Name: electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors
Uploaded: 2017-06-13T13:00:00
Duration: 10 min 36 s
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La parte sperimentale di questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni della Bi-National Science Foundation USA-Israele (BM e IL), della Fondazione Israele della Scienza (ISF), della Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP) (a BM) e della Biotecnologie E il Consiglio di Ricerca delle Scienze Biologiche (BBSRC numeri di sovvenzione: BB / M007006 / 1 e BB / D007585 / 1) a RCH

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	<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recordings+of+the+light+induced+current+in+dissociated+Drosophila+photoreceptors:+evidence+for+feedback+by+calcium+permeating+the+light-sensitive+channels.">Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).</li><li>Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+mutant+defective+in+extracellular+calcium-+dependent+photoreceptor+deactivation+and+rapid+desensitization.">A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization.</a> Nature. 354, 230-232 (1991).</li><li>Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calphotin:+a+Drosophila+photoreceptor+cell+calcium-binding+protein.">Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+and+Ca2++buffering+are+essential+for+prevention+of+light-induced+retinal+degeneration.">Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration.</a> J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation,+adaptation,+and+cell+survival+functions+of+the+Na+++/Ca+2++exchanger+CalX.">Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX.</a> Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).</li><li>Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+ion+channels+in+solitary+photoreceptors+of+the+scallop+Pecten+irradians.">Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians.</a> J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).</li><li>Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+2++limits+the+development+of+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors.">Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. 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W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+photon+responses+in+Drosophila+photoreceptors+and+their+regulation+by+Ca+2.">Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2.</a> J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).</li><li>Scott, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Drosophila+phototransduction+cascade+into+a+signalling+complex+shapes+elementary+responses.">Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses.</a> Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).</li><li>Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+of+G+betae+over+G+qalphae+in+vivo+prevents+dark,+spontaneous+activity+of+Drosophila+photoreceptors.">Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors.</a> J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).</li><li>Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C-Mediated+Suppression+of+Dark+Noise+Enables+Single-Photon+Detection+in+Drosophila+Photoreceptors.">Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).</li><li>Hardie, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+amplification+in+Drosophila+phototransduction.+Roles+for+G+protein,+phospholipase+C,+and+diacylglycerol+kinase.">Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase.</a> Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).</li><li>Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+the+Drosophila+light-sensitive+channels,+TRP+and+TRPL.">In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL.</a> Neuron. 19, 1249-1259 (1997).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+and+manipulation+of+the+Ca+2++selectivity+filter+in+the+Drosophila+transient+receptor+potential+channel.">In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel.</a> J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).</li><li>Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+bovine+rhodopsin+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).</li><li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo.">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+2++-dependent+metarhodopsin+inactivation+mediated+by+calmodulin+and+NINAC+myosin+III.">Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III.</a> Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).</li><li>Cook, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C+and+termination+of+G-protein-mediated+signalling+in+vivo.">Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo.</a> Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).</li><li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors.">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors.">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).</li><li>Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+light-induce+response+of+the+central+retinular+cells+from+the+electroretinogram+of+Drosophila.">Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila.</a> J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trp+gene+is+essential+for+a+light-activated+Ca2++channel+in+Drosophila+photoreceptors.">The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 8, 643-651 (1992).</li><li>Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+light-activated+conductance+is+composed+of+the+two+channels+TRP+and+TRPL.">The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL.</a> Cell. 85 (5), 651-659 (1996).</li><li>Huber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transient+receptor+potential+protein+(Trp),+a+putative+store-+operated+Ca+2++channel+essential+for+phosphoinositide-mediated+photoreception,+forms+a+signaling+complex+with+NorpA,+InaC+and+InaD.">The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD.</a> EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).</li><li>Shieh, B. H., Niemeyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+protein+encoded+by+the+InaD+gene+regulates+recovery+of+visual+transduction+in+Drosophila.">A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila.</a> Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).</li><li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade.">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li><li>Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+transform+glucose+to+alanine,+which+fuels+the+neurons+in+the+honeybee+retina.">Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina.</a> J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+activation+of+light-sensitive+channels+in+Drosophila+photoreceptors.">Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors.</a> J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).</li><li>Agam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+stress+reversibly+activates+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL+in+vivo.">Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo.</a> J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).</li><li>Agam, K., Frechter, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Drosophila+TRP+and+TRPL+channels+requires+both+Ca2++and+protein+dephosphorylation.">Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation.</a> Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).</li><li>Delgado, R., Mu&#241;oz, Y., Pe&#241;a-Cort&#233;s, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors.">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li><li>Parnas, M., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+channel+block+by+Ca2++underlies+the+voltage+dependence+of+Drosophila+TRPL+channel.">Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).</li></ol>

