Name: electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors
Uploaded: 2017-06-13T13:00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors at JoVE.com

Het experimentele deel van dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de VS-Israël Bi National Science Foundation (BM en IL), de Israëlische Science Foundation (ISF), de Deutsch-Israëlische Projektkooperatie (DIP) (naar BM) en de Biotechnologie En Onderzoeksraad Biologische Wetenschappen (BBSRC Grant-nummers: BB / M007006 / 1 en BB / D007585 / 1) naar RCH

<ol>
	<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recordings+of+the+light+induced+current+in+dissociated+Drosophila+photoreceptors:+evidence+for+feedback+by+calcium+permeating+the+light-sensitive+channels.">Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).</li><li>Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+mutant+defective+in+extracellular+calcium-+dependent+photoreceptor+deactivation+and+rapid+desensitization.">A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization.</a> Nature. 354, 230-232 (1991).</li><li>Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calphotin:+a+Drosophila+photoreceptor+cell+calcium-binding+protein.">Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+and+Ca2++buffering+are+essential+for+prevention+of+light-induced+retinal+degeneration.">Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration.</a> J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation,+adaptation,+and+cell+survival+functions+of+the+Na+++/Ca+2++exchanger+CalX.">Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX.</a> Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).</li><li>Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-activated+potassium+channels+in+blowfly+photoreceptors+and+their+role+in+light+adaptation.">Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation.</a> J. Physiol. Lond. 440, (1991).</li><li>Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+blue-+and+green-sensitive+photoreceptors+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus.">Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).</li><li>Nasi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+clamp+of+dissociated+photoreceptors+from+the+eye+of+Lima+scabra.">Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra.</a> J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).</li><li>Nasi, E., Gomez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+ion+channels+in+solitary+photoreceptors+of+the+scallop+Pecten+irradians.">Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians.</a> J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).</li><li>Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+2++limits+the+development+of+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors.">Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).</li><li>Kohn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Cooperation+between+the+IP3+Receptor+and+Phospholipase+C+Secures+the+High+Sensitivity+to+Light+of+Drosophila+Photoreceptors+In+Vivo.">Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo.</a> J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).</li><li>Hevers, W., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+modulates+the+voltage+dependence+of+delayed+rectifier+and+Shaker+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors.">Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+photon+responses+in+Drosophila+photoreceptors+and+their+regulation+by+Ca+2.">Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2.</a> J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).</li><li>Scott, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Drosophila+phototransduction+cascade+into+a+signalling+complex+shapes+elementary+responses.">Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses.</a> Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).</li><li>Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+of+G+betae+over+G+qalphae+in+vivo+prevents+dark,+spontaneous+activity+of+Drosophila+photoreceptors.">Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors.</a> J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).</li><li>Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C-Mediated+Suppression+of+Dark+Noise+Enables+Single-Photon+Detection+in+Drosophila+Photoreceptors.">Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).</li><li>Hardie, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+amplification+in+Drosophila+phototransduction.+Roles+for+G+protein,+phospholipase+C,+and+diacylglycerol+kinase.">Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase.</a> Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).</li><li>Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+the+Drosophila+light-sensitive+channels,+TRP+and+TRPL.">In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL.</a> Neuron. 19, 1249-1259 (1997).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+and+manipulation+of+the+Ca+2++selectivity+filter+in+the+Drosophila+transient+receptor+potential+channel.">In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel.</a> J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).</li><li>Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+bovine+rhodopsin+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).</li><li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo.">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+2++-dependent+metarhodopsin+inactivation+mediated+by+calmodulin+and+NINAC+myosin+III.">Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III.</a> Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).</li><li>Cook, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C+and+termination+of+G-protein-mediated+signalling+in+vivo.">Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo.</a> Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).</li><li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors.">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors.">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).</li><li>Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+light-induce+response+of+the+central+retinular+cells+from+the+electroretinogram+of+Drosophila.">Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila.</a> J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trp+gene+is+essential+for+a+light-activated+Ca2++channel+in+Drosophila+photoreceptors.">The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 8, 643-651 (1992).</li><li>Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+light-activated+conductance+is+composed+of+the+two+channels+TRP+and+TRPL.">The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL.</a> Cell. 85 (5), 651-659 (1996).</li><li>Huber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transient+receptor+potential+protein+(Trp),+a+putative+store-+operated+Ca+2++channel+essential+for+phosphoinositide-mediated+photoreception,+forms+a+signaling+complex+with+NorpA,+InaC+and+InaD.">The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD.</a> EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).</li><li>Shieh, B. H., Niemeyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+protein+encoded+by+the+InaD+gene+regulates+recovery+of+visual+transduction+in+Drosophila.">A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila.</a> Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).</li><li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade.">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li><li>Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+transform+glucose+to+alanine,+which+fuels+the+neurons+in+the+honeybee+retina.">Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina.</a> J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+activation+of+light-sensitive+channels+in+Drosophila+photoreceptors.">Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors.</a> J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).</li><li>Agam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+stress+reversibly+activates+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL+in+vivo.">Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo.</a> J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).</li><li>Agam, K., Frechter, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Drosophila+TRP+and+TRPL+channels+requires+both+Ca2++and+protein+dephosphorylation.">Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation.</a> Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).</li><li>Delgado, R., Mu&#241;oz, Y., Pe&#241;a-Cort&#233;s, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors.">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li><li>Parnas, M., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+channel+block+by+Ca2++underlies+the+voltage+dependence+of+Drosophila+TRPL+channel.">Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).</li></ol>

