Name: electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors
Uploaded: 2017-06-13T13:00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors at JoVE.com

החלק הניסויי של מחקר זה נתמך על ידי מענקים מהקרן הלאומית למדע של ארה&quot;ב-ישראל (ל- BM ו- IL), לקרן המדע הישראלי (ISF), ל- Deutsch-Israelische Projektkooperation (ל- BM) ולביוטכנולוגיה ואת המועצה למדעי הביולוגיה מחקר (BBSRC גרנט מספרים: BB / M007006 / 1 ו BB / D007585 / 1) כדי RCH

<ol>
	<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recordings+of+the+light+induced+current+in+dissociated+Drosophila+photoreceptors:+evidence+for+feedback+by+calcium+permeating+the+light-sensitive+channels.">Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).</li><li>Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+mutant+defective+in+extracellular+calcium-+dependent+photoreceptor+deactivation+and+rapid+desensitization.">A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization.</a> Nature. 354, 230-232 (1991).</li><li>Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calphotin:+a+Drosophila+photoreceptor+cell+calcium-binding+protein.">Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+and+Ca2++buffering+are+essential+for+prevention+of+light-induced+retinal+degeneration.">Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration.</a> J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation,+adaptation,+and+cell+survival+functions+of+the+Na+++/Ca+2++exchanger+CalX.">Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX.</a> Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).</li><li>Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-activated+potassium+channels+in+blowfly+photoreceptors+and+their+role+in+light+adaptation.">Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation.</a> J. Physiol. Lond. 440, (1991).</li><li>Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+blue-+and+green-sensitive+photoreceptors+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus.">Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).</li><li>Nasi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+clamp+of+dissociated+photoreceptors+from+the+eye+of+Lima+scabra.">Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra.</a> J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).</li><li>Nasi, E., Gomez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+ion+channels+in+solitary+photoreceptors+of+the+scallop+Pecten+irradians.">Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians.</a> J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).</li><li>Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+2++limits+the+development+of+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors.">Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).</li><li>Kohn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Cooperation+between+the+IP3+Receptor+and+Phospholipase+C+Secures+the+High+Sensitivity+to+Light+of+Drosophila+Photoreceptors+In+Vivo.">Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo.</a> J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).</li><li>Hevers, W., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+modulates+the+voltage+dependence+of+delayed+rectifier+and+Shaker+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors.">Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+photon+responses+in+Drosophila+photoreceptors+and+their+regulation+by+Ca+2.">Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2.</a> J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).</li><li>Scott, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Drosophila+phototransduction+cascade+into+a+signalling+complex+shapes+elementary+responses.">Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses.</a> Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).</li><li>Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+of+G+betae+over+G+qalphae+in+vivo+prevents+dark,+spontaneous+activity+of+Drosophila+photoreceptors.">Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors.</a> J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).</li><li>Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C-Mediated+Suppression+of+Dark+Noise+Enables+Single-Photon+Detection+in+Drosophila+Photoreceptors.">Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).</li><li>Hardie, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+amplification+in+Drosophila+phototransduction.+Roles+for+G+protein,+phospholipase+C,+and+diacylglycerol+kinase.">Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase.</a> Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).</li><li>Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+the+Drosophila+light-sensitive+channels,+TRP+and+TRPL.">In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL.</a> Neuron. 19, 1249-1259 (1997).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+and+manipulation+of+the+Ca+2++selectivity+filter+in+the+Drosophila+transient+receptor+potential+channel.">In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel.</a> J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).</li><li>Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+bovine+rhodopsin+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).</li><li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo.">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+2++-dependent+metarhodopsin+inactivation+mediated+by+calmodulin+and+NINAC+myosin+III.">Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III.</a> Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).</li><li>Cook, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C+and+termination+of+G-protein-mediated+signalling+in+vivo.">Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo.</a> Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).</li><li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors.">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors.">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).</li><li>Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+light-induce+response+of+the+central+retinular+cells+from+the+electroretinogram+of+Drosophila.">Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila.</a> J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trp+gene+is+essential+for+a+light-activated+Ca2++channel+in+Drosophila+photoreceptors.">The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 8, 643-651 (1992).</li><li>Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+light-activated+conductance+is+composed+of+the+two+channels+TRP+and+TRPL.">The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL.</a> Cell. 85 (5), 651-659 (1996).</li><li>Huber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transient+receptor+potential+protein+(Trp),+a+putative+store-+operated+Ca+2++channel+essential+for+phosphoinositide-mediated+photoreception,+forms+a+signaling+complex+with+NorpA,+InaC+and+InaD.">The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD.</a> EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).</li><li>Shieh, B. H., Niemeyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+protein+encoded+by+the+InaD+gene+regulates+recovery+of+visual+transduction+in+Drosophila.">A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila.</a> Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).</li><li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade.">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li><li>Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+transform+glucose+to+alanine,+which+fuels+the+neurons+in+the+honeybee+retina.">Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina.</a> J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+activation+of+light-sensitive+channels+in+Drosophila+photoreceptors.">Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors.</a> J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).</li><li>Agam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+stress+reversibly+activates+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL+in+vivo.">Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo.</a> J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).</li><li>Agam, K., Frechter, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Drosophila+TRP+and+TRPL+channels+requires+both+Ca2++and+protein+dephosphorylation.">Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation.</a> Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).</li><li>Delgado, R., Mu&#241;oz, Y., Pe&#241;a-Cort&#233;s, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors.">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li><li>Parnas, M., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+channel+block+by+Ca2++underlies+the+voltage+dependence+of+Drosophila+TRPL+channel.">Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).</li></ol>

