enkeltkvantumbumpene. ( A ) Den isolerede ommatidiumprepaRation med en patchpipette fyldt med fluorescerende Lucifer Yellow CH farvestof (excitation: 430 nm, emission: 540 nm) præsenteres under en helcelleoptagelse. Bemærk, at det fluorescerende farvestof diffunderede og mærkede en enkelt fotoreceptorcellekrop, og at fotoreceptorcellekropperne løsnes fra deres aflange axoner, men stadig opretholder levedygtighed. Dette præparat er egnet til samtidige helcelleoptagelser og billeddannelsesforsøg. ( BD ) Øvre paneler: Hele celle spænding clamped quantum bump responser til kontinuerlig dim lys (åben bar) i WT, inaC P209 og inaD P215 mutant fluer. En langsom afslutning af humperne observeres i inaC P209 og inaD P215 mutanter i forhold til WT fluer. Indsnittet nedenfor viser den forstørrede form af enkeltstød. Bundpaneler: Normaliserede helcelle optagne makroskopiske reaktioner på en 500 ms lyspuls (1,5 x 10 5 fotoner pr s) af ovennævnte vildtype<html> Og mutant fluer. (EG) Øvre paneler: Hele celle spænding clamped quantum bump svar på en kort (1 ms), svagt lys fremkalde single-foton svar i vildtype, arr2 3 og ninaC P235 mutant fluer. Bemærk trinet af humle observeret i arr2 3 og ninaC P235 mutant fluer som reaktion på en enkelt fotonabsorption. Bundpaneler: Hele-celle spænding fastspændte normaliserede reaktioner på en 500 ms lyspuls (1,5 x 104 fotoner / s) i de tilsvarende mutanter. Bemærk den langsomme afslutning af de makroskopiske reaktioner, der observeres i afsnit 2 Og ninaC P235 mutant fluer i forhold til WT. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> D / 55627 / 55627fig4.jpg &quot;/&gt; Figur 4: Cellulær Ca 2+ -dynamik Følgende signal-induceret Ca 2+ -tilstrømning påvirkes af Calphotin. En tidsserie af fotoreceptorbilleder af vildtype og Cpn 1% fluer viser fluorescensen af ​​Ca 2+ -indikatoren under lysstimulering. Råintensitetsbilleder tegnes ved hjælp af falskfarvekodning (bar = 10 μm; pilehoveder angiver pipetten). Figur genoptrykt med tilladelse fra Weiss et al. 4 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig5.jpg" /> Figur 5: De elektrofysiologiske egenskaber af WT-, trp- og trpl-mutanter. ( A ) Helecelle spændingsklemme recoRdings af quantum bumps som svar på kontinuerlig dim lys (åben bar) i WT, trpl 302 og trp P343 null mutant fluer. Meget reducerede amplituder af trp P34 3 bump observeres. Inset: Forstørrede single quantum bumps af wildtype og trp P343 null mutant fluer vises. ( B ) Wholecelle spændingsklemmeoptagelser som reaktion på en 3 s lyspuls af vildtype og de tilsvarende mutanter. Det forbigående steady state respons af trp P343 mutanten observeres. Inset: Forstørrede lysresponser af WT og trp P343 mutant er vist. ( C ) En familie af overlejrede lysinducerede strømme af ovennævnte fluestammer, fremkaldt som reaktion på en 20 ms lyspuls ved spændingstrin på 3 mV målt omkring reverseringspotentialet (E rev ). ( D ) Et histogram der udformer den gennemsnitlige E rev af vildtype og de forskellige mutanerts. Fejlstængerne er SEM Vendingspotentialet (E rev ) for WT er mellem den positive E rev for trpl 302 , som kun udtrykker TRP og E rev for trp P343 null mutanten, som kun udtrykker TRPL. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig6.jpg" /> Figur 6: Flash-responsen er strengt lineær med stigende lysintensitet. En serie af aktuelle reaktioner på korte blinkninger af stigende lysintensitet og et plot af afhængigheden af ​​toppamplituden af ​​lysresponsen på den stigende intensitet af korte lysflammer. Dette forhold afslører en streng linearitet mellem flash respons og stigende lysintensitet. Denne strenge linearitetRummer op til mindst flere hundrede pA, med lysintensitet på over 4 størrelsesordener, mens det er diskutabelt, om det er linearitet eller klemkontrol, der bryder ned derefter. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig6large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af denne figur.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7,15 (juster med NaOH) </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Koncentration (mM) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Proline </td><td> 25 </td></tr><tr><td> alanin </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> Opbevares ved -20 ° C. </td></tr><tr><td colspan= &quot;2&quot;&gt; Bemærk: Denne opløsning er nominelt Ca 2+ fri, men har ingen Ca 2+ buffere tilsat og vil derfor have ca. 5 - 10 μM spor Ca 2+ . Ekstracellulær opløsning (ES) = ES-0Ca 2+ med 1,5 mM CaCl2 fremstillet ved at tilsætte CaCl2 fra en 0,5 eller 1 M stamopløsning til ES-0Ca 2+ . </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Ca + 2- fri ekstracellulær opløsning (ES). Kemisk beskrivelse og de specifikke mængder, der kræves for at producere Ca +2- fri ES. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Beløb </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> saccharose </td><td> 1,5 g </td></tr><tr><td colspan="2"> Opdel i 150 μl alikvoter i 1,5 ml hætteglas og opbevar ved -20 76; C. </td></tr><tr><td> Triturationsopløsning (TS) </td><td> Fyld 1 hætteglas med 150 ml stamopløsning med 1.350 ml ES eller ES-0Ca 2+ for at matche den opløsning, der blev brugt under dissektionen. </td></tr></tbody></table> Tabel 2: Fetal bovint serum (FBS) + saccharose-stamopløsning. Kemisk beskrivelse og de specifikke mængder, der kræves til fremstilling af føtalt bovint serum (FBS) + saccharose-stamopløsning. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7,15 (juster med KOH) </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Koncentration (mM) </td></tr><tr><td> Kaliumgluconat (Kglu) </td><td> 140 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATP magnesiumsalt (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTP natriumsalt (Na2 GTP) </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> P-nicotinamid adenin-dinukleotidhydrat (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> Opbevares ved -20 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabel 3: Intracellulær Solution (IS1). Kemisk beskrivelse og de specifikke mængder, der kræves for at producere IS1, som hovedsagelig anvendes til intensitetsrespons og kvantumbumpmålinger. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7,15 (juster med CsOH) </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Koncentration (mM) </td></tr><tr><td> CsCI </td><td> 120 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATP magnesiumsalt (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTP natriumsalt (Na2 GTP) </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> P-nicotinamid adenin-dinukleotidhydrat (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tetraethylammoniumchlorid (TAE) </td><td> 15 </td></tr><tr><td></td><td> Opbevares ved -20 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabel 4: Intracellulær Opløsning (IS2). Kemisk beskrivelse og de specifikke mængder, der kræves for at producere intracellulær opløsning IS2, som hovedsagelig anvendes til reversering potentielle målinger af den lysinducerede strøm.

