Name: electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors
Uploaded: 2017-06-13T13:00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors at JoVE.com

Den eksperimentelle delen av denne undersøkelsen ble støttet av tilskudd fra USA-Israel Bi National Science Foundation (til BM og IL), Israel Science Foundation (ISF), Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP) (til BM), og bioteknologien Og Forskningsrådet for biologisk vitenskap (BBSRC Grant-tall: BB / M007006 / 1 og BB / D007585 / 1) til RCH

<ol>
	<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recordings+of+the+light+induced+current+in+dissociated+Drosophila+photoreceptors:+evidence+for+feedback+by+calcium+permeating+the+light-sensitive+channels.">Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).</li><li>Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+mutant+defective+in+extracellular+calcium-+dependent+photoreceptor+deactivation+and+rapid+desensitization.">A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization.</a> Nature. 354, 230-232 (1991).</li><li>Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calphotin:+a+Drosophila+photoreceptor+cell+calcium-binding+protein.">Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+and+Ca2++buffering+are+essential+for+prevention+of+light-induced+retinal+degeneration.">Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration.</a> J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation,+adaptation,+and+cell+survival+functions+of+the+Na+++/Ca+2++exchanger+CalX.">Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX.</a> Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).</li><li>Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-activated+potassium+channels+in+blowfly+photoreceptors+and+their+role+in+light+adaptation.">Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation.</a> J. Physiol. Lond. 440, (1991).</li><li>Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+blue-+and+green-sensitive+photoreceptors+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus.">Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).</li><li>Nasi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+clamp+of+dissociated+photoreceptors+from+the+eye+of+Lima+scabra.">Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra.</a> J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).</li><li>Nasi, E., Gomez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+ion+channels+in+solitary+photoreceptors+of+the+scallop+Pecten+irradians.">Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians.</a> J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).</li><li>Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+2++limits+the+development+of+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors.">Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).</li><li>Kohn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Cooperation+between+the+IP3+Receptor+and+Phospholipase+C+Secures+the+High+Sensitivity+to+Light+of+Drosophila+Photoreceptors+In+Vivo.">Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo.</a> J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).</li><li>Hevers, W., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+modulates+the+voltage+dependence+of+delayed+rectifier+and+Shaker+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors.">Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+photon+responses+in+Drosophila+photoreceptors+and+their+regulation+by+Ca+2.">Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2.</a> J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).</li><li>Scott, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Drosophila+phototransduction+cascade+into+a+signalling+complex+shapes+elementary+responses.">Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses.</a> Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).</li><li>Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+of+G+betae+over+G+qalphae+in+vivo+prevents+dark,+spontaneous+activity+of+Drosophila+photoreceptors.">Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors.</a> J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).</li><li>Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C-Mediated+Suppression+of+Dark+Noise+Enables+Single-Photon+Detection+in+Drosophila+Photoreceptors.">Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).</li><li>Hardie, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+amplification+in+Drosophila+phototransduction.+Roles+for+G+protein,+phospholipase+C,+and+diacylglycerol+kinase.">Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase.</a> Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).</li><li>Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+the+Drosophila+light-sensitive+channels,+TRP+and+TRPL.">In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL.</a> Neuron. 19, 1249-1259 (1997).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+and+manipulation+of+the+Ca+2++selectivity+filter+in+the+Drosophila+transient+receptor+potential+channel.">In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel.</a> J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).</li><li>Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+bovine+rhodopsin+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).</li><li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo.">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+2++-dependent+metarhodopsin+inactivation+mediated+by+calmodulin+and+NINAC+myosin+III.">Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III.</a> Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).</li><li>Cook, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C+and+termination+of+G-protein-mediated+signalling+in+vivo.">Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo.</a> Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).</li><li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors.">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors.">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).</li><li>Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+light-induce+response+of+the+central+retinular+cells+from+the+electroretinogram+of+Drosophila.">Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila.</a> J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trp+gene+is+essential+for+a+light-activated+Ca2++channel+in+Drosophila+photoreceptors.">The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 8, 643-651 (1992).</li><li>Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+light-activated+conductance+is+composed+of+the+two+channels+TRP+and+TRPL.">The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL.</a> Cell. 85 (5), 651-659 (1996).</li><li>Huber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transient+receptor+potential+protein+(Trp),+a+putative+store-+operated+Ca+2++channel+essential+for+phosphoinositide-mediated+photoreception,+forms+a+signaling+complex+with+NorpA,+InaC+and+InaD.">The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD.</a> EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).</li><li>Shieh, B. H., Niemeyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+protein+encoded+by+the+InaD+gene+regulates+recovery+of+visual+transduction+in+Drosophila.">A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila.</a> Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).</li><li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade.">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li><li>Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+transform+glucose+to+alanine,+which+fuels+the+neurons+in+the+honeybee+retina.">Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina.</a> J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+activation+of+light-sensitive+channels+in+Drosophila+photoreceptors.">Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors.</a> J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).</li><li>Agam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+stress+reversibly+activates+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL+in+vivo.">Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo.</a> J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).</li><li>Agam, K., Frechter, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Drosophila+TRP+and+TRPL+channels+requires+both+Ca2++and+protein+dephosphorylation.">Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation.</a> Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).</li><li>Delgado, R., Mu&#241;oz, Y., Pe&#241;a-Cort&#233;s, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors.">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li><li>Parnas, M., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+channel+block+by+Ca2++underlies+the+voltage+dependence+of+Drosophila+TRPL+channel.">Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).</li></ol>