Gli autori non hanno niente da rivelare.

L&#39;applicazione di registrazioni a cellule intere ai fotorecettori di D. melanogaster ha consentito la scoperta e la spiegazione funzionale di nuove proteine ​​di segnalazione, quali i canali TRP 27 , 28 , 29 e INAD 30 , 31 , 32 proteine ​​di scaffold. Fin dalla prima introduzione di questa tecnica, essa ha permesso di risolvere le questioni fondamentali a lungo termine relative al meccanismo ionico e alla dipendenza dalla tensione della risposta luminosa. Ciò si è verificato a causa della capacità conferita a controllare con precisione la tensione della membrana e la composizione ionica extracellulare e intracellulare 19 , 28 . Un grosso ostacolo della tecnica di bloccaggio della patch in D. melanogaster è stata la fragilità dell&#39;ommatidia prepara isolatarazione. Studi dettagliati hanno rivelato che l&#39;integrità delle macchine di fototransduzione dipende in modo critico dalla fornitura continua di ATP, soprattutto durante l&#39;esposizione alla luce, che porta ad un grande consumo di ATP. Purtroppo, la striscia meccanica delle cellule di pigmento ( cioè glia), necessaria per raggiungere la membrana fotorecettore con la pipetta patch, elimina la principale fonte di metaboliti necessari per la produzione di ATP 33 . L&#39;applicazione di ATP esogeno nella pipetta di registrazione soddisfa solo parzialmente l&#39;esigenza di grandi quantità di ATP. Una breve fornitura di ATP porta all&#39;attivazione spontanea dei canali TRP e alla dissociazione della macchina fototransducale dai canali attivati ​​a luce, provocando un notevole aumento della Ca 2+ cellulare e l&#39;abolizione della risposta normale alla luce 34 , 35 . Questa sequenza di eventi non è dovuta al danno delFotorecettori dalla procedura di dissezione, ma piuttosto all&#39;esaurimento cellulare di ATP. Per evitare che questa sequenza di eventi si verifichi e per mantenere le risposte luminose normali, i fotorecettori non devono essere esposti a luci intense, che consumano grandi quantità di ATP. Inoltre, NAD deve essere incluso nella pipetta di registrazione, presumibilmente per facilitare la produzione di ATP nei mitocondri 18 , 36 . Per le misurazioni degli urti spontanei e quantistici, la difficoltà di cui sopra è minima perché vengono utilizzate solo le luci oscure. In pratica, una registrazione a cellule stabili può essere mantenuta per ~ 20-25 min, anche se c&#39;è una tendenza a rallentare la cinetica di risposta in questo periodo. Una singola preparazione dell&#39;ommatidia dissociata può rimanere inalterabile fino a 2 ore. Un ulteriore deficit del preparato ommatidia isolato è l&#39;inaccessibilità dei microvilli, che si traduce nell&#39;accessibilità del TRP eTRPL alla pipetta di registrazione, impedendo le registrazioni a canale singolo. Utilizzando un metodo sviluppato, Bacigalupo ei suoi colleghi hanno saputo registrare direttamente l&#39;attività a canale singolo dal rhabdomere 37 . Tuttavia, questa attività del canale differisce da quella dei canali TRPL eterologicamente espressa nelle cellule di coltura tissutale 38 e dall&#39;attività di canale TRP derivata da analisi del rumore di tiro ottenuto da ommatidia 34 isolata. Presumibilmente, la procedura di dissezione ha notevolmente danneggiato le cellule fotorecettori quando si utilizza questo metodo.