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors at JoVE.com

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Helecelleoptagelser fra Drosophila melanogaster fotoreceptorer muliggør måling af spontane mørke humper, kvantebumps, makroskopiske responser til lys og aktuelle spændingsforhold under forskellige forhold. I kombination med D. melanogaster genetiske manipulationsværktøjer muliggør denne metode undersøgelsen af ​​den allestedsnærværende inositol-lipid-signalvej og dens mål, TRP-kanalen.

Elektrofysiologisk metode til hele celle spænding clamp optagelser fra<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Hele Cell Patch Clamp for Undersøgelse af mekanismerne i Infrarød Neural Stimulation

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Patchclamp Optagelser fra embryonale zebrafisk Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

Elektrofysiologiske Optagelse fra<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Smag sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Helcelle-patch-clamp Optagelser fra Morphologically- og Neurochemically identificerede Hippocampale interneuroner

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Forbundne Helcelle optagelser i Organotypiske hippocampusskiver

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elektrofysiologiske og morfologiske karakterisering af neuronal Mikrokredsløb i akut Brain Skiver Brug parrede Patch-clamp optagelser

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-celle Patch-clamp Optagelser i Brain Skiver

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Elektrofysiologiske Metode til Recording Intracellulær Voltage Responses af<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreceptorer og interneuroner til Light Stimuli<em&gt; In vivo</em