Name: electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors
Uploaded: 2017-06-13T13:00:00
Duration: 10 min 36 s
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Der experimentelle Teil dieser Forschung wurde durch Stipendien der US-Israel Bi National Science Foundation (BM und IL), der Israel Science Foundation (ISF), der Deutsch-Israelischen Projektkooperation (DIP) (bis BM) und der Biotechnologie unterstützt Und Biological Sciences Research Council (BBSRC Grant Zahlen: BB / M007006 / 1 und BB / D007585 / 1) zu RCH

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	<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recordings+of+the+light+induced+current+in+dissociated+Drosophila+photoreceptors:+evidence+for+feedback+by+calcium+permeating+the+light-sensitive+channels.">Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).</li><li>Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+mutant+defective+in+extracellular+calcium-+dependent+photoreceptor+deactivation+and+rapid+desensitization.">A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization.</a> Nature. 354, 230-232 (1991).</li><li>Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calphotin:+a+Drosophila+photoreceptor+cell+calcium-binding+protein.">Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+and+Ca2++buffering+are+essential+for+prevention+of+light-induced+retinal+degeneration.">Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration.</a> J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation,+adaptation,+and+cell+survival+functions+of+the+Na+++/Ca+2++exchanger+CalX.">Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX.</a> Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).</li><li>Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-activated+potassium+channels+in+blowfly+photoreceptors+and+their+role+in+light+adaptation.">Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation.</a> J. Physiol. Lond. 440, (1991).</li><li>Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+blue-+and+green-sensitive+photoreceptors+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus.">Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).</li><li>Nasi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+clamp+of+dissociated+photoreceptors+from+the+eye+of+Lima+scabra.">Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra.</a> J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).</li><li>Nasi, E., Gomez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+ion+channels+in+solitary+photoreceptors+of+the+scallop+Pecten+irradians.">Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians.</a> J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).</li><li>Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+2++limits+the+development+of+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors.">Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+photon+responses+in+Drosophila+photoreceptors+and+their+regulation+by+Ca+2.">Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2.</a> J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).</li><li>Scott, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Drosophila+phototransduction+cascade+into+a+signalling+complex+shapes+elementary+responses.">Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses.</a> Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).</li><li>Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+of+G+betae+over+G+qalphae+in+vivo+prevents+dark,+spontaneous+activity+of+Drosophila+photoreceptors.">Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors.</a> J. 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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+the+Drosophila+light-sensitive+channels,+TRP+and+TRPL.">In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL.</a> Neuron. 19, 1249-1259 (1997).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+and+manipulation+of+the+Ca+2++selectivity+filter+in+the+Drosophila+transient+receptor+potential+channel.">In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel.</a> J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).</li><li>Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+bovine+rhodopsin+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).</li><li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo.">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+2++-dependent+metarhodopsin+inactivation+mediated+by+calmodulin+and+NINAC+myosin+III.">Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III.</a> Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).</li><li>Cook, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C+and+termination+of+G-protein-mediated+signalling+in+vivo.">Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo.</a> Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).</li><li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors.">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors.">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).</li><li>Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+light-induce+response+of+the+central+retinular+cells+from+the+electroretinogram+of+Drosophila.">Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila.</a> J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trp+gene+is+essential+for+a+light-activated+Ca2++channel+in+Drosophila+photoreceptors.">The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 8, 643-651 (1992).</li><li>Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+light-activated+conductance+is+composed+of+the+two+channels+TRP+and+TRPL.">The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL.</a> Cell. 85 (5), 651-659 (1996).</li><li>Huber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transient+receptor+potential+protein+(Trp),+a+putative+store-+operated+Ca+2++channel+essential+for+phosphoinositide-mediated+photoreception,+forms+a+signaling+complex+with+NorpA,+InaC+and+InaD.">The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD.</a> EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).</li><li>Shieh, B. H., Niemeyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+protein+encoded+by+the+InaD+gene+regulates+recovery+of+visual+transduction+in+Drosophila.">A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila.</a> Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).</li><li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade.">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li><li>Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+transform+glucose+to+alanine,+which+fuels+the+neurons+in+the+honeybee+retina.">Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina.</a> J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+activation+of+light-sensitive+channels+in+Drosophila+photoreceptors.">Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors.</a> J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).</li><li>Agam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+stress+reversibly+activates+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL+in+vivo.">Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo.</a> J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).</li><li>Agam, K., Frechter, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Drosophila+TRP+and+TRPL+channels+requires+both+Ca2++and+protein+dephosphorylation.">Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation.</a> Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).</li><li>Delgado, R., Mu&#241;oz, Y., Pe&#241;a-Cort&#233;s, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors.">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li><li>Parnas, M., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+channel+block+by+Ca2++underlies+the+voltage+dependence+of+Drosophila+TRPL+channel.">Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Die Anwendung von Ganzzell-Aufnahmen auf D. melanogaster Photorezeptoren erlaubte die Entdeckung und die funktionelle Aufklärung von neuartigen Signalproteinen wie TRP-Kanälen 27 , 28 , 29 und INAD 30 , 31 , 32 Gerüstprotein. Seit der ersten Einführung dieser Technik ermöglichte es die Auflösung von langfristigen Grundfragen bezüglich des Ionenmechanismus und der Spannungsabhängigkeit der Lichtreaktion. Dies geschah aufgrund der verliehenen Fähigkeit, die Membranspannung und die extrazelluläre und intrazelluläre ionische Zusammensetzung 19 , 28 genau zu steuern. Ein großes Hindernis der Patch-Clamping-Technik in D. melanogaster war die Zerbrechlichkeit der isolierten ommatidia prepaRation. Detaillierte Untersuchungen haben ergeben, dass die Integrität der Phototransduktionsmaschinen kritisch von der kontinuierlichen Versorgung von ATP abhängt, insbesondere bei der Belichtung, was zu einem großen Verbrauch an ATP führt. Leider beseitigt die mechanische Streifenung der Pigment- ( dh Glia) -Zellen, die mit der Patchpipette zur Photorezeptormembran gelangen muss, die Hauptquelle der für die ATP-Produktion notwendigen Metaboliten 33 . Die Anwendung von exogenem ATP in die Aufzeichnungspipette erfüllt nur teilweise die Forderung nach großen Mengen an ATP. Eine kurze Versorgung mit ATP führt zu einer spontanen Aktivierung der TRP-Kanäle und zur Dissoziation der Phototransduktionsmaschinerie aus den lichtaktivierten Kanälen, was zu einer starken Zunahme des zellulären Ca 2+ und der Abschaffung der normalen Reaktion auf das Licht 34 , 35 führt . Diese Folge von Ereignissen ist nicht auf Schäden an derPhotorezeptoren durch das Sektionsverfahren, sondern vielmehr die zelluläre Erschöpfung von ATP. Um zu verhindern, dass diese Folge von Ereignissen auftritt und normale Lichtreaktionen aufrechterhalten wird, sollten die Photorezeptoren nicht intensiven Lichtern ausgesetzt werden, die große Mengen an ATP verbrauchen. Auch muss NAD in die Aufzeichnungspipette aufgenommen werden, vermutlich um die ATP-Produktion in den Mitochondrien 18 , 36 zu erleichtern. Für Messungen von Spontan- und Quantenstößen ist die obige Schwierigkeit minimal, da nur schwache Lichter verwendet werden. In der Praxis kann eine stabile Ganzzell-Aufzeichnung für ~ 20-25 min aufrechterhalten werden, obwohl es eine Tendenz gibt, dass die Reaktionskinetik über diesen Zeitraum verlangsamt wird. Eine einmalige Vorbereitung der dissoziierten Ommatidien kann bis zu 2 h lebensfähig bleiben. Ein zusätzliches Manko der isolierten Ommatidienpräparation ist die Unzugänglichkeit der Mikrovilli, was auf die Unzugänglichkeit der TRP undTRPL-Kanäle zur Aufzeichnungspipette, die Einkanal-Aufnahmen verhindern. Mit einer von ihnen entwickelten Methode gelang es Bacigalupo und Kollegen, die Einkanal-Aktivität aus dem Rhabdomere direkt zu erfassen 37 . Jedoch unterscheidet sich diese Kanalaktivität von der von TRPL-Kanälen, die heterolog in den Gewebekulturzellen 38 exprimiert wurden, und von der TRP-Kanalaktivität, die aus der aus der isolierten Omatidia 34 erhaltenen Schussgeräuschanalyse abgeleitet ist. Vermutlich hat das Dissektionsverfahren die Photorezeptorzellen bei der Verwendung dieses Verfahrens stark beschädigt.

Umfangreiche genetische Untersuchungen der Fruchtfliege , Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , die vor mehr als 100 Jahren initiiert wurde, haben die D. melanogaster- Fliege als äußerst nützliches experimentelles Modell für die genetische Dissektion komplexer biologischer Prozesse etabliert. Die unten beschriebene Methodik kombiniert die akkumulierte Kraft von D. melanogaster Molekulargenetik mit dem hohen Signal-Rausch-Verhältnis von Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen. Diese Kombination ermöglicht die Untersuchung von D. melanogaster Phototransduktion als Modell der Inositol-Lipid-Signalisierung und TRP-Kanalregulation und -aktivierung sowohl in der nativen Umgebung als auch in der höchsten Auflösung einzelner Moleküle. Die Anwendung der Ganzzell-Aufzeichnungsmethode auf D. melanogaster Photorezeptoren hat das Studium der Wirbellosen-Phototransduktion revolutioniert. Diese Methode wurde von Hardie 1 und indep entwickeltEndlich von Ranganathan und Kollegen vor 2 ~ 26 Jahren und wurde entworfen, um die umfangreichen genetischen Manipulationswerkzeuge von D. melanogaster auszunutzen und sie zu verwenden, um Mechanismen der Phototransduktion und Inositol-Lipid-Signalisierung aufzudecken. Zunächst litt diese Technik unter einer raschen Verringerung der Lichtempfindlichkeit und einer geringen Ausbeute an Ommatidien während des Sektionsprozesses, die detaillierte quantitative Studien verhinderten. Später erhöhte die Zugabe von ATP und NAD zur Patchpipette die Eignung der Präparation für längere quantitative Aufnahmen drastisch. Danach wurde eine umfangreiche Charakterisierung des Signaltransduktionsmechanismus auf molekularer Ebene realisiert. Derzeit ist die D. melanogaster- Phototransduktion eines der wenigen Systeme, in denen Phosphoinositid-Signalisierungs- und TRP-Kanäle ex-vivo bei Einzelmolekül-Auflösung untersucht werden können. Das macht D. melanogaster fototransduktion und das ichThodologie entwickelt, um diesen Mechanismus ein hochempfindliches Modellsystem zu studieren. Dieses Protokoll beschreibt, wie man die D. melanogaster retina seziert und die isolierten Ommatidien mechanisch von den umgebenden Pigment (Glia) Zellen abstreift. Dies ermöglicht die Bildung einer Giga-Dichtung und einer Ganzzell-Patch-Clamp auf den Photorezeptor-Zellkörpern. Glücklicherweise sind die meisten Signalisierungsproteine ​​auf das Rhabdomere beschränkt und diffundieren nicht. Darüber hinaus gibt es einen immobilen Ca 2+ -Puffer namens Calphotin, der sich zwischen dem Signalisierungskompartiment und dem Zellkörper 3 , 4 befindet , und einem hohen Expressionsniveau des Na + / Ca 2+ -Tauscher (CalX) im Mikrovilli 5 . Gemeinsam erlauben die Protein-Confinement zum Rhabdomere, der Calphotin-Puffer und die hohe Expression des CalX relativ lange ( dh bis zu ~ 20 min) Ganzzell-Aufnahmen ohne den Verlust wesentlicher KomponentenDes Phototransduktionsverfahrens und unter Beibehaltung einer hohen Lichtempfindlichkeit. Das folgende Protokoll beschreibt, wie man isolierte Omatidien erhält und ganze Zellaufnahmen durchführt, die die nativen Eigenschaften der Phototransduktionskaskade bewahren. Vollständige Patch-Clamp-Experimente auf dissoziierten Kakerlaken ( Periplaneta americana ) 6 und Cricket ( Gryllus bimaculatus ) 7 Ommatidien wurden ähnlich wie bei D. melanogaster durchgeführt . Darüber hinaus wurden Patch-Clamp-Experimente an dissoziierten Photorezeptoren der File-Clam, ( Lima scabra ) und Jakobsmuschel ( Pecten-Irradianer ) in einer etwas anderen Weise als die von D. melanogaster durchgeführt , wobei sowohl die Ganzzell- 8- als auch die Einkanal-Messungen durchgeführt wurden 9 Hier werden die wichtigsten Errungenschaften, die in D. melanogaster mit dieser Technik erhalten wurden, beschrieben. Die Diskussion iSchließt die Beschreibung einiger Fallstricke und Einschränkungen dieser Technik ein.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1363">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:292px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:508px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">5 ml syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">1 ml syringe with elongated tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Silicone dissection dish/block</td>
			<td align="left">Dow Corning</td>
			<td align="left">Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td align="left">Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60&#7506;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Syringe filters</td>
			<td align="left">Millex</td>
			<td></td>
			<td align="left">22 &#181;m PVDF filter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Capillaries (for omatidia separation)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Polyethylene Tubing</td>
			<td align="left">Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td align="left">1.57 x 1.14 mm (35 cm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">&#160;2 small beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">50 ml or less</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">2 paraffin film sheets</td>
			<td align="left">Parafilm M</td>
			<td></td>
			<td align="left">~5 x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Bath chamber</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Cover slips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">22 x 22 mm No. 0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Paraplast Plus</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td align="left">Paraffin &#8211; polyisobutylene mixture</td>
			<td align="left">To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Ground</td>
			<td align="left">Warner Instruments&#160;</td>
			<td align="left">64-1288</td>
			<td align="left">Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Headless micro dissection needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Entomology, 12 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Micro dissecting needle holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Vise</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">2 fine tweezers + 1 rough tweezers</td>
			<td></td>
			<td align="left">Dumont #5, Biology&#160;</td>
			<td align="left">0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Stereoscopic zoom Microscope&#160;</td>
			<td align="left">Nikon</td>
			<td align="left">SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Cold light source</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">KL1500 LCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter (Color) for cold light source</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">RG620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Delicate wipers</td>
			<td align="left">Kimtech</td>
			<td></td>
			<td align="left">Kimwipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Electrode holder</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td align="left">QSW-T10P</td>
			<td align="left">Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Silver Wire</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td align="left">0.25 mm diameter, needs to be chloridized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">MP 85</td>
			<td align="left">Huxley-Wall Style Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Faraday cage</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td align="left">Electromagnetic noise shielding and black front curtain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Anti-vibration Table</td>
			<td align="left">Newport</td>
			<td align="left">VW-3036-OPT-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Osilloscope</td>
			<td align="left">GW</td>
			<td align="left">GOS-622G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Perfusion system</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td align="left">VC-8P</td>
			<td align="left">Pinch valve control system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Perfusion valve controller</td>
			<td align="left">Scientific instruments</td>
			<td align="left">BPS-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td align="left" height="20" style="height:20px;">Suction system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Amplifier</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">Axopatch-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Head-stage</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">CV - 4</td>
			<td align="left">Gain: x 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">A/D converter</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Clampex</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td dir="LTR">10</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">pCLAMP</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td>10</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light source (Xenon Arc lamp)</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">Lambda LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light detector</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td align="left">phototransistor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter wheel and shutter controller</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filters (Natural density filter)</td>
			<td align="left">Chroma</td>
			<td align="left">6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter (Color)</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">OG590, Edge filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Xenon Flash Lamp system</td>
			<td align="left">Dr. Rapp OptoElecftronic</td>
			<td align="left">JML-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light guide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Quartz&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Pulse generator</td>
			<td align="left">AMPI</td>
			<td align="left">Master 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td align="left">Olympus</td>
			<td align="left">IX71, Inverted</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Red illumination filter (Microscope)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">RG630 / RG645 &#248;45mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Microscope objective</td>
			<td align="left">Olympus</td>
			<td align="left">X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">CCD Camera</td>
			<td align="left">Andor</td>
			<td align="left">iXon DU885K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">NIS Element&#160;</td>
			<td align="left">Nikon</td>
			<td align="left">AR</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td align="left" height="24" style="height:24px;">Ca+2 indicator</td>
			<td align="left">Invitrogen</td>
			<td align="left">Calcium green 5N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Excitation &#38; emission filters and dichroic mirror</td>
			<td align="left">Chroma</td>
			<td align="left">19002 - AT - GFP/FITC Longpass set</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Vertical pipette puller</td>
			<td align="left">Narishige&#160;</td>
			<td align="left">Model PP83</td>
			<td align="left">Use either vertical or horizontal puller, as preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Horizontal pipette puller</td>
			<td align="left">Sutter Instrument&#160;</td>
			<td align="left">Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filament</td>
			<td align="left">Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td align="left">3 mm trough or square box</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Capillaries</td>
			<td align="left">Harvard Apparatus</td>
			<td align="left">borosilicate glass capillaries</td>
			<td align="left">1 x 0.58 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors

Ganzzellige Spannungsklemmenaufnahmen von Drosophila melanogaster Photorezeptoren haben das Feld der wirbellosen visuellen Transduktion revolutioniert, was die Verwendung von D. melanogaster Molekulargenetik ermöglicht, um Inositol-Lipid-Signalisierung und Transient Receptor Potential (TRP) -Kanäle auf Einzelmolekül-Ebene zu untersuchen. Eine Handvoll Labore haben diese mächtige Technik beherrscht, die es ermöglicht, die physiologischen Reaktionen unter stark kontrollierten Bedingungen zu beleuchten. Diese Technik ermöglicht die Kontrolle über die intrazellulären und extrazellulären Medien; Die Membranspannung; Und die schnelle Anwendung von pharmakologischen Verbindungen, wie einer Vielzahl von Ionen- oder pH-Indikatoren, auf die intra- und extrazellulären Medien. Mit einem außergewöhnlich hohen Signal-Rausch-Verhältnis ermöglicht dieses Verfahren die Messung von dunklen spontanen und lichtinduzierten Einheitsströmen ( zB Spontan- und Quantenstößen) und makroskopischen Lichtinduzierten Strömen (LIC) aus der SündeGle D. melanogaster photorezeptoren Dieses Protokoll skizziert im Detail alle wichtigen Schritte, die notwendig sind, um diese Technik durchzuführen, die sowohl elektrophysiologische als auch optische Aufnahmen beinhaltet. Das Fliegen-Retina-Dissektionsverfahren für die Erreichung von intakten und lebensfähigen ex vivo- isolierten Omatidien in der Badkammer wird beschrieben. Die Ausrüstung, die für die Durchführung von Ganzzell- und Fluoreszenz-Bildgebungsmessungen erforderlich ist, ist ebenfalls detailliert. Schließlich werden die Fallstricke bei der Verwendung dieser zarten Vorbereitung bei längeren Experimenten erklärt.