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Anvendelsen av helcelleopptak til D. melanogasterfotoreceptorer tillatt for oppdagelsen og funksjonell belysning av nye signalproteiner, slik som TRP-kanaler 27 , 28 , 29 og INAD 30 , 31 , 32 stillasprotein. Helt siden den innledende introduksjonen av denne teknikken gjorde det mulig å løse langsiktige grunnleggende spørsmål angående ionmekanismen og spenningsavhengigheten av lysresponsen. Dette skjedde på grunn av den tildelte evne til nøyaktig å kontrollere membranspenningen og den ekstracellulære og intracellulære ioniske sammensetning 19 , 28 . Et stort hinder for patch-klemmeteknikken i D. melanogaster har vært skjønnligheten av den isolerte ommatidia preparasjon. Detaljert studier har vist at integriteten til fototransduksjonsmaskinen er avhengig av kontinuerlig tilførsel av ATP, spesielt under lyseksponering, noe som fører til et stort forbruk av ATP. Dessverre eliminerer den mekaniske stripingen av pigmentene ( dvs. glia) -cellene, som er nødvendig for å nå fotoreceptormembranet med patchpipetten, hovedkilden til metabolitter som er nødvendige for ATP-produksjon 33 . Påføring av eksogen ATP i opptakspipetten oppfyller kun delvis kravet til store mengder ATP. En kort forsyning av ATP fører til spontan aktivering av TRP-kanalene og til dissosiasjon av fototransduksjonsmaskinen fra de lysaktiverte kanalene, noe som forårsaker en stor økning i cellulær Ca 2+ og avskaffelse av normal respons på lys 34 , 35 . Denne rekkefølgen av hendelser skyldes ikke skade påFotoreceptorer ved disseksjonsprosedyren, men snarere til den cellulære uttømming av ATP. For å forhindre at denne hendelsessekvensen oppstår og for å opprettholde normale lysresponser, bør fotoreceptorene ikke bli utsatt for sterke lys, som bruker store mengder ATP. Også, NAD må inkluderes i opptakspipetten, antagelig for å lette ATP-produksjonen i mitokondriene 18 , 36 . For målinger av spontane og kvantesnor er ovennevnte vanskelighet minimal fordi bare dimlys brukes. I praksis kan en stabil helcelleopptak opprettholdes i ~ 20-25 minutter, selv om det er en tendens til responskinetikk å senke over denne perioden. Et enkelt preparat av dissocierte ommatidier kan forbli levedyktig i opptil 2 timer. En ytterligere mangel på det isolerte ommatidiapreparatet er utilgjengeligheten til microvilli, som oversetter til utilgjengeligheten av TRP ogTRPL kanaler til opptakspipetten, for å hindre enkeltkanalinnspillinger. Ved hjelp av en metode de utviklet, lyktes Bacigalupo og kollegaer direkte å registrere enkeltkanalaktivitet fra rhabdomere 37 . Denne kanalaktiviteten er imidlertid forskjellig fra den for TRPL-kanaler heterologt uttrykt i vevskulturceller 38 og fra TRP-kanalaktivitet avledet fra skuddstøyanalyse oppnådd fra isolert ommatidia 34 . Formentlig har disseksjonsprosedyren skadet fotoreceptorcellene sterkt ved bruk av denne metoden.