Ampi studi genetici della mosca di frutta, Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , iniziati oltre 100 anni fa, hanno stabilito la mosca D. melanogaster come un modello sperimentale estremamente utile per la dissezione genetica di processi biologici complessi. La metodologia descritta qui di seguito unisce la potenza accumulata della genetica molecolare D. melanogaster con l&#39;elevato rapporto segnale-rumore delle registrazioni a morsetto patch a cellule intere. Questa combinazione consente lo studio della fototransduzione di D. melanogaster come modello di segnale inositolo-lipidico e regolazione e attivazione del canale TRP, sia nell&#39;ambiente nativo che nella più alta risoluzione di singole molecole. L&#39;applicazione del metodo di registrazione delle cellule intere ai fotorecettori di D. melanogaster ha rivoluzionato lo studio della fototransduzione invertebrata. Questo metodo è stato sviluppato da Hardie 1 e da indepFinalmente da Ranganathan e dai suoi colleghi 2 ~ 26 anni fa ed è stato progettato per sfruttare gli estesi strumenti di manipolazione genetica di D. melanogaster e li usa per scoprire meccanismi di fototransduzione e inositol-lipidi segnalazione. In un primo momento, questa tecnica ha subito una rapida riduzione della sensibilità alla luce e un basso rendimento dell&#39;ommatidia durante il processo di dissezione, il che impediva studi dettagliati quantitativi. Più tardi, l&#39;aggiunta di ATP e NAD alla pipetta patch ha aumentato drasticamente l&#39;idoneità del preparato per le registrazioni quantitative prolungate. Successivamente, è stata realizzata un&#39;ampia caratterizzazione del meccanismo di trasduzione del segnale a livello molecolare. Attualmente, la fototransduzione di D. melanogaster è uno dei pochi sistemi in cui i segnali di fosfoinositide e i canali TRP possono essere studiati ex vivo a risoluzione di una molecola. Questo rende D. melanogaster fototransduzione e il meLa thodologia sviluppata per studiare questo meccanismo un sistema di modelli molto sensibile. Questo protocollo descrive come dissectare la retina di D. melanogaster e rimuovere meccanicamente l&#39;ommatidia isolata dalle cellule di pigmento circostante (glia). Ciò consente la formazione di un giga-seal e di un blocco di patch a cellule intere sui corpi delle cellule fotorecettori. Fortunatamente, la maggior parte delle proteine ​​di segnalazione sono limitate al rhabdomere e non diffuse. Inoltre, c&#39;è un tampone immobile Ca 2+ chiamato calphotina, situato tra il compartimento di segnalazione e il corpo cellulare 3 , 4 e un elevato livello di espressione dello scambiatore Na + / Ca 2+ (CalX) nei microvilli 5 . Insieme, il confinamento proteico al rhabdomere, il buffer della calphotina e l&#39;alta espressione del CalX permettono registrazioni a cellule intere prolungate ( cioè fino a 20 minuti) senza la perdita di componenti essenzialiDel processo di fototransduzione e mantenendo alta sensibilità alla luce. Il seguente protocollo descrive come ottenere ommatidia isolata e eseguire registrazioni a cellule intere che sembrano conservare le proprietà naturali della cascata di fototransduzione. Le esperienze di morsetti per patch intero a scarafaggio disossato ( Periplaneta americana ) 6 e grillo ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia sono state eseguite in modo analogo a quello descritto per D. melanogaster . Inoltre, gli esperimenti di clamp patch sui fotorecettori dissociati del file clam ( Lima scabra ) e dello scallop ( Pecten irradiani ) sono stati eseguiti in maniera leggermente diversa da quella condotta su D. melanogaster , consentendo sia misurazioni a cellule intere 8 che a singolo canale 9 . Qui vengono descritti i principali risultati ottenuti in D. melanogaster con questa tecnica. La discussione iComprende la descrizione di alcune insidie ​​e limitazioni di questa tecnica.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1363">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:292px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:508px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">5 ml syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">1 ml syringe with elongated tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Silicone dissection dish/block</td>
			<td align="left">Dow Corning</td>
			<td align="left">Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td align="left">Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60&#7506;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Syringe filters</td>
			<td align="left">Millex</td>
			<td></td>
			<td align="left">22 &#181;m PVDF filter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Capillaries (for omatidia separation)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Polyethylene Tubing</td>
			<td align="left">Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td align="left">1.57 x 1.14 mm (35 cm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">&#160;2 small beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">50 ml or less</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">2 paraffin film sheets</td>
			<td align="left">Parafilm M</td>
			<td></td>
			<td align="left">~5 x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Bath chamber</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Cover slips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">22 x 22 mm No. 0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Paraplast Plus</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td align="left">Paraffin &#8211; polyisobutylene mixture</td>
			<td align="left">To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Ground</td>
			<td align="left">Warner Instruments&#160;</td>
			<td align="left">64-1288</td>