Das beschriebene Verfahren ermöglichte die genaue Aufzeichnung der fundamentalen Einheitsströme, die spontane und licht evozierte Quantenhöcker erzeugen, die die makroskopische Antwort auf Licht unter definierten Bedingungen erzeugen. Es erlaubte auch den Vergleich zwischen Wildtyp- und Mutantenfliegen, die Defekte in kritischen Signalmolekülen aufweisen ( Fig. 3 und 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Darüber hinaus zeigte die Fähigkeit, das Umkehrpotential unter bi-ionischen Bedingungen zu messen, grundlegende biophysikalische Eigenschaften der TRP- und TRP-ähnlichen (TRPL) Kanäle 18 , 19 . Es ermöglichte auch die Messung der Wirkungen von Aminosäuresubstitutionen in der Porenregion von TRP, die ihr Ca 2+ modifiziertenDurchlässigkeit 20 Die durch Patch-Clamp-Ganzzell-Aufnahmen erhaltene Lichtreaktion hängt linear von der Lichtintensität für mindestens 4 Größenordnungen ab. Dies konnte nicht durch die Verwendung von ERG- und intrazellulären Aufzeichnungsverfahren behoben werden. Dementsprechend zeigte eine Reihe von Antworten auf kurze Blitze mit zunehmender Intensität und einer Auftragung der Intensitätsantwortfunktion eine strenge Linearität der Blitzreaktion mit zunehmender Lichtintensität. Die strenge Linearität hält bis zu mindestens einigen hundert pA, aber es ist umstritten, ob es danach Linearität oder Klemmsteuerung ist, die bricht (Abbildung 6 ). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass die makroskopischen Reaktionen auf Licht eine lineare Summierung der unitären Reaktionen auf Licht ( dh Quantenstöße) sind. Es wurde gut etabliert unter Verwendung von Spannungsaufzeichnungen, die Licht Stimulation indUces diskrete Spannungsschwankungen ( dh Quantenstöße) bei den meisten wirbellosen Arten. Die M. melanogaster Quantenbumps ergeben sich aus der konzertierten Öffnung von ~ 15 TRP Kanälen und ~ 2 TRPL Kanälen am Höhepunkt der Bump 18 . Jeder Stoß wird durch die Absorption eines einzelnen Photons erzeugt, während die makroskopische Reaktion auf intensivere Lichter die Summierung dieser elementaren Reaktionen 14 , 21 ist . Die Stöße variieren in Latenzzeit, Zeitverlauf und Amplitude, auch wenn die Stimulusbedingungen identisch sind. Die Bump-Generation ist ein stochastischer Prozess, der von der Poisson-Statistik beschrieben wird, wobei jedes effektiv absorbierte Photon nur einen Bump auslöst. Die Single-Photon-Single-Bump-Beziehung erfordert, dass jeder Schritt in der Kaskade nicht nur einen effizienten &quot;Turn-On&quot; -Mechanismus beinhaltet, sondern auch einen ebenso effektiven &quot;Abschalt&quot; -Mechanismus. Der funktionale Vorteil ist die Produktion vonSehr empfindlicher Photonenzähler mit einer schnellen Transientenreaktion, die sehr gut für die Empfindlichkeit und die zeitliche Auflösung des visuellen Systems geeignet ist. Die Anforderung an einen effizienten Abschaltmechanismus zeigt sich, wenn entweder das aktive Photopigment ( dh Metarhodopsin, M) oder sein Ziel, das G q α, nicht inaktiviert und zur kontinuierlichen Produktion von Stößen führt, lange nachdem das Licht ausgeschaltet ist ( Abb 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 . Der Stoß stellt die kooperative Aktivität der TRP / TRPL-Kanäle in einem Mikrovillus dar. Als solche sollte jede Hypothese der Kanalaktivierung auch die Kooperationskanalaktivierung erklären. Vor kurzem haben Hardie und Kollegen gezeigt, dass Licht rasche Kontraktionen der Photorezeptoren hervorruft, was darauf hindeutet, dass das lichtempfindlicheE Kanäle (TRP / TRPL) können mechanisch gated werden 25 . Diese mechanische Aktivierung, zusammen mit den beobachteten Protonen, die durch PLC-vermittelte PIP 2- Hydrolyse freigesetzt werden, fördern die Öffnung der TRP / TRPL-Kanäle und erklären die Kooperationsart der Bump-Produktion 26 . Derzeit sind D. melanogaster Photorezeptoren eines der wenigen Systeme, in denen Phosphoinositide Signaling und TRP Kanäle in vivo untersucht werden können, so dass D. melanogaster