Omfattende genetiske studier av fruktfluen , Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , initiert for over 100 år siden, har etablert D. melanogasterfly som en ekstremt nyttig eksperimentell modell for genetisk disseksjon av komplekse biologiske prosesser. Metodologien beskrevet nedenfor kombinerer den akkumulerte kraften til D. melanogaster molekylærgenetikk med det høye signal-til-støyforholdet mellom helcelle patch clamp-opptak. Denne kombinasjonen tillater studiet av D. melanogaster- fototransduksjon som en modell for inositol-lipid-signalering og TRP-kanalregulering og -aktivering, både i det opprinnelige miljøet og ved den høyeste oppløsningen av enkle molekyler. Anvendelse av helcelleopptaksmetoden til D. melanogaster fotoreceptorer har revolusjonert studiet av invertebratfototransduksjon. Denne metoden ble utviklet av Hardie 1 og indepEndelig av Ranganathan og kolleger for 2 ~ 26 år siden, og ble designet for å utnytte de omfattende genetiske manipulasjonsverktøyene til D. melanogaster og bruke dem til å avdekke mekanismer for fototransduksjon og inositol-lipid-signalering. I begynnelsen led denne teknikken av en rask reduksjon i lysfølsomhet og lavt utbytte av ommatidia under disseksjonsprosessen, som forhindret detaljerte kvantitative studier. Senere økte tilsetningen av ATP og NAD til patchpipetten dramatisk økt preparatets egnethet for langvarige kvantitative innspillinger. Deretter ble omfattende karakterisering av signaltransduksjonsmekanismen på molekylnivå realisert. For tiden er D. melanogaster fototransduksjon et av de få systemene der fosfonositidsignalering og TRP-kanaler kan studeres ex vivo ved enkeltmolekyloppløsning. Dette gjør D. melanogaster phototransduction og megThodology utviklet for å studere denne mekanismen et svært følsomt modell system. Denne protokollen beskriver hvordan du dissekerer D. melanogaster retina og mekanisk striper den isolerte ommatidien fra de omkringliggende pigment (glia) cellene. Dette gjør det mulig å danne en giga-tetning og en helcelle patch klemme på fotoreceptor celle legemer. Heldigvis er de fleste signalproteiner begrenset til rhabdomeren og diffunderer ikke. I tillegg er det en immobile Ca 2+ buffer kalt calphotin, plassert mellom signalkammeret og cellekroppen 3 , 4 og et høyt ekspresjonsnivå av Na + / Ca 2+ -veksleren (CalX) i mikrovilli 5 . Sammen gir proteininnholdet til rhabdomeren, kalphotinbufferen og det høye uttrykket av CalX relativt langvarig ( dvs. opptil ~ 20 min) helcelleopptak, uten tap av essensielle komponenterAv fototransduksjonsprosessen og samtidig opprettholde høy følsomhet for lys. Følgende protokoll beskriver hvordan man får tak i isolert ommatidia og utfører helcelleopptak som ser ut til å bevare fototransduksjonskaskadets innfødte egenskaper. Hele-celle patch clamp eksperimenter på dissociated kakerlakk ( Periplaneta americana ) 6 og cricket ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia ble utført tilsvarende som beskrevet for D. melanogaster . I tillegg ble patch clamp-eksperimenter på dissocierte fotoreceptorer av filen clam, ( Lima scabra ) og kamskjell ( Pecten irradians ) utført på en litt annen måte enn den som ble utført på D. melanogaster , slik at både helcelle 8 og enkeltkanalmålinger 9 . Her beskrives de store prestasjonene som er oppnådd i D. melanogaster ved anvendelse av denne teknikken. Diskusjonen iInkluderer beskrivelse av noen fallgruver og begrensninger av denne teknikken.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1363">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:292px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:508px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">5 ml syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">1 ml syringe with elongated tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Silicone dissection dish/block</td>
			<td align="left">Dow Corning</td>
			<td align="left">Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td align="left">Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60&#7506;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Syringe filters</td>
			<td align="left">Millex</td>
			<td></td>
			<td align="left">22 &#181;m PVDF filter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Capillaries (for omatidia separation)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Polyethylene Tubing</td>
			<td align="left">Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td align="left">1.57 x 1.14 mm (35 cm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">&#160;2 small beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">50 ml or less</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">2 paraffin film sheets</td>
			<td align="left">Parafilm M</td>
			<td></td>
			<td align="left">~5 x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Bath chamber</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Cover slips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">22 x 22 mm No. 0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Paraplast Plus</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td align="left">Paraffin &#8211; polyisobutylene mixture</td>
			<td align="left">To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Ground</td>
			<td align="left">Warner Instruments&#160;</td>
			<td align="left">64-1288</td>
			<td align="left">Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Headless micro dissection needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Entomology, 12 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Micro dissecting needle holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Vise</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">2 fine tweezers + 1 rough tweezers</td>