			<td align="left">Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Headless micro dissection needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Entomology, 12 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Micro dissecting needle holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Vise</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">2 fine tweezers + 1 rough tweezers</td>
			<td></td>
			<td align="left">Dumont #5, Biology&#160;</td>
			<td align="left">0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Stereoscopic zoom Microscope&#160;</td>
			<td align="left">Nikon</td>
			<td align="left">SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Cold light source</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">KL1500 LCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter (Color) for cold light source</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">RG620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Delicate wipers</td>
			<td align="left">Kimtech</td>
			<td></td>
			<td align="left">Kimwipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Electrode holder</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td align="left">QSW-T10P</td>
			<td align="left">Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Silver Wire</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td align="left">0.25 mm diameter, needs to be chloridized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">MP 85</td>
			<td align="left">Huxley-Wall Style Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Faraday cage</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td align="left">Electromagnetic noise shielding and black front curtain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Anti-vibration Table</td>
			<td align="left">Newport</td>
			<td align="left">VW-3036-OPT-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Osilloscope</td>
			<td align="left">GW</td>
			<td align="left">GOS-622G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Perfusion system</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td align="left">VC-8P</td>
			<td align="left">Pinch valve control system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Perfusion valve controller</td>
			<td align="left">Scientific instruments</td>
			<td align="left">BPS-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td align="left" height="20" style="height:20px;">Suction system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Amplifier</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">Axopatch-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Head-stage</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">CV - 4</td>
			<td align="left">Gain: x 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">A/D converter</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Clampex</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td dir="LTR">10</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">pCLAMP</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td>10</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light source (Xenon Arc lamp)</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">Lambda LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light detector</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td align="left">phototransistor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter wheel and shutter controller</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filters (Natural density filter)</td>
			<td align="left">Chroma</td>
			<td align="left">6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter (Color)</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">OG590, Edge filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Xenon Flash Lamp system</td>
			<td align="left">Dr. Rapp OptoElecftronic</td>
			<td align="left">JML-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light guide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Quartz&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Pulse generator</td>
			<td align="left">AMPI</td>
			<td align="left">Master 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td align="left">Olympus</td>
			<td align="left">IX71, Inverted</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Red illumination filter (Microscope)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">RG630 / RG645 &#248;45mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Microscope objective</td>
			<td align="left">Olympus</td>
			<td align="left">X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">CCD Camera</td>
			<td align="left">Andor</td>
			<td align="left">iXon DU885K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">NIS Element&#160;</td>
			<td align="left">Nikon</td>
			<td align="left">AR</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td align="left" height="24" style="height:24px;">Ca+2 indicator</td>
			<td align="left">Invitrogen</td>
			<td align="left">Calcium green 5N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Excitation &#38; emission filters and dichroic mirror</td>
			<td align="left">Chroma</td>
			<td align="left">19002 - AT - GFP/FITC Longpass set</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Vertical pipette puller</td>
			<td align="left">Narishige&#160;</td>
			<td align="left">Model PP83</td>
			<td align="left">Use either vertical or horizontal puller, as preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Horizontal pipette puller</td>
			<td align="left">Sutter Instrument&#160;</td>
			<td align="left">Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filament</td>
			<td align="left">Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td align="left">3 mm trough or square box</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Capillaries</td>
			<td align="left">Harvard Apparatus</td>
			<td align="left">borosilicate glass capillaries</td>
			<td align="left">1 x 0.58 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors

Le registrazioni di morsetti di tensione a cellule intere da fotorecettori Drosophila melanogaster hanno rivoluzionato il campo della trasduzione visuale invertebrata, consentendo l&#39;uso della genetica molecolare D. melanogaster per lo studio dei segnali inositol-lipidi e dei canali del Transient Receptor Potential (TRP) a livello di singola molecola. Una manciata di laboratori hanno imparato questa tecnica potente, che consente di analizzare le risposte fisiologiche alla luce in condizioni altamente controllate. Questa tecnica consente di controllare i supporti intracellulari e extracellulari; La tensione della membrana; E la rapida applicazione di composti farmacologici, come ad esempio una varietà di indicatori ionici o pH, ai supporti intra- e extracellulari. Con un rapporto segnale-rumore eccezionalmente elevato, questo metodo consente di misurare le correnti unitarie (spintanee e quantiche) scure e spontanee e le correnti macroscopiche indotte da luce (LIC) dal peccatoGle D. melanogaster fotorecettori. Questo protocollo descrive in grande dettaglio tutti i passi fondamentali necessari per eseguire questa tecnica, che comprende sia le registrazioni elettrofisiologiche che quelle ottiche. Viene descritta la procedura di dissezione della retina a mosca per il conseguimento di ommatidia isolata ex vivo intatta e vitale nella camera di bagno. Sono inoltre dettagliate le apparecchiature necessarie per eseguire misurazioni di immagini a cellule intere e fluorescenti. Infine, le insidie ​​nell&#39;uso di questa delicata preparazione durante esperimenti estesi sono spiegati.