Phototransduktion und die Methodik entwickelt, um diesen Mechanismus ein sehr wertvolles Modell-System zu studieren. <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig3.jpg" /> Abbildung 3: Die inaC P209 und inaD P215 Mutanten zeigen die langsame Reaktion Beenden der makroskopischen Reaktion auf Licht und der einzelnen Quantenhöcker. ( A ) Die isolierte Ommatidium prepaRation mit einer Patchpipette, gefüllt mit fluoreszierendem Lucifer Yellow CH-Farbstoff (Anregung: 430 nm, Emission: 540 nm) wird während einer Ganzzell-Aufzeichnung präsentiert. Man beachte, daß der Fluoreszenzfarbstoff diffundiert und einen einzelnen Photorezeptorzellkörper markiert ist und daß die Photorezeptorzellkörper von ihren langgestreckten Axonen abgelöst werden, aber dennoch die Lebensfähigkeit beibehalten. Diese Vorbereitung eignet sich für gleichzeitige Ganzzell-Aufnahmen und Imaging-Experimente. ( BD ) Obere Panels: Ganzzellige Spannung geklemmte Quanten-Bump-Reaktionen auf kontinuierliches Dämmerlicht (offener Stab) in WT, InaC P209 und InaD P215 Mutantenfliegen . Eine langsame Beendigung der Beulen wird bei inaC P209 und inaD P215- Mutanten relativ zu WT-Fliegen beobachtet . Die Einfügung unten zeigt die vergrößerte Form der einzelnen Stöße. Bodenpaneele: Normalisierte Ganzzell-aufgezeichnete makroskopische Reaktionen auf einen 500-ms-Lichtpuls (1,5 x 10 5 Photonen pro s) des obigen Wildtyps<html> Und mutierte Fliegen. (EG) Obere Panels: Ganzzellige Spannung geklemmte Quanten-Bump-Reaktionen auf ein kurzes (1 ms), schwaches Licht, das Einzelphotonenantworten in Wildtyp-, arr2 3- und ninaC P235-Mutantenfliegen auslöst . Beachten Sie den Zug der in arr2 3 und ninaC P235 beobachteten Bumps in Reaktion auf eine einzelne Photonenabsorption. Bodenplatten: Ganzzellige Spannung klemmte normalisierte Reaktionen auf einen 500 ms Lichtimpuls (1,5 x 10 4 Photonen / s) in den entsprechenden Mutanten. Beachten Sie die langsame Beendigung der makroskopischen Reaktionen, die in arr2 3 beobachtet wurden Und NinaC P235 Mutante fliegt relativ zu WT. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> D / 55627 / 55627fig4.jpg &quot;/&gt; Abbildung 4: Zelluläre Ca 2+ -Dynamik nach dem signalinduzierten Ca 2+ -Influx wird von Calphotin beeinflusst. Eine Zeitreihe von Photorezeptor-Bildern von Wildtyp- und Cpn- 1% -Flügen, die die Fluoreszenz des Ca 2+ -Analys während der Lichtstimulation zeigen. Rohfarbbilder werden mit Falschfarbenkodierung aufgetragen (bar = 10 μm, Pfeilspitzen geben die Pipette an). Bild nachgedruckt mit Genehmigung von Weiss et al. 4 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig5.jpg" /> Abbildung 5: Die elektrophysiologischen Eigenschaften von WT, trp und trpl Mutanten. ( A ) Ganzzellspannungsklemme recoRings von Quantenstößen in Reaktion auf kontinuierliches schwaches Licht (offener Stab) in WT, trpl 302 und trp P343 Nullmutantenfliegen. Es werden sehr reduzierte Amplituden von trp P34 3 Beulen beobachtet. Inset: Vergrößerte Einzelquantenstöße von Wildtyp und trp P343 null Mutantenfliegen werden gezeigt. ( B ) Ganzzellige Spannungsklemmenaufnahmen in Reaktion auf einen 3 s Lichtpuls des Wildtyps und die entsprechenden Mutanten. Die transiente stationäre Reaktion der trp- P343- Mutante wird beobachtet. Inset: Vergrößerte Lichtreaktionen von WT und trp P343 Mutanten werden gezeigt. ( C ) Eine Familie von überlagerten lichtinduzierten Strömen der obigen Fliegendehnungen, die in Reaktion auf einen 20 ms-Lichtimpuls bei Spannungsschritten von 3 mV, gemessen um das Umkehrpotential (E rev ), hervorgerufen wurden. ( D ) Ein Histogramm, das die mittlere E rev des Wildtyps und die verschiedenen Mutanen darstelltTs Die Fehlerbalken sind die SEM Das Umkehrpotential (E rev ) von WT liegt zwischen dem positiven E rev von trpl 302 , das nur TRP exprimiert, und die E rev der trp P343 Nullmutante, die nur TRPL ausdrückt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig6.jpg" /> Abbildung 6: Die Flash-Antwort ist streng linear mit zunehmender Lichtintensität. Eine Reihe von aktuellen Reaktionen auf kurze Blitze der zunehmenden Lichtintensität und eine Auftragung der Abhängigkeit der Spitzenamplitude der Lichtreaktion auf die zunehmende Intensität der kurzen Lichtblitze blinkt. Diese Beziehung zeigt eine strikte Linearität zwischen der Blitzreaktion und der zunehmenden Lichtintensität. Diese strenge LinearitätBis zu mindestens einigen hundert pA, mit Lichtintensität über 4 Größenordnungen, während es umstritten ist, ob es Linearität oder die Klemmensteuerung ist, die danach zerbricht. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> PH-Wert </td><td> 7.15 (mit NaOH einstellen) </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Konzentration (mM) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgCl &amp; sub2 ; </td><td> 4 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Proline </td><td> 25 </td></tr><tr><td> Alanin </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> Bei -20 ° C aufbewahren. </td></tr><tr><td colspan= &quot;2&quot;&gt; Hinweis: Diese Lösung ist nominell Ca 2+ frei, hat aber keine Ca 2+ Puffer und wird daher ca. 5 - 10 μM Trace Ca 2+ haben . Extrazelluläre Lösung (ES) = ES-0Ca 2+ mit 1,5 mM CaCl 2 , hergestellt durch Zugabe von CaCl 2 aus einer 0,5 oder 1 M Stammlösung zu ES-0Ca 2+ . </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Ca + 2 -freie extrazelluläre Lösung (ES). Chemische Beschreibung und die spezifischen Mengen, die zur Herstellung von Ca +2- freie ES erforderlich sind. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> Menge </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> Saccharose </td><td> 1,5 g </td></tr><tr><td colspan="2"> In 150 μl Aliquots in 1,5 mL Fläschchen teilen und bei -20 lagern 76; </td></tr><tr><td> Triturierungslösung (TS) </td><td> Füllen Sie 1 Durchstechflasche mit 150 ml der Stammlösung mit 1.350 ml ES oder ES-0Ca 2+ , um die bei der Dissektion verwendete Lösung zu erfüllen. </td></tr></tbody></table> Tabelle 2: Fetales Rinderserum (FBS) + Saccharose - Lagerlösung. Chemische Beschreibung und die spezifischen Mengen, die zur Herstellung von fötalem Rinderserum (FBS) + Saccharose - Stammlösung erforderlich sind. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> PH-Wert </td><td> 7.15 (mit KOH einstellen) </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Konzentration (mM) </td></tr><tr><td> Kaliumglukonat (Kglu) </td><td> 140 </td></tr><tr><td> MgCl &amp; sub2 ; </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATP-Magnesiumsalz (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTP-Natriumsalz (Na 2 GTP) </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> Β-Nicotinamid-adenindinucleotidhydrat (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> Bei -20 ° C aufbewahren. </td></tr></tbody></table> Tabelle 3: Intrazelluläre Lösung (IS1). Chemische Beschreibung und die spezifischen Mengen, die zur Herstellung von IS1 erforderlich sind, die meist für Intensitätsreaktionen und Quantenstoßmessungen verwendet werden. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> PH-Wert </td><td> 7.15 (mit CsOH einstellen) </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Konzentration (mM) </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> MgCl &amp; sub2 ; </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATP-Magnesiumsalz (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTP-Natriumsalz (Na 2 GTP) </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> Β-Nicotinamid-adenindinucleotidhydrat (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tetra-ethylammoniumchlorid (TAE) </td><td> 15 </td></tr><tr><td></td><td> Bei -20 ° C aufbewahren. </td></tr></tbody></table> Tabelle 4: Intrazelluläre Lösung (IS2). Chemische Beschreibung und die spezifischen Mengen, die zur Herstellung der intrazellulären Lösung IS2 erforderlich sind, die meistens für Umkehrpotentialmessungen des lichtinduzierten Stroms verwendet wird.