			<td></td>
			<td align="left">Dumont #5, Biology&#160;</td>
			<td align="left">0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Stereoscopic zoom Microscope&#160;</td>
			<td align="left">Nikon</td>
			<td align="left">SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Cold light source</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">KL1500 LCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter (Color) for cold light source</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">RG620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Delicate wipers</td>
			<td align="left">Kimtech</td>
			<td></td>
			<td align="left">Kimwipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Electrode holder</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td align="left">QSW-T10P</td>
			<td align="left">Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Silver Wire</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td align="left">0.25 mm diameter, needs to be chloridized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">MP 85</td>
			<td align="left">Huxley-Wall Style Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Faraday cage</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td align="left">Electromagnetic noise shielding and black front curtain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Anti-vibration Table</td>
			<td align="left">Newport</td>
			<td align="left">VW-3036-OPT-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Osilloscope</td>
			<td align="left">GW</td>
			<td align="left">GOS-622G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Perfusion system</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td align="left">VC-8P</td>
			<td align="left">Pinch valve control system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Perfusion valve controller</td>
			<td align="left">Scientific instruments</td>
			<td align="left">BPS-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td align="left" height="20" style="height:20px;">Suction system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Amplifier</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">Axopatch-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Head-stage</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">CV - 4</td>
			<td align="left">Gain: x 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">A/D converter</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Clampex</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td dir="LTR">10</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">pCLAMP</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td>10</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light source (Xenon Arc lamp)</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">Lambda LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light detector</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td align="left">phototransistor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter wheel and shutter controller</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filters (Natural density filter)</td>
			<td align="left">Chroma</td>
			<td align="left">6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter (Color)</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">OG590, Edge filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Xenon Flash Lamp system</td>
			<td align="left">Dr. Rapp OptoElecftronic</td>
			<td align="left">JML-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light guide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Quartz&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Pulse generator</td>
			<td align="left">AMPI</td>
			<td align="left">Master 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td align="left">Olympus</td>
			<td align="left">IX71, Inverted</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Red illumination filter (Microscope)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">RG630 / RG645 &#248;45mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Microscope objective</td>
			<td align="left">Olympus</td>
			<td align="left">X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">CCD Camera</td>
			<td align="left">Andor</td>
			<td align="left">iXon DU885K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">NIS Element&#160;</td>
			<td align="left">Nikon</td>
			<td align="left">AR</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td align="left" height="24" style="height:24px;">Ca+2 indicator</td>
			<td align="left">Invitrogen</td>
			<td align="left">Calcium green 5N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Excitation &#38; emission filters and dichroic mirror</td>
			<td align="left">Chroma</td>
			<td align="left">19002 - AT - GFP/FITC Longpass set</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Vertical pipette puller</td>
			<td align="left">Narishige&#160;</td>
			<td align="left">Model PP83</td>
			<td align="left">Use either vertical or horizontal puller, as preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Horizontal pipette puller</td>
			<td align="left">Sutter Instrument&#160;</td>
			<td align="left">Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filament</td>
			<td align="left">Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td align="left">3 mm trough or square box</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Capillaries</td>
			<td align="left">Harvard Apparatus</td>
			<td align="left">borosilicate glass capillaries</td>
			<td align="left">1 x 0.58 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors

Hele-celle spenningsklemmeopptak fra Drosophila melanogaster fotoreceptorer har revolusjonert feltet for invertebrat visuell transduksjon, som muliggjør bruk av D. melanogaster molekylær genetikk for å studere inositol-lipid signalering og transientreceptor potensielle (TRP) kanaler på enkeltmolekylnivå. En håndfull laboratorier har mestret denne kraftige teknikken, som gjør det mulig å analysere de fysiologiske responsene på lys under høyt kontrollerte forhold. Denne teknikken tillater kontroll over intracellulære og ekstracellulære medier; Membran spenningen; Og hurtig påføring av farmakologiske forbindelser, slik som en rekke ioniske eller pH-indikatorer, til intra- og ekstracellulære medier. Med et unikt høyt signal-støyforhold, gjør denne metoden muligheten for å måle mørke spontane og lysinducerte enhedsstrømmer ( dvs. spontane og kvanteboller) og makroskopiske lysinducerte strømmer (LIC) fra syndGle D. melanogaster fotoreceptorer. Denne protokollen skisserer i stor detalj alle de viktigste trinnene som er nødvendige for å utføre denne teknikken, som inkluderer både elektrofysiologiske og optiske opptak. Flytthemningsdiseksjonsprosedyren for å oppnå intakt og levedyktig isolert ommatidia fra ex vivo i badekammeret er beskrevet. Utstyret som trengs for å utføre helcelle- og fluorescensbilder målinger er også detaljert. Til slutt forklares fallgruvene ved bruk av dette delikate preparatet under utvidede eksperimenter.