למחברים אין מה לחשוף.

היישום של כל תא הקלטות ד מלנוגאסטור photoreceptors מותר גילוי ופונקציונציה תפקודית של חלבונים איתות חדשניים, כגון ערוצי TRP 27 , 28 , 29 ו INAD 30 , 31 , 32 פיגום חלבון. מאז הכניסה הראשונית של טכניקה זו, היא אפשרה את הפתרון של שאלות בסיסיות לטווח ארוך לגבי המנגנון היוני תלות מתח התגובה האור. זה קרה בגלל היכולת להעניק יכולת במדויק את המתח קרום תאיים תאיים הרכב תאיים 19 , 28 . המכשול העיקרי של הטכניקה מהדק תיקון ב מלנוגאסטר כבר את השבריריות של מבודד ommatidia prepaמָנָה. מחקרים מפורטים גילו כי שלמות של מכונות phototransduction ביקורתית תלויה באספקה ​​מתמשכת של ATP, במיוחד במהלך החשיפה לאור, אשר מוביל לצריכה גדולה של ה- ATP. למרבה הצער, פסים מכניים של פיגמנט ( כלומר גליה) תאים, אשר נדרש להגיע קרום photoreceptor עם פיפטה תיקון, מבטלת את המקור העיקרי של מטבוליטים הדרושים לייצור ATP 33 . יישום של ATP אקסוגני לתוך פיפטה ההקלטה רק חלקית ממלא את הדרישה עבור כמויות גדולות של ATP. אספקת קצר של ATP מוביל הפעלה ספונטנית של ערוצי TRP כדי ניתוק של מכונות phototransduction מן האור מופעל ערוצים, גרימת עלייה גדולה של Ca 2 + הסלולר וביטול התגובה הרגילה לאור 34 , 35 . רצף אירועים זה אינו נובע מנזקPhotoreceptors על ידי הליך לנתיחה, אלא כדי דלדול הסלולר של ה- ATP. כדי למנוע רצף אירועים זה להתרחש ולשמור על תגובות אור נורמלי, photoreceptors לא צריך להיות חשוף אורות אינטנסיביים, אשר צורכים כמויות גדולות של ה- ATP. כמו כן, NAD חייב להיכלל פיפטה ההקלטה, ככל הנראה כדי להקל על הייצור ATP במיטוכונדריה 18 , 36 . עבור מדידות של ספונטני ומכשולים קוונטיים, הקושי הנ&quot;ל הוא מינימלי כי רק אורות עמומים משמשים. בפועל, הקלטה כל תא יציב יכול להישמר ~ 20-25 דקות, אם כי יש נטייה קינטיקה התגובה להאט לאורך תקופה זו. הכנה אחת של ommatidia ניתק עשוי להישאר קיימא עד 2 שעות. חסרון נוסף של הכנת אומטידיה מבודדת הוא הנגישות של microvilli, אשר מתרגמת את הנגישות של TRP וTRPL ערוצים הקלטה פיפטה, מניעת הקלטות ערוץ יחיד. באמצעות שיטה שפותחה, הצליחו Bacigalupo ועמיתיו להקליט באופן ישיר פעילות ערוץ יחיד מ 37 rhabdomere. עם זאת, פעילות ערוץ זה שונה מזה של ערוצים TRPL הביע heterologously בתרבית רקמות תאים 38 ו מפעילות ערוץ TRP נגזר ניתוח רעש ירו המתקבל ommatidia מבודד 34 . יש להניח, הליך לנתיחה פגום מאוד תאים photoreceptor בעת שימוש בשיטה זו.