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Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Ganzzellige Aufnahmen von Drosophila Melanogaster Photorezeptoren ermöglichen die Messung von spontanen Dunkelstößen, Quantenstößen, makroskopischen Reaktionen auf Licht und Strom-Spannungs-Beziehungen unter verschiedenen Bedingungen. In Kombination mit D. melanogaster genetischen Manipulationswerkzeugen ermöglicht diese Methode die Untersuchung des ubiquitären Inositol-Lipid-Signalwegs und seines Ziels, des TRP-Kanals.

Elektrophysiologische Methode für Ganzzell-Spannungsklemmen Aufnahmen von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Elektrophysiologischen Ableitungen aus dem Riesen-Fiber Pathway der D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Forschung

Neurowissenschaften

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Gleichzeitige Ganzzellableitungen von Photorezeptoren und Neuronen zweiter Ordnung in eine Amphibie Retinal Scheibe Vorbereitung

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Whole Cell Patch-Clamp für erforschen die Mechanismen der Infrarot Neural Stimulation

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Patch-Clamp-Aufnahmen aus embryonalen Zebrafisch-Mauthner-Zellen

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

Elektrophysiologische Aufnehmen von<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Geschmack Sensillen

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen aus Morphologically- und neurochemisch identifizierten Hippocampus Inter

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Gepaart ganze Zelle Recordings in Organotypische Hippocampus

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elektrophysiologische und morphologische Charakterisierung neuronaler Schaltkreise in akuten Hirnschnitten Mit Paired-Patch-Clamp-Aufnahmen

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Whole-Cell-Patch-Clamp-Aufnahmen in Hirnschnitten

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Elektrophysiologische Verfahren zur Aufzeichnung von intrazellulärer Spannung Antworten von<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorezeptoren und Inter auf Lichtreize<em&gt; In Vivo</em