Den beskrevne metoden har muliggjort nøyaktig registrering av de grunnleggende enhedsstrømmene som genererer spontane og lette fremkallede kvantebud, som summer for å produsere makroskopisk respons på lys under definerte betingelser. Det tillot også sammenligning mellom wildtype og mutant fluer som har defekter i kritiske signalmolekyler ( figur 3 og 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . I tillegg viste evnen til å måle reverseringspotensialet under bi-ioniske forhold grunnleggende biofysiske egenskaper av TRP- og TRP-lignende (TRPL) -kanalene 18 , 19 . Det muliggjorde også måling av effektene av aminosyresubstitusjoner i porregionen av TRP som modifiserte dens Ca 2+Permeabilitet 20 . Lysresponsen som oppnås ved patch clamp-helcelleopptak, avhenger lineært på lysintensiteten for minst 4 størrelsesordener. Dette kunne ikke løses ved å bruke ERG og intracellulære opptaksmetoder. Følgelig viste en serie svar på korte blinker av økende intensitet og et plott av intensitetsresponsfunksjonen en streng linearitet av blitsresponsen med økende lysintensitet. Den strenge lineæriteten holder opp til minst flere hundre pA, men det er diskutabelt om det etterfølgende er linearitet eller klemstyring som bryter ned ( figur 6 ). Disse resultatene antyder at makroskopiske responsene til lys er en lineær summering av de enhetlige responsene til lys ( dvs. kvantumstumper). Det har vært godt etablert ved hjelp av spenningsopptak som dim lysstimulering indUces diskrete spenningsfluktuasjoner ( dvs. kvantumstumper) hos de fleste ubeskyttede arter. D. melanogaster quantum bumps skyldes samordnet åpning av ~ 15 TRP kanaler og ~ 2 TRPL kanaler på toppen av bump 18 . Hver bump genereres av absorpsjonen av en enkelt foton, mens makroskopisk respons på mer intense lys er summasjonen av disse elementære svarene 14 , 21 . Bumpene varierer betydelig i latens, tidskurs og amplitude, selv når stimulusforholdene er identiske. Bump generasjon er en stokastisk prosess beskrevet av Poisson statistikk, hvor hver effektivt absorbert foton utløser bare en bump. Enkeltfoton-enkelt-bunkeforholdet krever at hvert trinn i kaskade ikke bare inneholder en effektiv &quot;på-på&quot; -mekanisme, men også en like effektiv &quot;avstengningsmekanisme&quot;. Den funksjonelle fordelen er produksjonen av aMeget sensitiv foton counter med en rask forbigående respons som er svært godt egnet for både følsomheten og den tidsmessige oppløsningen som kreves av det visuelle systemet. Kravet på en effektiv avviklingsmekanisme blir avslørt når enten den aktive fotopigmentet ( dvs. metarhodopsin, M) eller dens mål, G q α, ikke deaktiverer og fører til kontinuerlig produksjon av støt lenge etter at lyset er slått av ( Figur 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 . Bumpen representerer samvirkeaktiviteten til TRP / TRPL-kanalene i en mikrovillus. Som sådan bør enhver hypotese av kanalaktivering også forklare kooperativ kanalaktivering. Nylig har Hardie og kolleger vist at lys fremkaller raske sammentrekninger av fotoreceptorene, noe som tyder på at lysfølsomhetenE kanaler (TRP / TRPL) kan være mekanisk inngjerdet 25 . Denne mekaniske aktiveringen, sammen med de observerte protonene utgitt av PLC-mediert PIP 2- hydrolyse, fremmer åpningen av TRP / TRPL-kanalene og forklarer kooperativ naturen av støpproduksjonen 26 . Foreløpig er D. melanogaster fotoreceptorer et av de få systemene der fosfonositidsignalering og TRP-kanaler kan studeres in vivo , og dermed gjør D. melanogaster- fototransduksjon og metodikken utviklet for å studere denne mekanismen et svært verdifullt modellsystem. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig3.jpg" /> Figur 3: InaC P209 og inaD P215 mutanter avslører langsom responsavslutning av makroskopisk respons til lys og av enkeltkvantum-støt. ( A ) Den isolerte ommatidiumprepaRasjon med en patchpipette fylt med fluorescerende Lucifer Yellow CH-fargestoff (eksitasjon: 430 nm, emisjon: 540 nm) presenteres under en helcelleopptak. Merk at det fluorescerende fargestoffet diffunderte og merket en enkelt fotoreceptorcellelegeme, og at fotoreceptorcellelegemene løsnes fra deres langstrakte axoner, men fortsatt opprettholder levedyktighet. Dette preparatet er egnet for samtidige helcelleopptak og imagingeksperimenter. ( BD ) Øvre paneler: Hele-celle spenning klemmet kvantum bump responser til kontinuerlig dim lys (åpen bar) i WT, inaC P209 , og inaD P215 mutant fluer. En langsom avslutning av humpene observeres i inaC P209 og inaD P215 mutanter i forhold til WT fluer. Innlegget nedenfor viser den forstørrede formen av enkelte støt. Bunnpaneler: Normaliserte helcelle registrerte makroskopiske svar på en 500 ms lyspuls (1,5 x 10 5 fotoner per s) av ovennevnte wildtype<html> Og mutant fluer. (EG) Øvre paneler: Hele-celle spenningsklemme kvantesporresponser på et kort (1 ms), svakt lys fremkallende enkeltfotonsvar i wildtype , arr2 3 og ninaC P235 mutantfluer . Legg merke til togstumpen observert i arr2 3 og ninaC P235 mutant fluer som følge av en enkelt fotonabsorpsjon. Bunnpaneler: Hele-celle spenning klemmet normaliserte responser på en 500 ms lyspuls (1,5 x 104 fotoner / s) i de tilsvarende mutantene. Legg merke til den langsomme avslutningen av de makroskopiske svarene som observeres i punkt 2 Og ninaC P235 mutant fluer i forhold til WT. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig3large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> D / 55627 / 55627fig4.jpg &quot;/&gt; Figur 4: Cellulær Ca 2+ -dynamikk Følgende signalfremkalt Ca 2+ -tilstrømning påvirkes av Calphotin. En tidsserie av fotoreceptorbilder av wildtype og Cpn 1% fluer som viser fluorescensen av Ca 2+ -indikatoren under lysstimulering. Råintensitetsbilder plottes ved bruk av falskfargekoding (bar = 10 μm; pilespisser angir pipetten). Figur utgitt med tillatelse fra Weiss et al. 4 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig4large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig5.jpg" /> Figur 5: De elektrofysiologiske egenskapene til WT-, trp- og trpl-mutanter. ( A ) Hele-celle spenningsklemme recoRdings av quantum bumps som svar på kontinuerlig dim lys (åpen bar) i WT, trpl 302 og trp P343 null mutant fluer. Sterkt reduserte amplituder av trp P34 3 observeres. Inset: Forstørrede enkeltkvantumstumper av wildtype og trp P343 null mutantfly er vist. ( B ) Hele-celle spenningsklemmeopptak som svar på en 3 s lyspuls av vildtype og de tilsvarende mutanter. Den forbigående steady-state responsen av trp P343 mutanten er observert . Inset: Forstørrede lysresponser av WT og trp P343 mutant er vist. ( C ) En familie av overliggende lysinducerte strømmer av ovennevnte flystammer, fremkalt som svar på en 20 ms lyspuls ved spenningstrinn på 3 mV målt rundt reverseringspotensialet (E rev ). ( D ) Et histogram som plottar den gjennomsnittlige E rev av wildtype og de forskjellige mutanenets. Feilbjelkene er SEM Vendingspotensialet (E rev ) for WT er mellom den positive E rev av trpl 302 , som kun uttrykker TRP, og E rev av trp P343 null mutanten, som bare uttrykker TRPL. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig5large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig6.jpg" /> Figur 6: Blitsresponsen er strengt lineær med økende lysintensitet. En serie av gjeldende svar på korte blinker av økende lysintensitet og et plott av avhengigheten av toppamplituden til lysresponsen på den økende intensiteten av korte lysblink. Dette forholdet viser en streng linearitet mellom flashresponsen og økende lysintensitet. Denne strenge lineæritetenHolder opp til minst flere hundre pA, med lysintensitet som spenner over 4 størrelsesordener, mens det er diskutabelt om det er linearitet eller klemstyring som bryter ned etterpå. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig6large.jpg" target="_blank">Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH- </td><td> 7,15 (juster med NaOH) </td></tr><tr><td> reagens </td><td> Konsentrasjon (mM) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Proline </td><td> 25 </td></tr><tr><td> alanin </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> Oppbevares ved -20 ° C. </td></tr><tr><td colspan= &quot;2&quot;&gt; Merk: Denne løsningen er nominelt Ca 2+ fri, men har ingen Ca 2+ buffere tilsatt og vil derfor ha ca. 5 - 10 μM spor Ca 2+ . Ekstracellulær løsning (ES) = ES-0Ca 2+ med 1,5 mM CaCl2, fremstilt ved å tilsette CaCl2 fra en 0,5 eller 1 M stamløsning til ES-0Ca 2+ . </td></tr></tbody></table> Tabell 1: Ca + 2- fri ekstracellulær løsning (ES). Kjemisk beskrivelse og de spesifikke mengder som kreves for å produsere Ca + 2- fri ES. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> reagens </td><td> Beløp </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> sukrose </td><td> 1,5 g </td></tr><tr><td colspan="2"> Del i 150 μl alikvoter i 1,5 ml hetteglass og lagre ved -20 76; C. </td></tr><tr><td> Trituration løsning (TS) </td><td> Fyll 1 hetteglass med 150 ml stamløsning med 1,350 ml ES eller ES-0Ca 2+ , for å matche løsningen som ble brukt under disseksjonen. </td></tr></tbody></table> Tabell 2: Fetal bovint serum (FBS) + sakkarose-stamløsning. Kjemisk beskrivelse og de spesifikke mengder som kreves for å produsere fostre bovint serum (FBS) + sukrose-stamløsning. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH- </td><td> 7,15 (juster med KOH) </td></tr><tr><td> reagens </td><td> Konsentrasjon (mM) </td></tr><tr><td> Kaliumglukonat (Kglu) </td><td> 140 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATP magnesiumsalt (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTP natriumsalt (Na 2 GTP) </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> P-Nikotinamid-adenin-dinukleotidhydrat (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> Oppbevares ved -20 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabell 3: Intracellulær Solution (IS1). Kjemisk beskrivelse og de spesifikke mengder som kreves for å produsere IS1, som hovedsakelig brukes til intensitetsrespons og kvantemålinger. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH- </td><td> 7,15 (juster med CsOH) </td></tr><tr><td> reagens </td><td> Konsentrasjon (mM) </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATP magnesiumsalt (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTP natriumsalt (Na 2 GTP) </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> P-Nikotinamid-adenin-dinukleotidhydrat (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tetra-etylammoniumklorid (TAE) </td><td> 15 </td></tr><tr><td></td><td> Oppbevares ved -20 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabell 4: Intracellulær Solution (IS2). Kjemisk beskrivelse og de spesifikke mengdene som kreves for å produsere intracellulær løsning IS2, som hovedsakelig brukes til reverseringspotensielle målinger av den lysinducerte strømmen.