מחקרים גנטיים נרחבים של זבוב הפירות, תסיסנית מלנוגאסטר ( ד מלנוגאסטאר) , שיזמה לפני יותר מ -100 שנה, הקימו את זבוב המלנוגאסטר ד &#39;כמודל ניסיוני שימושי ביותר עבור הניתוח הגנטי של תהליכים ביולוגיים מורכבים. המתודולוגיה המתוארת להלן משלבת את הכוח המצטבר של גנטיקה מולנוגאסטארית מולקולרית עם היחס בין אות לרעש גבוה של קליפ שלם של קליפים. שילוב זה מאפשר את המחקר של dot melanogaster phototransduction כמודל של inositol- ליפידים איתות ו TRP ערוץ הרגולציה והפעלה, הן בסביבה יליד ברזולוציה הגבוהה ביותר של מולקולות בודדות. יישום של שיטת הקלטה של ​​כל התא כדי dor melanogaster photoreceptors חוללה מהפכה במחקר של phototransduction חוליות. שיטה זו פותחה על ידי הארדי 1 ו indepבסופו של דבר על ידי Ranganathan ועמיתיו 2 ~ 26 שנים, והוא נועד לנצל את כלי מניפולציה גנטית נרחב של ד melanogaster ולהשתמש בהם כדי לחשוף מנגנונים של phototransduction ו inositol- ליפידים איתות. בתחילה, טכניקה זו סבלה מהורדה מהירה ברגישות לאור ותשואה נמוכה של אומטידיה במהלך תהליך הניתוח, אשר מנע מחקרים כמותיים מפורטים. מאוחר יותר, תוספת של ATP ו NAD כדי פיפטה תיקון להגדיל באופן דרמטי את ההתאמה של ההכנות הקלטות כמותיות ממושכות. לאחר מכן, אפיון נרחב של מנגנון התמרת האות ברמה המולקולרית מומש. נכון לעכשיו, dot melanogaster phototransduction היא אחת המערכות כמה שבו איתות phosphoinositide ו TRP ערוצים ניתן ללמוד vivo לשעבר ברזולוציה מולקולה אחת. זה עושה ד melanogaster phototransduction ואת ליתיאודולוגיה שפותחה כדי ללמוד מנגנון זה מודל רגיש מאוד. פרוטוקול זה מתאר כיצד לנתח את הרשתית מלנוגאסטר ד ו מכנית רצועת ommatidia מבודדים מן הפיגמנט (תאים) גליל. זה מאפשר את היווצרות של ג &#39;יגה חותם ואת מהדק תיקון כל תא על גופי התא photoreceptor. למרבה המזל, רוב חלבונים איתות מוגבל ל rhabdomere ולא לפזר. בנוסף, יש חיץ Ca 2 + נייח קרא calphotin, הממוקם בין תא איתות לגוף התא 3 , 4 , ואת רמת ביטוי גבוהה של Na + / Ca 2 + מחליף (CalX) ב microvilli 5 . יחד, את החלבון חלבון rhabdomere, המאגר calphotin, ואת הביטוי הגבוה של CalX לאפשר יחסית ממושכת ( כלומר עד 20 דקות) כל התא הקלטות, ללא אובדן של רכיבים חיונייםשל תהליך phototransduction תוך שמירה על רגישות גבוהה לאור. הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להשיג ommatidia מבודד ולבצע הקלטות תא שלם שנראה לשמור על המאפיינים הילידים של מפל phototransduction. כל תא תיקון ניסויים מהדק על מקק מנותק ( Periplaneta אמריקה ) 6 ו קריקט ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia בוצעו באופן דומה לזה המתואר עבור ד melanogaster . בנוסף, תיקון ניסויים מהדק על photoreceptors ניתק של צדפות הקובץ, ( סקלה לימה ) ו סקאלופ ( פקטן irradians ) בוצעו בצורה שונה במקצת מזו שנערכה על ד melanogaster , המאפשר מדידות 8 ו-כל ערוץ יחיד 9 . הנה, את ההישגים העיקריים שהושגו ד melanogaster באמצעות טכניקה זו מתוארים. הדיון אכולל את התיאור של כמה מלכודות ומגבלות של טכניקה זו.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1363">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:292px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:508px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">5 ml syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">1 ml syringe with elongated tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Silicone dissection dish/block</td>
			<td align="left">Dow Corning</td>
			<td align="left">Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td align="left">Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60&#7506;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Syringe filters</td>
			<td align="left">Millex</td>
			<td></td>
			<td align="left">22 &#181;m PVDF filter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Capillaries (for omatidia separation)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Polyethylene Tubing</td>
			<td align="left">Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td align="left">1.57 x 1.14 mm (35 cm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">&#160;2 small beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">50 ml or less</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">2 paraffin film sheets</td>
			<td align="left">Parafilm M</td>
			<td></td>
			<td align="left">~5 x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Bath chamber</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Cover slips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">22 x 22 mm No. 0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Paraplast Plus</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td align="left">Paraffin &#8211; polyisobutylene mixture</td>
			<td align="left">To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Ground</td>
			<td align="left">Warner Instruments&#160;</td>
			<td align="left">64-1288</td>
			<td align="left">Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Headless micro dissection needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Entomology, 12 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Micro dissecting needle holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Vise</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">2 fine tweezers + 1 rough tweezers</td>
			<td></td>
			<td align="left">Dumont #5, Biology&#160;</td>
			<td align="left">0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Stereoscopic zoom Microscope&#160;</td>
			<td align="left">Nikon</td>
			<td align="left">SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Cold light source</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">KL1500 LCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter (Color) for cold light source</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">RG620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Delicate wipers</td>
			<td align="left">Kimtech</td>
			<td></td>
			<td align="left">Kimwipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Electrode holder</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td align="left">QSW-T10P</td>
			<td align="left">Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Silver Wire</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td align="left">0.25 mm diameter, needs to be chloridized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">MP 85</td>
			<td align="left">Huxley-Wall Style Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Faraday cage</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td align="left">Electromagnetic noise shielding and black front curtain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Anti-vibration Table</td>
			<td align="left">Newport</td>
			<td align="left">VW-3036-OPT-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Osilloscope</td>
			<td align="left">GW</td>
			<td align="left">GOS-622G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Perfusion system</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td align="left">VC-8P</td>
			<td align="left">Pinch valve control system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Perfusion valve controller</td>
			<td align="left">Scientific instruments</td>
			<td align="left">BPS-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td align="left" height="20" style="height:20px;">Suction system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Amplifier</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">Axopatch-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Head-stage</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">CV - 4</td>
			<td align="left">Gain: x 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">A/D converter</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Clampex</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td dir="LTR">10</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">pCLAMP</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td>10</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light source (Xenon Arc lamp)</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">Lambda LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light detector</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td align="left">phototransistor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter wheel and shutter controller</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filters (Natural density filter)</td>
			<td align="left">Chroma</td>
			<td align="left">6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter (Color)</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">OG590, Edge filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Xenon Flash Lamp system</td>
			<td align="left">Dr. Rapp OptoElecftronic</td>
			<td align="left">JML-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light guide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Quartz&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Pulse generator</td>
			<td align="left">AMPI</td>
			<td align="left">Master 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td align="left">Olympus</td>
			<td align="left">IX71, Inverted</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Red illumination filter (Microscope)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">RG630 / RG645 &#248;45mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Microscope objective</td>
			<td align="left">Olympus</td>
			<td align="left">X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">CCD Camera</td>
			<td align="left">Andor</td>
			<td align="left">iXon DU885K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">NIS Element&#160;</td>
			<td align="left">Nikon</td>
			<td align="left">AR</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td align="left" height="24" style="height:24px;">Ca+2 indicator</td>
			<td align="left">Invitrogen</td>
			<td align="left">Calcium green 5N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Excitation &#38; emission filters and dichroic mirror</td>
			<td align="left">Chroma</td>
			<td align="left">19002 - AT - GFP/FITC Longpass set</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Vertical pipette puller</td>
			<td align="left">Narishige&#160;</td>
			<td align="left">Model PP83</td>
			<td align="left">Use either vertical or horizontal puller, as preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Horizontal pipette puller</td>
			<td align="left">Sutter Instrument&#160;</td>
			<td align="left">Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filament</td>
			<td align="left">Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td align="left">3 mm trough or square box</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Capillaries</td>
			<td align="left">Harvard Apparatus</td>
			<td align="left">borosilicate glass capillaries</td>
			<td align="left">1 x 0.58 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors

כל מתח מתח clamp הקלטות מ תסיסנית melanogaster photoreceptors חוללו מהפכה בתחום transduction חזותית חוליות, המאפשר את השימוש של ד melanogaster מולקולרית גנטיקה ללמוד inositol- ליפידים איתות ו transient קולטן פוטנציאליים (TRP) ערוצים ברמת מולקולה אחת. קומץ מעבדות שולט בטכניקה חזקה זו, המאפשרת ניתוח של תגובות פיזיולוגיות לאור בתנאי מבוקר מאוד. טכניקה זו מאפשרת שליטה על התקשורת תאיים תאיים; מתח הקרום; ואת היישום המהיר של תרכובות פרמקולוגיות, כגון מגוון של אינדיקטורים יוניים או pH, על התקשורת תוך חוץ תאיים. עם יחס אות לרעש גבוה במיוחד, שיטה זו מאפשרת למדוד זרמים חד-ספריים כהים וספונטאניים ( כלומר, ספונטניות וקוונטיות) וזרמים בהזרקה מאקרוסקופית (LIC)Gle ד מלנוגאסטר photoreceptors. פרוטוקול זה מתאר, בפירוט רב, את כל הצעדים העיקריים הדרושים לביצוע טכניקה זו, הכוללת גם אלקטרו הקלטות אלקטרו אופטי. הליך לטיה רטייה זבוב להשגת vivo לשעבר שלם ושל קיימא ommatidia מבודדים בחדר אמבטיה מתואר. הציוד הדרוש כדי לבצע את כל התא פלואורסצנטי הדמיה מדידות מפורטים גם. לבסוף, את מלכודות באמצעות הכנה עדינה זו במהלך ניסויים מורחבים מוסברים.