Il metodo descritto ha permesso la registrazione accurata delle correnti unitarie fondamentali che generano urti quantici spontanei e leggeri, che somma per produrre la risposta macroscopica alla luce, in condizioni definite. Inoltre ha permesso il confronto tra le specie selvatiche e mutanti che presentano difetti nelle molecole di segnalazione critica ( figure 3 e 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Inoltre, la capacità di misurare il potenziale di inversione in condizioni bi-ioniche ha rivelato le proprietà biofisiche fondamentali dei canali TRP e TRP (TRPL) 18 , 19 . Ha anche permesso di misurare gli effetti delle sostituzioni di aminoacidi nella regione dei pori di TRP che ha modificato il suo Ca 2+Permeabilità 20 . La risposta luminosa ottenuta da registrazioni a cellule intere a blocchi di patch dipende linearmente dall&#39;intensità luminosa per almeno 4 ordini di grandezza. Questo non è stato risolto usando ERG e metodi di registrazione intracellulari. Di conseguenza, una serie di risposte a brevi flash di intensità crescente e una trama della funzione di risposta di intensità hanno rivelato una stretta linearità della risposta del flash con una maggiore intensità della luce. La linearità rigorosa può contenere fino a parecchie centinaia di pA, ma è discutibile se dopo ciò sia la linearità o il controllo delle pinze che si rompono ( Figura 6 ). Questi risultati suggeriscono che le risposte macroscopiche alla luce sono una sintesi lineare delle risposte unitarie alla luce ( cioè gli urti quantici). E &#39;stato ben stabilito usando le registrazioni di tensione che la stimolazione leggera della luce indLe fluttuazioni di tensione discrete ( cioè gli urti quantici) nella maggior parte delle specie invertebrate. I colpi quantistici di D. melanogaster derivano dall&#39;apertura concordata di ~ 15 canali TRP e ~ 2 canali TRPL al picco della bocca 18 . Ogni bump è generato dall&#39;assorbimento di un singolo fotone, mentre la risposta macroscopica a luci più intense è la somma di queste risposte elementari 14 , 21 . Gli urti variano notevolmente in latenza, nel tempo e nell&#39;ampiezza, anche quando le condizioni dello stimolo sono identiche. La generazione di bump è un processo stocastico descritto dalle statistiche di Poisson, in modo che ogni fotone effettivamente assorbito solleva solo un urto. La relazione single-photon-single-bump richiede che ogni passo nella cascata include non solo un efficiente meccanismo di accensione, ma anche un meccanismo di &quot;disattivazione&quot; altrettanto efficace. Il vantaggio funzionale è la produzione diContatore fotonico molto sensibile con una risposta transitoria veloce molto adatta sia alla sensibilità che alla risoluzione temporale richiesta dal sistema visivo. L&#39;esigenza di un efficace meccanismo di spostamento si rivela quando il fotopigment attivo (metarodopsina, M) o il suo obiettivo, il G q α, non riesce ad inattivare e porta alla produzione continua di urti a lungo dopo che la luce è spenta ( Figura 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 . Il bump rappresenta l&#39;attività di cooperazione dei canali TRP / TRPL in un microvillo. Come tale, qualsiasi ipotesi di attivazione del canale dovrebbe anche spiegare l&#39;attivazione del canale cooperativo. Recentemente, Hardie e colleghi hanno dimostrato che la luce evoca contrazioni rapide dei fotorecettori, suggerendo che la sensibilità alla luceI canali (TRP / TRPL) possono essere ganciati meccanicamente 25 . Questa attivazione meccanica, insieme ai protoni osservati rilasciati da idrolisi PIP 2 mediata da PLC, promuove l&#39;apertura dei canali TRP / TRPL e spiega la natura cooperativa della produzione di bump 26 . Attualmente, i fotorecettori D. melanogaster sono uno dei pochi sistemi in cui i segnali di fosfoinositide e il canale TRP possono essere studiati in vivo , rendendo quindi la fototransduzione di D. melanogaster e la metodologia sviluppata per studiare questo meccanismo un sistema di modelli molto prezioso. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig3.jpg" /> Figura 3: I mutanti inaC P209 e inaD P215 mostrano la terminazione di risposta rallenta della risposta macroscopica alla luce e dei singoli urti quantici. ( A ) L&#39;isolata ommatidium prepaCon una patch pipetta riempita di fluorescenti color lucifer giallo CH (eccitazione: 430 nm, emissione: 540 nm) viene presentata durante una registrazione a cellule intere. Si noti che il colorante fluorescente diffusa e etichettato un solo corpo fotorecettore e che i corpi cellulari fotorecettori sono staccati dai loro assoni allungati ma mantengono ancora la loro vitalità. Questa preparazione è adatta a registrazioni simultanee di cellule intere e esperimenti di imaging. ( BD ) Pannelli superiori: la tensione a celle intere ha bloccato le risposte a bolla quantistica alla luce continua (barra aperta) in WT, inaC P209 e mosche mutanti inaD P215 . Una terminazione lenta degli urti è osservata in mutanti inaC P209 e inaD P215 rispetto alle mosche WT. L&#39;inserto sotto mostra la forma ingrandita di singoli urti. Pannelli inferiori: Risposte macroscopiche registrate a cellule normalizzate a un impulso di luce da 500 ms (1,5 x 10 5 fotoni per s) del tipo di selvaggio precedente<html> E muta mutanti. (EG) Pannelli superiori: la tensione di celle intere ha bloccato le risposte della bump quantistica a una breve risposta (1 ms), che provocano una risposta fotone monofotonica in wild-type, arr2 3 e mosche mutanti ninaC P235 . Si noti il ​​treno di urti osservati in arr2 3 e muta mutanti ninaC P235 in risposta ad un solo assorbimento del fotone. Pannelli inferiori: La tensione a celle intere ha bloccato le risposte normalizzate a un impulso di luce di 500 ms (1,5 x 10 4 fotoni / s) nei corrispondenti mutanti. Si noti la lenta terminazione delle risposte macroscopiche osservate in arr2 3 E mosche mutanti ninaC P235 relative a WT. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> D / 55627 / 55627fig4.jpg &quot;/&gt; Figura 4: Dinamico cellulare Ca 2+ Dopo l&#39;influenza Ca 2+ indotta dal segnale è influenzata da Calphotin. Una serie di immagini fotorecettori di tipo selvatico e Cpn 1% vola mostrando la fluorescenza dell&#39;indicatore Ca 2+ durante la stimolazione della luce. Le immagini di intensità raw vengono tracciate usando la codifica a colori falsi (bar = 10 μm; le frecce indicano la pipetta). La figura è ristampata con l&#39;autorizzazione di Weiss et al. 4 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig5.jpg" /> Figura 5: Le proprietà elettrofisiologiche dei mutanti WT, trp e trpl. ( A ) Morsetto di tensione a celle intero recoGli urti quantistici in risposta alla luce continua chiara (barra aperta) in WT, trpl 302 e trp P343 null mutanti mosche. Sono osservate ampiezze di trp P34 3 molto ridotte. Inset: Sono mostrati singoli singoli grandangoli di tipo selvatico e trp P343 null mutanti mosche. ( B ) Registrazioni di morsetti di tensione a cellule intere in risposta ad un impulso luminoso a 3 s di tipo selvatico e dei corrispondenti mutanti. Si osserva la risposta transitoria a stato costante del mutante trp P343 . Inset: Sono mostrate risposte luminose ingrandite del mutante WT e trp P343 . ( C ) Una famiglia di sovracorrenti correnti indotte dalla luce dei ceppi di mosca sopracitati, suscitati in risposta ad un impulso di luce di 20 ms, a passi di tensione di 3 mV, misurati attorno al potenziale di inversione (E rev ). ( D ) Un istogramma che traccia la media E rev di wildtype e il vari mutants. Le barre di errore sono il SEM Il potenziale di inversione (E rev ) di WT è tra il positivo E rev di trpl 302 , che esprime solo TRP e l&#39;E rev del mutante trp P343 null, che esprime solo TRPL. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig6.jpg" /> Figura 6: La risposta Flash è strettamente lineare con l&#39;aumento dell&#39;intensità luminosa. Una serie di risposte attuali a breve lampi di intensità luminosa crescente e una trama della dipendenza dell&#39;ampiezza di picco della risposta della luce sull&#39;aumentare intensità della luce breve lampeggia. Questa relazione rivela una rigorosa linearità tra la risposta del flash e l&#39;aumentata intensità della luce. Questa stretta linearitàTiene fino ad almeno parecchie centinaia pA, con intensità luminosa che si estende su 4 ordini di grandezza, mentre è discutibile se sia la linearità o il controllo della pinza che si rompe successivamente. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15 (regolare con NaOH) </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Concentrazione (mM) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Proline </td><td> 25 </td></tr><tr><td> alanina </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> Conservare a -20 ° C. </td></tr><tr><td colspan= &quot;2&quot;&gt; Nota: Questa soluzione è nominalmente Ca 2+ libera, ma non ha aggiunto alcun buffere Ca 2+ e quindi avrà circa 5-10 μM traccia Ca 2+ . Soluzione extracellulare (ES) = ES-0Ca 2+ con 1,5 mM CaCl2, ottenuta aggiungendo CaCl2 da una soluzione di stock di 0,5 o 1 M a ES-0Ca 2+ . </td></tr></tbody></table> Tabella 1: Soluzione estracellulare (ES) priva di Ca +2 . Descrizione chimica e le quantità specifiche necessarie per produrre ES senza Ca +2 . <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Quantità </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> saccarosio </td><td> 1,5 g </td></tr><tr><td colspan="2"> Dividere in aliquote di 150 μL in flaconcini da 1,5 ml e conservare a -20 76; C. </td></tr><tr><td> Soluzione di triturazione (TS) </td><td> Riempire 1 flaconcino di 150 ml della soluzione di magazzino con 1,350 ml di ES o di ES-0Ca 2+ , per abbinare la soluzione utilizzata durante la dissezione. </td></tr></tbody></table> Tabella 2: Fetal Bovine Serum (FBS) + Soluzione Scaffa - Soluzione. Descrizione chimica e quantità specifiche necessarie per la produzione di siero di fegato fetale (FBS) + soluzione saccarosica. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15 (regolare con KOH) </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Concentrazione (mM) </td></tr><tr><td> Gluconato di potassio (Kglu) </td><td> 140 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Sale di magnesio di ATP (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Sali di sodio GTP (Na 2 GTP) </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Β-Nicotinamide adenina dinucleotide idrato (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> Conservare a -20 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabella 3: Soluzione intracellulare (IS1). Descrizione chimica e le quantità specifiche necessarie per produrre IS1, che viene utilizzato per la maggior parte per la risposta dell&#39;intensità e la misurazione del bump quantico. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15 (regola con CsOH) </td></tr><tr><td> Reagente </td><td> Concentrazione (mM) </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Sale di magnesio di ATP (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Sali di sodio GTP (Na 2 GTP) </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Β-Nicotinamide adenina dinucleotide idrato (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tetraetilammonio cloruro (TAE) </td><td> 15 </td></tr><tr><td></td><td> Conservare a -20 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabella 4: Soluzione intracellulare (IS2). Descrizione chimica e le quantità specifiche necessarie per produrre la soluzione Intracellulare IS2, che viene utilizzata principalmente per misure di potenziale inversa della corrente indotta dalla luce.

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Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Le registrazioni a cellule intere dai fotoricettori Drosophila melanogaster consentono di misurare scatti oscuri spontanei, urti quantici, risposte macroscopiche alla luce e relazioni di tensione-corrente in varie condizioni. In combinazione con gli strumenti di manipolazione genetica D. melanogaster , questo metodo consente di studiare il percorso iniettol-lipidico onnipresente e il suo target, il canale TRP.

Metodo elettrofisiologico per le registrazioni a morsetto di tensione a cellule intere da<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Le registrazioni elettrofisiologiche dal Percorso di Fiber Gigante D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

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Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Registrazioni simultanee a cellule di fotorecettori e dei neuroni di secondo ordine in un anfibio Retinal Fetta Preparazione

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Cellula intera Patch Clamp per lo studio dei meccanismi di Infrared Stimolazione Neurale

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Bloccare Registrazioni patch da cellule embrionali Zebrafish Mauthner

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

Elettrofisiologici Registrazione da<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Taste Sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Whole-cell patch-clamp registrazioni da Morphologically- e neurochimico-identificati interneuroni dell&#39;ippocampo

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Associati a cellule intere registrazioni in organotipiche fettine di ippocampo

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elettrofisiologici e morfologica Caratterizzazione neuronali Microcircuiti in Acute Fette cervello Utilizzando accoppiati di patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Registrazioni Whole-cell patch-clamp nel cervello fette

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli<em&gt; In Vivo</em