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors at JoVE.com

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Hele celleopptak fra Drosophila melanogaster fotoreceptorer muliggjør måling av spontane mørke støt, kvantesprengninger, makroskopiske responser på lys og strømspenningsforhold under forskjellige forhold. I kombinasjon med D. melanogaster genetiske manipulasjonsverktøy, muliggjør denne metoden studien av allestedsnærværende inositol-lipid signalveien og dens mål, TRP-kanalen.

Elektrofysiologisk metode for helcelle spenningsklemmeopptak fra<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreseptorer

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Hele Cell Patch Clamp for Gransker Mekanismer for Infrared Neural Stimulering

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Patch Clamp Recordings fra embryonale Sebrafisk Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

Elektro Opptak fra<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Smak sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Hel-celle Patch-clamp Opptak fra Morphologically- og Neurochemically-identifiserte hippocampus interneuroner

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Sammenkoblede hele cellen Recordings i organotypic hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elektro og Morfologisk Karakterisering av Nevronale kretser i Akutt Brain Slices hjelp Grupperte patch-clamp Recordings

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Hel-celle Patch-clamp Recordings i hjernen skiver

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Elektro Metode for opptak Intracellulær spenningsreaksjoner av<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotoreseptorer og interneurons til lys stimuli<em&gt; I Vivo</em