השיטה המתוארת אפשרה את ההקלטה המדויקת של הזרמים האוניברסליים הבסיסיים המייצרים בליטות קוונטיות ספונטניות וקלות, אשר מסכמות את התגובה המאקרוסקופית לאור, בתנאים מוגדרים. היא גם אפשרה השוואה בין זבובים wildtype ו מוטציה כי יש פגמים במולקולות איתות קריטי ( תרשימים 3 ו - 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . בנוסף, היכולת למדוד פוטנציאל היפוך בתנאים דו-יוניים גילתה מאפיינים ביו-פיסיקליים בסיסיים של TRP ו- TRP (ערוצים) 18 , 19 . זה גם איפשר את המדידה של ההשפעות של חומצות אמינו תחליפים באזור הנקבוביות של TRP כי שונה Ca 2 + שלהחדירות 20 . התגובה האור המתקבל על ידי תיקון מהדק כל תא הקלטות תלוי ליניארי על עוצמת האור לפחות 4 סדרי גודל. זה לא יכול להיפתר באמצעות ERG ושיטות הקלטה תאיים. לפיכך, סדרה של תגובות על הבזקים קצרים של העוצמה הגוברת ומזימה של פונקציית התגובה האינטנסיבית חשפה ליניאריות קפדנית של תגובת הפלאש עם עוצמת האור הגוברת. הליניאריות הקפדנית מחזיקה עד לפחות כמה מאות pA, אך ניתן להתווכח אם לאחר מכן היא ליניארית או שליטה מהדק כי נשבר ( איור 6 ). תוצאות אלו מצביעות על כך שהתגובות המאקרוסקופיות לאור הן סיכום ליניארי של התגובות היחידות לאור ( כלומר, בליטות קוונטיות). היא כבר מבוססת היטב באמצעות הקלטות מתח כי אור עמום גירוי indUces תנודות מתח בדידים ( כלומר, הקוונטים bumps) ברוב המינים חסרי חוליות. D מלנוגאסטר הקוונטים bumps תוצאה של פתיחת מושרשת של ~ 15 ערוצים TRP ו ~ 2 TRPL ערוצי בשיא של גבשושית 18 . כל בליטה נוצרת על ידי ספיגתו של פוטון בודד, ואילו התגובה המקרוסקופית לאורות אינטנסיביים יותר היא סיכום של תגובות אלה היסודי 14 , 21 . הבליטות משתנות באופן משמעותי בזמן חביון, זמן ומשרעת, גם כאשר תנאי הגירוי זהים. דור הבליטה הוא תהליך סטוכסטי המתואר על ידי הסטטיסטיקה פואסון, לפיה כל פוטון נספג ביעילות מעורר רק מכה אחת. מערכת הפוטון החד-פעמית דורשת שכל צעד במפל כולל לא רק מנגנון &quot;הפעלה עצמית&quot; יעיל, אלא גם מנגנון &quot;כיבוי&quot; יעיל באותה מידה. היתרון הפונקציונאלי הוא ייצור שלמאוד פוטון רגיש עם תגובה מהירה חולף מתאים מאוד הן את הרגישות ואת הפתרון הזמני הנדרש על ידי מערכת חזותית. הדרישה למנגנון כיבוי יעיל מתגלה כאשר הפוטופיגמנט הפעיל ( כלומר metarhodopsin, M) או היעד שלו, ה- q α α, אינו מצליח להשבית ומוביל לייצור רציף של בליטות זמן רב לאחר כיבוי האור ( איור). 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 . הבליטה מייצגת את הפעילות השיתופית של ערוצי TRP / TRPL ב microvillus. ככזה, כל השערה של הפעלת ערוץ צריך גם להסביר הפעלה ערוץ שיתופית. לאחרונה, הרדי ועמיתיו הוכיחו כי האור מעורר התכווצויות מהירות של photoreceptors, מה שמרמז כי אור רגיש(TRP / TRPL) ניתן לנשל באופן מכני 25 . פעולה מכנית זו, יחד עם הפרוטונים שנצפו על ידי PLC- בתיווך PIP 2 הידרוליזה, לקדם את הפתיחה של ערוצי TRP / TRPL ולהסביר את האופי השיתופי של ייצור בליטה 26 . נכון לעכשיו, dore melanogaster photoreceptors הם אחד המעטים המערכות שבהן איתות phosphoinositide ו TRP ערוצים ניתן ללמוד in vivo , ובכך הפיכת dot melanogaster phototransduction ואת המתודולוגיה פיתחה ללמוד מנגנון זה מערכת מודל יקר מאוד. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig3.jpg" /> איור 3: inaC P209 ו inaD P215 מוטנטים לחשוף תגובה איטית סיום של תגובה מאקרוסקופית לאור של הבטן הקוונטית יחיד. ( א ) מבודד ommatidium prepaRation עם פיפטה תיקון מלא פלואורסצנטי לוציפר צבע צהוב CH (עירור: 430 ננומטר, פליטה: 540 ננומטר) מוצג במהלך הקלטה בתא שלם. שים לב כי צבע פלואורסצנטי diffused ו שכותרתו תא תא יחיד photoreceptor וכי גופי התא photoreceptor מנותקים מן האקסונים המוארכים שלהם, אך עדיין לשמור על הכדאיות. הכנה זו מתאימה להקלטות תא שלם בו זמנית וניסויי הדמיה. ( BD ) לוחות עליון: מתח של תא שלם הידק התגובות הקוונטית מכה הקפדה על אור עמום רציף (בר פתוח) ב WT, inaC P209 , ו inaD P215 זבובים מוטציה. סיומת איטית של בליטות נצפתה inaC P209 ו inaD P215 מוטציות יחסית זבובים WT. הבלעה להלן מציגה את הצורה המוגדלת של בליטות בודדות. פאנלים תחתונים: תגובות מנורמליות של כל התא שנרשמו בתא מקרוסקופי לדופק אור של 500 מילי-סיביות (1.5 x 10 5 פוטונים לכל ים) של wildtype לעיל<html> זבובים מוטנטים. (EG) פאנלים עליונים: מתח של תא שלם הידק התגובות קוונטית הקצבום קצר (1 MS), אור עמום מעוררים תגובות פוטון יחיד wildtype, arr2 3 , ו זנבות מוטציה ninaC P235 . הערה הרכבת של הבליטות שנצפו arr2 3 ו ניאנק P235 זבובים מוטציה בתגובה ספיגת פוטון בודד. פאנלים תחתונים: מתח של תא שלם הדביק תגובות מנורמל לדופק אור 500 מילישניות (1.5 x 10 4 פוטונים / ים) במוטנטים המתאימים. שים לב לסיום האיטי של התגובות המאקרוסקופיות שנצפו ב- arr2 3 ו ניאנק P235 זבובים מוטציה יחסית WT. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> D / 55627 / 55627fig4.jpg &quot;/&gt; איור 4: נייד Ca 2 + Dynamics בעקבות איתות המושרה Ca 2 + זרם מושפע על ידי Calphotin. סדרת זמן של תמונות photoreceptor של wildtype ו Cpn 1% זבובים מראה את הקרינה של מחוון Ca 2 + במהלך גירוי האור. תמונות בעוצמה גולמית הם זממו באמצעות שקר צבע קידוד (בר = 10 מיקרומטר, ראשי חצים מצביעים על פיפטה). איור הודפס באישור של Weiss et al. 4 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig5.jpg" /> איור 5: המאפיינים האלקטרוניים של WT, trp, ו trpl מוטציות. ( A ) מתח מלא מתח clo recoRdings של קוונטי bumps בתגובה אור עמום רציף (בר פתוח) ב WT, trpl 302 , ו trp P343 זבובים מוטנטים null. אמפליטודות מופחתות מאוד של trp P34 3 bumps הם נצפו. הבלעה: הגדלת בליטות קוונטיות יחיד של wildtype ו trp P343 זבובים מוטנטים n מוצגים. ( ב ) מתח תא מלא clamp הקלטות בתגובה לדופק אור 3 של wildtype ואת מוטציות המתאימים. התגובה הארעית של מצב קבוע של מוטציה P343 trp נצפתה. הבלעה: תגובות אור מוגדל של WT ו trp P343 מוטציה מוצגים. ( ג ) משפחה של זרמים אור המושרה האור של זנים לעיל זבוב, לעורר בתגובה לדופק אור 20 ms, על צעדים מתח של 3 mV, נמדד סביב פוטנציאל היפוך (E rev ). ( ד ) היסטוגרמה המתווימה את הרושם הממוצע של wildtype ואת המוטאנים השוניםTs. ברים שגיאה הם SEM פוטנציאל ההיפוך (E rev ) של WT הוא בין rev חיובי E של trpl 302 , אשר מבטא רק TRP, ואת E rev של טרפ P343 מוטציה trp , המבטא רק TRPL. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig6.jpg" /> איור 6: תגובה Flash היא ליניארית עם הגדלת עוצמת האור. סדרה של תגובות עכשוויות על הבזקים קצרים של עוצמת האור הגוברת ומזימה של התלות של משרעת שיא התגובה האור על העוצמה הגוברת של הבזקים אור קצר. מערכת יחסים זו חושפת ליניאריות קפדנית בין תגובת הפלאש לבין עוצמת האור הגוברת. ליניאריות קפדנית זומחזיק עד לפחות כמה מאות PAA, עם עוצמת אור פורש מעל 4 סדרי גודל, בעוד הוא שנוי במחלוקת אם זה ליניאריות או שליטה מהדק כי נשבר לאחר מכן. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> PH </td><td> 7.15 (להתאים עם NaOH) </td></tr><tr><td> מֵגִיב </td><td> ריכוז (mM) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> פרולין </td><td> 25 </td></tr><tr><td> אלנין </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> חנות ב -20 מעלות צלזיוס. </td></tr><tr><td colspan= &quot;2&quot;&gt; הערה: פתרון זה הוא nomineally Ca 2 + חינם אבל אין Ca 2 + מאגרים הוסיף ולכן יהיה בערך 5-10 מיקרומטר זכר Ca 2 + . פתרון תאיים (ES) = ES-0Ca 2 + עם 1.5 מ&quot;מ CaCl 2 , שנעשו על ידי הוספת CaCl 2 מ 0.5 או 1 M פתרון המניה ES-0Ca 2 + . </td></tr></tbody></table> טבלה 1: Ca +2 - פתרון תאיים חינם (ES). תיאור כימי ואת הכמויות הספציפיות הנדרשות כדי לייצר Ca +2 ללא תשלום ES. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> מֵגִיב </td><td> כמות </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 15 מ&quot;ל </td></tr><tr><td> סוכרוז </td><td> 1.5 גרם </td></tr><tr><td colspan="2"> מחלקים אל 150 aliquots μL ב 1.5 מ&quot;ל בקבוקונים לאחסן ב -20 76; C. </td></tr><tr><td> פתרון Trituration (TS) </td><td> מילוי 1 בקבוקון של 150 מ&quot;ל של פתרון המניות עם 1,350 מ&quot;ל ES או ES-0Ca 2 + , כדי להתאים את הפתרון המשמש במהלך לנתיחה. </td></tr></tbody></table> טבלה 2: סרום שור עוברית (FBS) + Sucrose - פתרון המניה. תיאור כימי ואת כמויות ספציפיות נדרש לייצר בסרום שור העובר (FBS) + סוכרוז - פתרון המניה. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> PH </td><td> 7.15 (כוונן עם KOH) </td></tr><tr><td> מֵגִיב </td><td> ריכוז (mM) </td></tr><tr><td> אשלגן gluconate (Kglu) </td><td> 140 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> מלח מגנזיום ATP (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> מלח נתרן GTP (Na 2 GTP) </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Β-Nicotinamide adenine דינוקליוטיד הידרט (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> חנות ב -20 מעלות צלזיוס. </td></tr></tbody></table> טבלה 3: פתרון תאיים (IS1). תיאור כימי ואת הכמויות הספציפיות הדרושות לייצור IS1, המשמש בעיקר לתגובה בעוצמה ומדידות הקוונטים. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> PH </td><td> 7.15 (התאם עם CsOH) </td></tr><tr><td> מֵגִיב </td><td> ריכוז (mM) </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> מלח מגנזיום ATP (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> מלח נתרן GTP (Na 2 GTP) </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Β-Nicotinamide adenine דינוקליוטיד הידרט (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> טטרה-אתיל-אמוניום כלורי (TAE) </td><td> 15 </td></tr><tr><td></td><td> חנות ב -20 מעלות צלזיוס. </td></tr></tbody></table> טבלה 4: פתרון תאיים (IS2). תיאור כימי ואת הכמויות הספציפיות הנדרשות כדי לייצר פתרון תאיים IS2, אשר משמש בעיקר עבור המדידות פוטנציאל היפוך של האור המושרה הנוכחי.