De auteurs hebben niets te onthullen.

De toepassing van hele cel opnames op D. melanogaster fotoreceptoren toegestaan ​​voor de ontdekking en de functionele toelichting van nieuwe signalering eiwitten, zoals TRP kanalen 27 , 28 , 29 en INAD 30 , 31 , 32 steiger eiwit. Sinds de initiële introductie van deze techniek heeft het de oplossing van langetermijnvraagstukken over het ionische mechanisme en spanningsafhankelijkheid van het lichtrespons mogelijk gemaakt. Dit gebeurde door het toegewezen vermogen om de membraanspanning en extracellulaire en intracellulaire ionische samenstelling 19 , 28 nauwkeurig te regelen. Een belangrijk obstakel van de patch klemmethode in D. melanogaster is de fragiliteit van de geïsoleerde ommatidia preparantsoen. Uitgebreide studies hebben aangetoond dat de integriteit van de phototransductiemachines kritisch hangt af van de doorlopende levering van ATP, vooral bij lichtbelichting, wat leidt tot een groot verbruik van ATP. Helaas elimineert de mechanische striping van de pigmenten ( dwz glia) cellen, die nodig zijn om het fotoreceptormembraan met de patchpipet te bereiken, de belangrijkste bron van metabolieten die nodig zijn voor ATP-productie 33 . Toepassing van exogene ATP in de opnamepipet voldoet slechts gedeeltelijk aan de eis voor grote hoeveelheden ATP. Een tekort aan ATP leidt tot spontane activering van de TRP kanalen en naar de dissociatie van de phototransduction machines van de licht geactiveerde kanalen, waardoor een grote toename van cellulaire Ca 2+ en de afschaffing van de normale respons op licht 34 , 35 wordt veroorzaakt. Deze reeks gebeurtenissen is niet te wijten aan schade aan deFotoreceptoren door de dissectieprocedure, maar liever naar de cellulaire depletie van ATP. Om te voorkomen dat deze volgorde van gebeurtenissen optreedt en om normale lichteffecten te handhaven, mogen de fotoreceptoren niet worden blootgesteld aan intense lichten, die grote hoeveelheden ATP verbruiken. Ook moet NAD in de opnamepipet opgenomen worden, vermoedelijk om ATP-productie in de mitochondria 18 , 36 te vergemakkelijken. Voor de metingen van spontane en kwantumstoten is de bovengenoemde moeilijkheid minimaal omdat alleen dimlichten worden gebruikt. In de praktijk kan een stabiele hele-cel opname worden gehandhaafd voor ~ 20-25 minuten, hoewel er een tendens is voor reactiekinetiek om gedurende deze periode te vertragen. Een enkele bereiding van gedisocieerd ommatidia kan tot 2 uur levensvatbaar blijven. Een bijkomende tekortkoming van de geïsoleerde ommatidiapreparatie is de ontoegankelijkheid van de microvilli, die vertaalt naar de ontoegankelijkheid van de TRP enTRPL kanalen naar de opnamepipet, waardoor opnamen met een kanaal worden voorkomen. Met behulp van een methode die ze ontwikkelden, slaagde Bacigalupo en collega&#39;s erin om directe opnamen uit de rhabdomere 37 direct op te nemen . Deze kanaalactiviteit verschilt echter van die van TRPL kanalen die heterologisch tot expressie komen in weefselkweekcellen 38 en van TRP-kanaalactiviteit afgeleid van schotgeluidsanalyse verkregen uit geïsoleerde ommatidia 34 . Vermoedelijk beschadigde de dissectieprocedure de fotoreceptorcellen bij het gebruik van deze methode.

Uitgebreide genetische studies van de vruchtvlieg , Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , die meer dan 100 jaar geleden zijn ingezet, hebben de D. melanogastervliegtuig opgezet als een extreem nuttig experimenteel model voor de genetische dissectie van complexe biologische processen. De hierna beschreven methodologie combineert de geaccumuleerde kracht van de D. melanogaster moleculaire genetica met de hoge signaal- ruisverhouding van volledige-cel patch klemopnamen. Deze combinatie zorgt voor de studie van D. melanogaster phototransduction als een model van inositol-lipid signalering en TRP kanaal regulatie en activatie, zowel in de native omgeving als bij de hoogste resolutie van enkele moleculen. Toepassing van de hele cel opname methode op D. melanogaster photoreceptors heeft de studie van invertebrate phototransduction omgezet. Deze methode is ontwikkeld door Hardie 1 en indepEindelijk door Ranganathan en collega&#39;s 2 ~ 26 jaar geleden en was ontworpen om de uitgebreide genetische manipulatie-instrumenten van D. melanogaster te exploiteren en ze te gebruiken om mechanismen van fototransductie en inositol-lipide signalering te ontdekken. In de eerste plaats leed deze techniek aan een snelle vermindering van de lichtgevoeligheid en een lage opbrengst van ommatidia tijdens het dissectieproces, waardoor gedetailleerde kwantitatieve studies werden voorkomen. Later verhoogde de toevoeging van ATP en NAD aan de patchpipet de geschiktheid van het preparaat voor langdurige kwantitatieve opnames. Vervolgens werd uitgebreide karakterisering van het signaal-transductiemchanisme op het moleculaire niveau gerealiseerd. Momenteel is D. melanogaster phototransduction één van de weinige systemen waarin fosfoinositide-signalering en TRP kanalen ex vivo kunnen worden bestudeerd bij een molecuulresolutie. Dit maakt D. melanogaster phototransduction en de mijThodology ontwikkeld om dit mechanisme een zeer gevoelig modelsysteem te bestuderen. Dit protocol beschrijft hoe het D. melanogaster retina dissecteert en de geïsoleerde ommatidia van de omliggende pigment (glia) cellen mechanisch afbreken. Dit stelt de vorming van een giga-seal en een hele-cel patch klem op de photoreceptor cel lichamen mogelijk. Gelukkig zijn de meeste signaalproteïnen beperkt tot de rhabdomere en diffunderen ze niet. Bovendien is er een immobiele Ca 2+ buffer genaamd calphotin, gelegen tussen het signaalcompartiment en het cellichaam 3 , 4 en een hoog expressieniveau van de Na + / Ca 2+ wisselaar (CalX) in de microvilli 5 . Samen vormen de eiwitbevestiging aan de rhabdomere, de calphotinbuffer en de hoge expressie van de CalX relatief langdurige ( dwz maximaal ~ 20 minuten) volledige celopnamen zonder verlies van essentiële componentenVan het fototransductieproces en met behoud van hoge gevoeligheid voor licht. Het volgende protocol beschrijft hoe u geïsoleerde ommatidia kunt verkrijgen en volledige cilinderopnamen uitvoeren die de inheemse eigenschappen van de fototransductiekascade voorkomen. Hele-cel patch klem experimenten op gedissocieerde kakkerlak ( Periplaneta americana ) 6 en cricket ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia werden op dezelfde wijze uitgevoerd als die beschreven voor D. melanogaster . Daarnaast werden patchclamp-experimenten op gedissocieerde fotoreceptoren van het bestandsbloem, ( Lima scabra ) en sint- jakobsschelp ( Pecten-irradians ) op een enigszins andere manier uitgevoerd dan die uitgevoerd op D. melanogaster , waardoor zowel de hele cel 8 als een kanaalsmeting 9 . Hier worden de belangrijkste prestaties verkregen in D. melanogaster met behulp van deze techniek beschreven. De discussie iBevat de beschrijving van sommige valkuilen en beperkingen van deze techniek.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1363">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:292px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:508px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">5 ml syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">1 ml syringe with elongated tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Silicone dissection dish/block</td>
			<td align="left">Dow Corning</td>
			<td align="left">Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td align="left">Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60&#7506;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Syringe filters</td>
			<td align="left">Millex</td>
			<td></td>
			<td align="left">22 &#181;m PVDF filter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Capillaries (for omatidia separation)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Polyethylene Tubing</td>
			<td align="left">Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td align="left">1.57 x 1.14 mm (35 cm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">&#160;2 small beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">50 ml or less</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">2 paraffin film sheets</td>
			<td align="left">Parafilm M</td>
			<td></td>
			<td align="left">~5 x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Bath chamber</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Cover slips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">22 x 22 mm No. 0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Paraplast Plus</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td align="left">Paraffin &#8211; polyisobutylene mixture</td>
			<td align="left">To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Ground</td>
			<td align="left">Warner Instruments&#160;</td>
			<td align="left">64-1288</td>
			<td align="left">Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Headless micro dissection needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Entomology, 12 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Micro dissecting needle holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Vise</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">2 fine tweezers + 1 rough tweezers</td>
			<td></td>
			<td align="left">Dumont #5, Biology&#160;</td>
			<td align="left">0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Stereoscopic zoom Microscope&#160;</td>
			<td align="left">Nikon</td>
			<td align="left">SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Cold light source</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">KL1500 LCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter (Color) for cold light source</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">RG620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Delicate wipers</td>
			<td align="left">Kimtech</td>
			<td></td>
			<td align="left">Kimwipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Electrode holder</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td align="left">QSW-T10P</td>
			<td align="left">Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Silver Wire</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td align="left">0.25 mm diameter, needs to be chloridized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">MP 85</td>
			<td align="left">Huxley-Wall Style Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Faraday cage</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td align="left">Electromagnetic noise shielding and black front curtain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Anti-vibration Table</td>
			<td align="left">Newport</td>
			<td align="left">VW-3036-OPT-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Osilloscope</td>
			<td align="left">GW</td>
			<td align="left">GOS-622G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Perfusion system</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td align="left">VC-8P</td>
			<td align="left">Pinch valve control system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Perfusion valve controller</td>
			<td align="left">Scientific instruments</td>
			<td align="left">BPS-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td align="left" height="20" style="height:20px;">Suction system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Amplifier</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">Axopatch-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Head-stage</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">CV - 4</td>
			<td align="left">Gain: x 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">A/D converter</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Clampex</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td dir="LTR">10</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">pCLAMP</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td>10</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light source (Xenon Arc lamp)</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">Lambda LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light detector</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td align="left">phototransistor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter wheel and shutter controller</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filters (Natural density filter)</td>
			<td align="left">Chroma</td>
			<td align="left">6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter (Color)</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">OG590, Edge filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Xenon Flash Lamp system</td>
			<td align="left">Dr. Rapp OptoElecftronic</td>
			<td align="left">JML-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light guide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Quartz&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Pulse generator</td>
			<td align="left">AMPI</td>
			<td align="left">Master 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td align="left">Olympus</td>
			<td align="left">IX71, Inverted</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Red illumination filter (Microscope)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">RG630 / RG645 &#248;45mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Microscope objective</td>
			<td align="left">Olympus</td>
			<td align="left">X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">CCD Camera</td>
			<td align="left">Andor</td>
			<td align="left">iXon DU885K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">NIS Element&#160;</td>
			<td align="left">Nikon</td>
			<td align="left">AR</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td align="left" height="24" style="height:24px;">Ca+2 indicator</td>
			<td align="left">Invitrogen</td>
			<td align="left">Calcium green 5N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Excitation &#38; emission filters and dichroic mirror</td>
			<td align="left">Chroma</td>
			<td align="left">19002 - AT - GFP/FITC Longpass set</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Vertical pipette puller</td>
			<td align="left">Narishige&#160;</td>
			<td align="left">Model PP83</td>
			<td align="left">Use either vertical or horizontal puller, as preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Horizontal pipette puller</td>
			<td align="left">Sutter Instrument&#160;</td>
			<td align="left">Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filament</td>
			<td align="left">Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td align="left">3 mm trough or square box</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Capillaries</td>
			<td align="left">Harvard Apparatus</td>
			<td align="left">borosilicate glass capillaries</td>
			<td align="left">1 x 0.58 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors

Whole-cell voltage voltage opnames van Drosophila melanogaster photoreceptors hebben het gebied van de invertebrate visuele transductie, waardoor het gebruik van D. melanogaster moleculaire genetica inositol-lipid signalering en transient receptor receptor potentiële (TRP) kanalen op het single-molecuul niveau kunnen onderzoeken. Een handvol labs hebben deze krachtige techniek beheerd, waardoor de fysiologische responsen op licht onder zeer gecontroleerde omstandigheden kunnen worden geanalyseerd. Deze techniek zorgt voor controle over de intracellulaire en extracellulaire media; De membraanspanning; En de snelle toepassing van farmacologische verbindingen, zoals een verscheidenheid aan ionische of pH-indicatoren, op de intra- en extracellulaire media. Met een uitzonderlijk hoge signaal-ruisverhouding kan deze methode de meting van donkere spontane en licht geïnduceerde eenheidstromen ( dwz spontane en kwantumstoten) en macroscopische licht-geïnduceerde stromingen (LIC) van de zondeGle D. melanogaster fotoreceptoren. Dit protocol schetst in groot detail alle belangrijke stappen die nodig zijn om deze techniek uit te voeren, die zowel elektrofysiologische als optische opnamen omvat. De procedure voor de retina dissectie voor het bereiken van intacte en levensvatbare ex vivo geïsoleerde ommatidia in de badkamer wordt beschreven. De apparatuur die nodig is voor het uitvoeren van full-cell en fluorescentie beeldvorming metingen zijn ook gedetailleerd. Tenslotte worden de valkuilen in het gebruik van deze delicate voorbereiding tijdens uitgebreide experimenten toegelicht.

De beschreven methode heeft de nauwkeurige registratie van de fundamentele eenheidstromen mogelijk die spontane en lichtgemaakte kwantumstoten genereren, die de macroscopische respons op licht produceren onder bepaalde omstandigheden. Het liet ook de vergelijking tussen wildtype en mutantvliegen toe die defecten hebben in kritische signaalmoleculen ( figuren 3 en 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Bovendien bleek het vermogen om terugkeerpotentieel te meten onder biionische omstandigheden de fundamentele biofysische eigenschappen van de TRP- en TRP-achtige (TRPL) kanalen 18 , 19 . Het zorgde ook voor de meting van de effecten van aminozuur substituties in het poriëngebied van TRP dat zijn Ca 2+ veranderdeDoorlaatbaarheid 20 . Het lichte antwoord verkregen door patchclamp-heel-cel opnames hangt lineair af van de lichtintensiteit voor ten minste 4 grootteordeningen. Dit kan niet opgelost worden door gebruik te maken van ERG- en intracellulaire opnamemethoden. Bijgevolg bleek een reeks reacties op korte flitsen van toenemende intensiteit en een plot van de intensiteitsresponsfunctie een strikte lineariteit van de flitsrespons met toenemende lichtintensiteit. De strikte lineariteit duurt tenminste een paar honderd pA, maar het is debatbaar of er vervolgens lineariteit of klemregeling is die afbreekt ( figuur 6 ). Deze resultaten suggereren dat de macroscopische reacties op het licht een lineaire opsomming zijn van de unitaire responsen op licht ( dwz kwantumstoten). Het is goed gevestigd met behulp van spanningsopnames die dim stimulatie indemenUces discrete spanningsfluctuaties ( dwz kwantumstoten) bij de meeste ongewervelde soorten. De D. melanogaster quantum bumps komen uit de gecoördineerde opening van ~ 15 TRP kanalen en ~ 2 TRPL kanalen op de top van de bump 18 . Elke stoot wordt gegenereerd door de opname van een enkel foton, terwijl de macroscopische respons op meer intense lichten de summatie van deze elementaire reacties 14 , 21 is . De hobbels variëren aanzienlijk in latentie, tijdcursus en amplitude, zelfs wanneer de stimulusomstandigheden identiek zijn. Bumpgeneratie is een stochastisch proces dat wordt beschreven door Poisson-statistieken, waarbij elke effectief geabsorbeerde foton slechts één bult uitstraalt. De single-foton-single-bump relatie vereist dat elke stap in de cascade niet alleen een efficiënt &quot;turn-on&quot; -mechanisme bevat, maar ook een even effectief &quot;uitschakel&quot; -mechanisme. Het functionele voordeel is de productie van aZeer gevoelige fotonenteller met een snelle transiënte respons, zeer geschikt voor zowel de gevoeligheid als de tijdelijke resolutie die door het visuele systeem nodig is. De eis voor een efficiënt uitschakelmechanisme wordt aangetoond wanneer het actieve fotopigment ( dat wil zeggen metarhodopsin, M) of het doel ervan, de G q α, niet inactivert en leidt tot de voortdurende productie van bultjes lang nadat het licht is uitgeschakeld ( figuur 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 . De bump vertegenwoordigt de coöperatieve activiteit van de TRP / TRPL kanalen in een microvillus. Als zodanig moet elke hypothese van kanaalactivatie ook coöperatieve kanaalactivering verklaren. Recentelijk hebben Hardie en collega&#39;s aangetoond dat licht een snelle samentrekking van de fotoreceptoren oproept, wat suggereert dat de lichtgevoeligeE kanalen (TRP / TRPL) kunnen mechanisch gated zijn 25 . Deze mechanische activatie, samen met de waargenomen protonen die door PLC-gemedieerde PIP 2- hydrolyse worden vrijgegeven, bevorderen de opening van de TRP / TRPL kanalen en verklaren de coöperatieve aard van de bumpproductie 26 . Momenteel zijn D. melanogaster fotoreceptoren een van de weinige systemen waarin fosfoinositide signalering en TRP kanalen in vivo kunnen worden bestudeerd , waardoor D. melanogaster phototransduction en de methodologie ontwikkeld om dit mechanisme een zeer waardevol model systeem te bestuderen. <img alt="Figuur 3" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig3.jpg" /> Figuur 3: De inaC P209 en inaD P215 Mutanten onthullen Slow Response Beëindiging van het Macroscopische Respons op Licht en van de Single Quantum Bumps. ( A ) De geïsoleerde ommatidiumprepaRantsoen met een patchpipet gevuld met fluorescerende Lucifer Yellow CH kleurstof (excitatie: 430 nm, emissie: 540 nm) wordt gepresenteerd tijdens een volledige opname van een cel. Merk op dat de fluorescerende kleurstof een enkel fotoreceptor cellichaam verspreidde en gemerkt heeft en dat de fotoreceptor cellichamen los zijn van hun langwerpige axonen, maar toch levensvatbaarheid behouden. Dit preparaat is geschikt voor gelijktijdige full-cell opnames en imaging experimenten. ( BD ) Bovenste panelen: Geheel-spanningsklemmen kwantumbumpreacties op continu dimlicht (open staaf) in WT, inaC P209 en inaD P215 mutantvliegen . Een langzame beëindiging van de stoten wordt waargenomen in inaC P209 en inaD P215 mutanten ten opzichte van WT vliegen. De onderstaande inzet toont de vergrote vorm van enkele stoten. Bodempanelen: Genormaliseerde macroscopische reacties van hele cellen op een 500-ms lichtpuls (1,5 x 10 5 fotonen per s) van de bovengenoemde wildtype<html> En mutante vliegen. (EG) Bovenste panelen: Volle celspanningsklemmen kwantumbotsreacties op een korte (1 ms) dimlichtende single-foton respons in wildtype, arr2 3 en ninaC P235 mutantvliegen . Let op de treinstoot waargenomen in arr2 3 en ninaC P235 mutantvliegen als reactie op een enkele fotonabsorptie. Onderpanelen: Volkscelspanning klemde genormaliseerde reacties op een 500 ms lichtpuls (1,5 x 104 fotonen / s) in de overeenkomstige mutanten. Let op de langzame beëindiging van de macroscopische reacties waargenomen in arr2 3 En ninaC P235 mutant vliegen ten opzichte van WT. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> D / 55627 / 55627fig4.jpg &quot;/&gt; Figuur 4: Cellulaire Ca 2+ Dynamica Na aanleiding van door de signaal geïnduceerde Ca 2+ Influx wordt beïnvloed door Calphotin. Een tijdreeks van fotoreceptorbeelden van wildtype en Cpn 1% vliegen die de fluorescentie van de Ca 2+ -indicator tonen tijdens lichtstimulatie. Ruwintensiteitbeelden worden getekend met behulp van valse kleurcodering (bar = 10 μm; pijlpunten geven de pipet aan). Figuur herdrukt met toestemming van Weiss et al. 4 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 5" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig5.jpg" /> Figuur 5: De elektrofysiologische eigenschappen van WT-, trp- en trpl-mutanten. ( A ) Whole-cell voltage clamp recoRdings van quantum bumps in reactie op continu dim light (open bar) in WT, trpl 302 en trp P343 null mutant vliegen. Zeer verminderde amplitude van trp P34 3 stoten worden waargenomen. Inset: Vergrote single quantum bumps van wildtype en trp P343 null mutant vliegen worden getoond. ( B ) Whole-cell voltage clamp opnames in reactie op een 3 s lichtpuls van wildtype en de overeenkomstige mutanten. De transiënte steady state reactie van de trp P343 mutant wordt waargenomen . Inset: Vergrote lichte responsen van WT en trp P343 mutant worden getoond. ( C ) Een familie van overbelichte lichtgeïnduceerde stromingen van de bovengenoemde vliegstammen, opgewekt als reactie op een 20 ms lichtpuls, bij spanningsstappen van 3 mV, gemeten rond de omkeerpotentiaal (E rev ). ( D ) Een histogram dat de gemiddelde E rev van wildtype en de verschillende mutan plottets. De foutbalken zijn de SEM De omkeerpotentieel (E rev ) van WT ligt tussen de positieve E rev van trpl 302 , die alleen TRP uitmaakt en de E rev van de trp P343 null mutant, die alleen TRPL uitmaakt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <img alt="Figuur 6" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig6.jpg" /> Figuur 6: De flitsrespons is strikt lineair met toenemende lichtintensiteit. Een reeks actuele reacties op korte flitsen van toenemende lichtintensiteit en een plot van de afhankelijkheid van de piekamplitude van het lichtrespons op de toenemende intensiteit van korte lichtflitsen. Deze relatie laat een strikte lineariteit zien tussen de flitsrespons en de toenemende lichtintensiteit. Deze strenge lineariteitBevat tenminste een paar honderd pA, met lichtintensiteit die meer dan 4 orders van grootte overschrijdt, terwijl het debat kan zijn of het lineariteit of de klemregeling daaruit is. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een ​​grotere versie van deze figuur te bekijken.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7,15 (pas met NaOH) </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Concentratie (mM) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> proline </td><td> 25 </td></tr><tr><td> alanine </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> Bewaren bij -20 ° C. </td></tr><tr><td colspan= &quot;2&quot;&gt; Opmerking: Deze oplossing is nominaal Ca 2+ vrij, maar heeft geen Ca 2+ buffers toegevoegd en heeft derhalve ongeveer 5 - 10 μM trace Ca 2+ . Extracellulaire oplossing (ES) = ES-0Ca 2+ met 1,5 mM CaCl2, gemaakt door CaCl2 toe te voegen uit een 0,5 of 1 M voorraadoplossing aan ES-0Ca 2+ . </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Ca +2- vrije extracellulaire oplossing (ES). Chemische beschrijving en de specifieke hoeveelheden die nodig zijn om Ca +2 -vrij ES te produceren. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Bedrag </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> sucrose </td><td> 1,5 g </td></tr><tr><td colspan="2"> Verdeel in 150 μl porties in 1,5 ml flacons en sla het op -20 76; C. </td></tr><tr><td> Trituratieoplossing (TS) </td><td> Vul 1 injectieflacon met 150 ml voorraadoplossing met 1,350 ml ES of ES-0Ca 2+ , om de oplossing te gebruiken die tijdens de dissectie wordt gebruikt. </td></tr></tbody></table> Tabel 2: Fetische Bovine Serum (FBS) + Sucrose - Voorraadoplossing. Chemische beschrijving en de specifieke hoeveelheden die nodig zijn voor het produceren van foetale boviene serum (FBS) + sucrose-voorraadoplossing. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15 (pas bij KOH) </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Concentratie (mM) </td></tr><tr><td> Kaliumgluconaat (Kglu) </td><td> 140 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATP magnesiumzout (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTP natriumzout (Na2 GTP) </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Β-Nicotinamide-adenine-dinucleotidehydraat (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> Bewaren bij -20 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabel 3: Intracellulaire Oplossing (IS1). Chemische beschrijving en de specifieke hoeveelheden die nodig zijn voor het produceren van IS1, die voornamelijk wordt gebruikt voor intensiteitsrespons en kwantumbumpmetingen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7,15 (pas bij CsOH) </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Concentratie (mM) </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATP magnesiumzout (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTP natriumzout (Na2 GTP) </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Β-Nicotinamide-adenine-dinucleotidehydraat (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tetraethyl-ammoniumchloride (TAE) </td><td> 15 </td></tr><tr><td></td><td> Bewaren bij -20 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabel 4: Intracellulaire Oplossing (IS2). Chemische omschrijving en de specifieke hoeveelheden die nodig zijn om intracellulaire oplossing IS2 te produceren, die voornamelijk gebruikt wordt voor omkerende potentiële metingen van de licht geïnduceerde stroom.

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors at JoVE.com

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Whole-cell opnames van Drosophila melanogaster fotoreceptoren maken het mogelijk om spontaan donkere stoten, kwantumstoten, macroscopische reacties op licht en spanningsrelaties onder verschillende omstandigheden te meten. In combinatie met D. melanogaster genetische manipulatie instrumenten, deze methode maakt het mogelijk om de alomtegenwoordige inositol-lipide signalering weg en zijn doel, het TRP kanaal te onderzoeken.

Elektrofysiologische methode voor opname van volledige spanningsklemmen van<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Elektrofysiologische opnames van de Giant Fiber Pathway van D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Gelijktijdige Whole-cell Opnames van Photoreceptors en Tweede-orde neuronen In amfibievliegtuig netvlies Slice Voorbereiding

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Whole Cell Patch Clamp voor Onderzoek naar de mechanismen van Infrarood Neural Stimulatie

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Patch Clamp Recordings van embryonale zebravis Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

Elektrofysiologische Opnemen vanaf<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Proef sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Whole-cell patch-clamp opnamen van Morphologically- en neurochemisch-geïdentificeerde hippocampus Interneurons

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Gepaarde Whole Cell Opnamen in Organotypische hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elektrofysiologische en morfologische analyse van neuronale Microschake in Acute Brain Slices Met behulp Paired Patch-Clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp opnamen in Brain Slices

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Elektrofysiologische Methode voor opname intracellulaire Voltage Reacties van<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreceptoren en Interneurons naar Light Stimuli<em&gt; In Vivo</em