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors at JoVE.com

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

כל תא הקלטות של תסיסנית melanogaster photoreceptors לאפשר מדידה של ספונטני בליטות כהה, בליטות קוונטיות, תגובות מאקרוסקופיות לאור, ואת המתח הנוכחי היחסים בתנאים שונים. בשילוב עם ד melanogaster כלים מניפולציה גנטית, שיטה זו מאפשרת את המחקר של inositol- השומן ליפיד המסלול נתיב היעד שלה, ערוץ TRP.

שיטה אלקטרו-קולית לקולקציית מתח מלא<em&gt; תסיסנית</em&gt; פוטורספטורים

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

הקלטות אלקטרו מתוך מסלול של סיבים ענק ד melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

כל תא הקלטות בו זמנית מקולטני אור ועל נוירונים מסדר שני בהכנה פורסים רשתית אמפיבי

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

הצמד תיקון נייד לכל חוקר את המנגנונים של גירוי עצבי אינפרא אדום

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

תיקון הקלטות קלאמפ מתאים עוברי דג הזברה מאוטנר

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

הקלטת אלקטרו מ<em&gt; דרוזופילה</em&gt; Labellar טעם Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

הקלטות תיקון מהדק כל התא מMorphologically- וinterneurons היפוקמפוס זיהה Neurochemically

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

הקלטות תא כל לזווג בפרוסות בהיפוקמפוס Organotypic

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

אלקטרו ומורפולוגי אפיון של שבבים עצביים במוח חריף Slices שימוש מותאם Patch-קלאמפ הקלטות

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

הקלטות תיקון מהדק כל תא פרוסות המוח

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo