Name: electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors
Uploaded: 2017-06-13T13:00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors at JoVE.com

Den experimentella delen av denna forskning stöddes av bidrag från USA-Israel Bi National Science Foundation (till BM och IL), Israel Science Foundation (ISF), Deutsch-Israelische Projektkooperation (DIP) (till BM) och bioteknik Och forskningsrådet för biologiska vetenskaper (BBSRC Grant-nummer: BB / M007006 / 1 och BB / D007585 / 1) till RCH

<ol>
	<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recordings+of+the+light+induced+current+in+dissociated+Drosophila+photoreceptors:+evidence+for+feedback+by+calcium+permeating+the+light-sensitive+channels.">Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).</li><li>Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+mutant+defective+in+extracellular+calcium-+dependent+photoreceptor+deactivation+and+rapid+desensitization.">A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization.</a> Nature. 354, 230-232 (1991).</li><li>Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calphotin:+a+Drosophila+photoreceptor+cell+calcium-binding+protein.">Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+and+Ca2++buffering+are+essential+for+prevention+of+light-induced+retinal+degeneration.">Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration.</a> J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation,+adaptation,+and+cell+survival+functions+of+the+Na+++/Ca+2++exchanger+CalX.">Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX.</a> Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).</li><li>Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-activated+potassium+channels+in+blowfly+photoreceptors+and+their+role+in+light+adaptation.">Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation.</a> J. Physiol. Lond. 440, (1991).</li><li>Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+blue-+and+green-sensitive+photoreceptors+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus.">Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).</li><li>Nasi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+clamp+of+dissociated+photoreceptors+from+the+eye+of+Lima+scabra.">Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra.</a> J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).</li><li>Nasi, E., Gomez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+ion+channels+in+solitary+photoreceptors+of+the+scallop+Pecten+irradians.">Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians.</a> J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).</li><li>Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+2++limits+the+development+of+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors.">Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).</li><li>Kohn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Cooperation+between+the+IP3+Receptor+and+Phospholipase+C+Secures+the+High+Sensitivity+to+Light+of+Drosophila+Photoreceptors+In+Vivo.">Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo.</a> J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).</li><li>Hevers, W., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+modulates+the+voltage+dependence+of+delayed+rectifier+and+Shaker+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors.">Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+photon+responses+in+Drosophila+photoreceptors+and+their+regulation+by+Ca+2.">Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2.</a> J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).</li><li>Scott, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Drosophila+phototransduction+cascade+into+a+signalling+complex+shapes+elementary+responses.">Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses.</a> Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).</li><li>Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+of+G+betae+over+G+qalphae+in+vivo+prevents+dark,+spontaneous+activity+of+Drosophila+photoreceptors.">Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors.</a> J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).</li><li>Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C-Mediated+Suppression+of+Dark+Noise+Enables+Single-Photon+Detection+in+Drosophila+Photoreceptors.">Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).</li><li>Hardie, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+amplification+in+Drosophila+phototransduction.+Roles+for+G+protein,+phospholipase+C,+and+diacylglycerol+kinase.">Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase.</a> Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).</li><li>Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+the+Drosophila+light-sensitive+channels,+TRP+and+TRPL.">In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL.</a> Neuron. 19, 1249-1259 (1997).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+and+manipulation+of+the+Ca+2++selectivity+filter+in+the+Drosophila+transient+receptor+potential+channel.">In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel.</a> J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).</li><li>Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+bovine+rhodopsin+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).</li><li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo.">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+2++-dependent+metarhodopsin+inactivation+mediated+by+calmodulin+and+NINAC+myosin+III.">Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III.</a> Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).</li><li>Cook, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C+and+termination+of+G-protein-mediated+signalling+in+vivo.">Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo.</a> Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).</li><li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors.">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors.">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).</li><li>Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+light-induce+response+of+the+central+retinular+cells+from+the+electroretinogram+of+Drosophila.">Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila.</a> J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trp+gene+is+essential+for+a+light-activated+Ca2++channel+in+Drosophila+photoreceptors.">The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 8, 643-651 (1992).</li><li>Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+light-activated+conductance+is+composed+of+the+two+channels+TRP+and+TRPL.">The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL.</a> Cell. 85 (5), 651-659 (1996).</li><li>Huber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transient+receptor+potential+protein+(Trp),+a+putative+store-+operated+Ca+2++channel+essential+for+phosphoinositide-mediated+photoreception,+forms+a+signaling+complex+with+NorpA,+InaC+and+InaD.">The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD.</a> EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).</li><li>Shieh, B. H., Niemeyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+protein+encoded+by+the+InaD+gene+regulates+recovery+of+visual+transduction+in+Drosophila.">A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila.</a> Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).</li><li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade.">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li><li>Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+transform+glucose+to+alanine,+which+fuels+the+neurons+in+the+honeybee+retina.">Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina.</a> J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+activation+of+light-sensitive+channels+in+Drosophila+photoreceptors.">Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors.</a> J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).</li><li>Agam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+stress+reversibly+activates+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL+in+vivo.">Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo.</a> J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).</li><li>Agam, K., Frechter, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Drosophila+TRP+and+TRPL+channels+requires+both+Ca2++and+protein+dephosphorylation.">Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation.</a> Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).</li><li>Delgado, R., Mu&#241;oz, Y., Pe&#241;a-Cort&#233;s, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors.">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li><li>Parnas, M., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+channel+block+by+Ca2++underlies+the+voltage+dependence+of+Drosophila+TRPL+channel.">Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).</li></ol>

Författarna har ingenting att avslöja.

Tillämpningen av helcellsinspelningar på D. melanogasterfotoreceptorer tillåtna för upptäckten och funktionell belysning av nya signalproteiner, såsom TRP-kanaler 27 , 28 , 29 och INAD 30 , 31 , 32 ställningsprotein. Helt sedan den inledande introduktionen av denna teknik möjliggjorde det upplösning av långsiktiga grundläggande frågor angående jonmekanismen och spänningsberoende av ljusresponsen. Detta inträffade på grund av den tilldelade förmågan att noggrant reglera membranspänningen och extracellulär och intracellulär jonisk komposition 19 , 28 . Ett stort hinder för patch-klämtekniken i D. melanogaster har varit fragiliteten hos den isolerade ommatidiapreparansonera. Detaljerade studier har visat att fototransduktionsmaskineriets integritet beror på den kontinuerliga tillförseln av ATP, speciellt under ljusexponering, vilket leder till en stor konsumtion av ATP. Tyvärr elimineras den mekaniska randningen av pigmenten ( dvs. glia) celler, som krävs för att nå fotoreceptormembranet med patchpipetten, huvudkällan av metaboliter som är nödvändiga för ATP-produktion 33 . Tillämpning av exogen ATP i inspelningspipetten uppfyller endast delvis kravet på stora mängder ATP. En kort försörjning av ATP leder till spontan aktivering av TRP-kanalerna och till dissociationen av fototransduktionsmaskineriet från de ljusaktiverade kanalerna, vilket medför en stor ökning av cell Ca 2+ och avskaffandet av det normala svaret mot ljus 34 , 35 . Denna följd av händelser beror inte på skador påFotoreceptorer genom dissektionsförfarandet, men snarare till den cellulära utarmningen av ATP. För att förhindra att denna följd av händelser inträffar och för att bibehålla normala ljusresponser, bör fotoreceptorerna inte utsättas för intensiva ljus, vilka förbrukar stora mängder ATP. NAD måste också ingå i inspelningspipetten, förmodligen för att underlätta ATP-produktion i mitokondrier 18 , 36 . För mätningar av spontana och kvanta stötar är ovanstående svårighet minimal eftersom endast dimljus används. I praktiken kan en stabil helcellsinspelning bibehållas i ~ 20-25 min, även om det finns en tendens att responskinetiken saktar ner under denna period. En enda beredning av dissocierad ommatidia kan förbli livskraftig i upp till 2 timmar. En ytterligare brist på det isolerade ommatidiapreparatet är otillgängligheten för mikrovilli, vilket översätter till otillgängligheten hos TRP ochTRPL-kanaler till inspelningspipetten, förhindrande av enkanalsinspelningar. Med hjälp av en metod som de utvecklade lyckades Bacigalupo och kollegor att direkt registrera enkanalaktivitet från rhabdomere 37 . Denna kanalaktivitet skiljer sig emellertid från den för TRPL-kanaler som heterologt uttrycks i vävnadskulturceller 38 och från TRP-kanalaktivitet härrörande från skjuvbrusanalys erhållen från isolerad ommatidia 34 . Förmodligen skadade dissektionsförfarandet fotoreceptorcellerna vid användning av denna metod.

Omfattande genetiska studier av fruktflugan , Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) , initierad för över 100 år sedan, har etablerat D. melanogasterflugan som en extremt användbar experimentell modell för genetisk dissektion av komplexa biologiska processer. Metoden som beskrivs nedan kombinerar den ackumulerade kraften av D. melanogaster molekylärgenetik med det höga signal-brusförhållandet för helcells-patch-kläminspelningar. Denna kombination möjliggör studiet av D. melanogasterfototransduktion som en modell för inositol-lipid-signalering och TRP-kanalreglering och -aktivering både i den ursprungliga miljön och vid den högsta upplösningen av enkla molekyler. Applicering av hela cellinspelningsmetoden till D. melanogaster fotoreceptorer har revolutionerat studien av invertebratfototransduktion. Denna metod utvecklades av Hardie 1 och indepSlutligen av Ranganathan och kollegor för 2 ~ 26 år sedan och utformades för att utnyttja de omfattande genetiska manipulationsverktygen för D. melanogaster och använda dem för att avslöja mekanismer för fototransduktion och inositol-lipidsignalering. I början led denna teknik av en snabb minskning av ljuskänsligheten och ett lågt utbyte av ommatidier under dissektionsprocessen, vilket förhindrade detaljerade kvantitativa studier. Senare ökade tillsatsen av ATP och NAD till patchpipetten dramatiskt preparatets lämplighet för långvariga kvantitativa inspelningar. Därefter realiserades omfattande karakterisering av signaltransduktionsmekanismen på molekylnivå. För närvarande är D. melanogasterfototransduktion ett av de få system där fosfonositidsignalerings- och TRP-kanaler kan studeras ex vivo vid en-molekylupplösning. Detta gör D. melanogasterfototransduktion och migThodology utvecklad för att studera denna mekanism ett mycket känsligt modell system. Detta protokoll beskriver hur man dissekerar D. melanogasterhinna och mekaniskt bandar den isolerade ommatidien från de omgivande pigmentglasen (glia) cellerna. Detta möjliggör bildandet av en giga-tätning och en helcellsplåsterklämma på fotoreceptorcellkropparna. Lyckligtvis är de flesta signalproteinerna begränsade till rhabdomeren och diffunderar inte. Dessutom finns en immobil Ca 2+ -buffert som kallas calphotin, belägen mellan signalkammaren och cellkroppen 3 , 4 och en hög expressionsnivå för Na + / Ca 2+ -växlaren (CalX) i mikrovilli 5 . Tillsammans möjliggör proteinkonfigurationen för rhabdomeren, kalphotinbufferten och det höga uttrycket av CalX relativt långvariga ( dvs. upp till ~ 20 min) helcellsinspelningar utan förlust av väsentliga komponenterAv fototransduktionsprocessen och samtidigt behålla hög känslighet för ljus. Följande protokoll beskriver hur man erhåller isolerad ommatidia och utför helcellsinspelningar som verkar bevara fototransduktionskaskadens naturliga egenskaper. Hela cell-patch-klämprov på dissocierad kackerlacka ( Periplaneta americana ) 6 och cricket ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia utfördes på liknande sätt som den som beskrivits för D. melanogaster . Dessutom utfördes patch-clamp-experiment på dissocierade fotoreceptorer av file clam, ( Lima scabra ) och kammussla ( Pecten irradians ) på ett något annorlunda sätt än det som utfördes på D. melanogaster , vilket möjliggjorde både helcells 8 och enkanalsmätningar 9 . Här beskrivs de stora prestationerna som erhållits i D. melanogaster med användning av denna teknik. Diskussionen iInkluderar beskrivningen av vissa fallgropar och begränsningar av denna teknik.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1363">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:292px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:508px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">5 ml syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">1 ml syringe with elongated tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Silicone dissection dish/block</td>
			<td align="left">Dow Corning</td>
			<td align="left">Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td align="left">Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60&#7506;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Syringe filters</td>
			<td align="left">Millex</td>
			<td></td>
			<td align="left">22 &#181;m PVDF filter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Capillaries (for omatidia separation)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Polyethylene Tubing</td>
			<td align="left">Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td align="left">1.57 x 1.14 mm (35 cm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">&#160;2 small beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">50 ml or less</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">2 paraffin film sheets</td>
			<td align="left">Parafilm M</td>
			<td></td>
			<td align="left">~5 x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Bath chamber</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Cover slips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">22 x 22 mm No. 0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Paraplast Plus</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td align="left">Paraffin &#8211; polyisobutylene mixture</td>
			<td align="left">To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Ground</td>
			<td align="left">Warner Instruments&#160;</td>
			<td align="left">64-1288</td>
			<td align="left">Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Headless micro dissection needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Entomology, 12 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Micro dissecting needle holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Vise</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">2 fine tweezers + 1 rough tweezers</td>
			<td></td>
			<td align="left">Dumont #5, Biology&#160;</td>
			<td align="left">0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Stereoscopic zoom Microscope&#160;</td>
			<td align="left">Nikon</td>
			<td align="left">SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Cold light source</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">KL1500 LCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter (Color) for cold light source</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">RG620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Delicate wipers</td>
			<td align="left">Kimtech</td>
			<td></td>
			<td align="left">Kimwipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Electrode holder</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td align="left">QSW-T10P</td>
			<td align="left">Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Silver Wire</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td align="left">0.25 mm diameter, needs to be chloridized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">MP 85</td>
			<td align="left">Huxley-Wall Style Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Faraday cage</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td align="left">Electromagnetic noise shielding and black front curtain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Anti-vibration Table</td>
			<td align="left">Newport</td>
			<td align="left">VW-3036-OPT-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Osilloscope</td>
			<td align="left">GW</td>
			<td align="left">GOS-622G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Perfusion system</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td align="left">VC-8P</td>
			<td align="left">Pinch valve control system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Perfusion valve controller</td>
			<td align="left">Scientific instruments</td>
			<td align="left">BPS-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td align="left" height="20" style="height:20px;">Suction system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Amplifier</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">Axopatch-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Head-stage</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">CV - 4</td>
			<td align="left">Gain: x 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">A/D converter</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Clampex</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td dir="LTR">10</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">pCLAMP</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td>10</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light source (Xenon Arc lamp)</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">Lambda LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light detector</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td align="left">phototransistor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter wheel and shutter controller</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filters (Natural density filter)</td>
			<td align="left">Chroma</td>
			<td align="left">6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter (Color)</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">OG590, Edge filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Xenon Flash Lamp system</td>
			<td align="left">Dr. Rapp OptoElecftronic</td>
			<td align="left">JML-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light guide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Quartz&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Pulse generator</td>
			<td align="left">AMPI</td>
			<td align="left">Master 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td align="left">Olympus</td>
			<td align="left">IX71, Inverted</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Red illumination filter (Microscope)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">RG630 / RG645 &#248;45mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Microscope objective</td>
			<td align="left">Olympus</td>
			<td align="left">X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">CCD Camera</td>
			<td align="left">Andor</td>
			<td align="left">iXon DU885K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">NIS Element&#160;</td>
			<td align="left">Nikon</td>
			<td align="left">AR</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td align="left" height="24" style="height:24px;">Ca+2 indicator</td>
			<td align="left">Invitrogen</td>
			<td align="left">Calcium green 5N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Excitation &#38; emission filters and dichroic mirror</td>
			<td align="left">Chroma</td>
			<td align="left">19002 - AT - GFP/FITC Longpass set</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Vertical pipette puller</td>
			<td align="left">Narishige&#160;</td>
			<td align="left">Model PP83</td>
			<td align="left">Use either vertical or horizontal puller, as preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Horizontal pipette puller</td>
			<td align="left">Sutter Instrument&#160;</td>
			<td align="left">Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filament</td>
			<td align="left">Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td align="left">3 mm trough or square box</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Capillaries</td>
			<td align="left">Harvard Apparatus</td>
			<td align="left">borosilicate glass capillaries</td>
			<td align="left">1 x 0.58 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors

Hela cellens spänningsklem inspelningar från Drosophila melanogaster fotoreceptorer har revolutionerat fältet för invertebrat visuell transduktion, vilket möjliggör användning av D. melanogaster molekylär genetik för att studera inositol-lipid-signalering och transientreceptorpotential (TRP) -kanaler på enmolekylenivå. En handfull laboratorier har behärskat denna kraftfulla teknik, vilket möjliggör analys av de fysiologiska svaren på ljus under högt kontrollerade förhållanden. Denna teknik möjliggör kontroll över det intracellulära och extracellulära mediet; Membranspänningen; Och snabb applicering av farmakologiska föreningar, såsom en mängd jon- eller pH-indikatorer, till det intra- och extracellulära mediet. Med ett exceptionellt högt signal / brus-förhållande möjliggör denna metod mätning av enstaka spontana och ljusinducerade enhälliga strömmar ( dvs. spontana och quantumstötar) och makroskopiska ljusinducerade strömningar (LIC) från syndGle D. melanogaster fotoreceptorer. I detta protokoll beskrivs i detalj alla viktiga steg som krävs för att utföra denna teknik, som innefattar både elektrofysiologiska och optiska inspelningar. Proceduren för flyktnäthinnans dissektion för uppnående av intakt och livskraftig ex vivo- isolerad ommatidi i badkammaren beskrivs. Utrustningen som behövs för att utföra helcells- och fluorescensbildningsmätningar är också detaljerad. Slutligen förklaras fallgroparna vid användning av denna känsliga förberedelse under utökade experiment.

Den beskrivna metoden har möjliggjort den exakta inspelningen av de grundläggande enhetsströmmarna som alstrar spontana och lätta-framkallade kvantbultar, vilka summerar för att producera det makroskopiska svaret mot ljus under bestämda betingelser. Det tillät också jämförelsen mellan vildtyp och mutanta flugor som har defekter i kritiska signalmolekyler (figurerna 3 och 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Dessutom visade förmågan att mäta reverseringspotentialen under bijoniska förhållanden grundläggande biofysiska egenskaper hos TRP- och TRP-liknande (TRPL) -kanalerna 18 , 19 . Det möjliggjorde också mätningen av effekterna av aminosyrasubstitutioner i porområdet hos TRP som modifierade dess Ca2 +Permeabilitet 20 . Det lätta svaret som erhålls genom patch clamp-helcellsinspelningar beror linjärt på ljusintensitet för minst 4 storleksordningar. Detta kunde inte lösas genom att använda ERG och intracellulära inspelningsmetoder. Följaktligen avslöjade en serie svar på korta blinkningar med ökande intensitet och en plot av intensitetsresponsfunktionen en strikt linearitet av blixtresponsen med ökande ljusintensitet. Den strikta linjäriteten rymmer upp till åtminstone flera hundra pA, men det är diskutabelt om det därefter är linjäritet eller klämstyrning som bryts ner ( figur 6 ). Dessa resultat tyder på att de makroskopiska svaren mot ljuset är en linjär summering av de enhetliga responserna mot ljuset ( dvs kvantstötar). Det har varit väl etablerat med hjälp av spänningsinspelningar som dämpar ljusstimulering indUces diskreta spänningsfluktuationer ( dvs. kvantumstötar) hos de flesta ryggradslösa arter. D. melanogaster-kvantbulten resulterar från den samordnade öppningen av ~ 15 TRP-kanaler och ~ 2 TRPL-kanaler vid bultens 18 topp. Varje stöt genereras av absorptionen av en enda foton, medan det makroskopiska svaret mot mer intensiva ljus är summeringen av dessa elementära svar 14 , 21 . Bumpen varierar signifikant i latens, tidskurs och amplitud, även när stimulansförhållandena är identiska. Bumpgenerering är en stokastisk process som beskrivs av Poisson-statistiken, varigenom varje effektivt absorberad foton framkallar endast en bump. Enkeltfoton-enstaka-förhållandet kräver att varje steg i kaskaden inte bara innehåller en effektiv &quot;inbyggd&quot; mekanism utan också en lika effektiv &quot;avstängningsmekanism&quot;. Den funktionella fördelen är produktionen av aMycket känslig fotonräknare med ett snabbt övergående svar som är mycket väl lämpat för både känsligheten och den tidsmässiga upplösningen som krävs av det visuella systemet. Kravet på en effektiv avstängningsmekanism avslöjas när antingen den aktiva fotopigmentet ( dvs metarhodopsin, M) eller dess mål, G q α, inte inaktiverar och leder till kontinuerlig produktion av stötar långt efter att ljuset är avstängt ( Figur 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 . Bumpen representerar samverkansaktiviteten hos TRP / TRPL-kanalerna i en mikrovillus. Som sådan bör varje hypotes av kanalaktivering också förklara kooperativ kanalaktivering. Nyligen har Hardie och kollegor visat att ljus framkallar snabba sammandragningar hos fotoreceptorerna, vilket tyder på att ljuskänsligaE-kanaler (TRP / TRPL) kan vara mekaniskt gated 25 . Denna mekaniska aktivering, tillsammans med de observerade protonerna, som släpptes av PLC-medierad PIP 2- hydrolys, främjar öppningen av TRP / TRPL-kanalerna och förklarar kooperativets naturtekniska egenskaper 26 . För närvarande är D. melanogaster fotoreceptorer ett av de få system där fosfonositidsignalerings- och TRP-kanaler kan studeras in vivo , vilket gör D.- melanogasterfototransduktion och metodiken utvecklad för att studera denna mekanism ett mycket värdefullt modellsystem. <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig3.jpg" /> Figur 3: InaC P209- och inaD P215-mutanterna avslöjar långsam responsuppsägning av det makroskopiska svaret mot ljus och av enkeldimma stötar. ( A ) Den isolerade ommatidiumprepaRation med en patchpipett fylld med fluorescerande Lucifer Yellow CH-färgämne (excitation: 430 nm, emission: 540 nm) presenteras under en helcellsinspelning. Observera att det fluorescerande färgämnet diffunderar och märkt en enda fotoreceptorcellkropp och att fotoreceptorcellkropparna är avskilda från sina långsträckta axoner men ändå behålla livskraften. Denna beredning är lämplig för samtidiga helcellsinspelningar och bildbehandlingsexperiment. ( BD ) Övre paneler: Hela cellspänningen klämde kvastbumpsvaret på kontinuerligt dimljus (öppen bar) i WT, inaC P209 och inaD P215 mutantflugor . En långsam avslutning av stötarna observeras i inaC P209 och inaD P215- mutanter i förhållande till WT-flugor. Inlägget nedan visar den förstorade formen av enstaka stötar. Bottenpaneler: Normaliserade helcellsinspelade makroskopiska svar på en 500 ms ljuspuls (1,5 x 10 5 fotoner per s) av ovanstående vildtyp<html> Och mutanta flugor. (EG) Övre paneler: Hela cellspänningen klämde fast kvantespänningsresponser till ett kort (1 ms) dimljus som framkallar enkelfotonsvar i vildtyp, arr2 3 och ninaC P235 mutantflugor . Observera det tågtåg som observerats i armar 3 och ninaC P235-mutantflugor som svar på en enkelfotonabsorption. Bottenpaneler: Hela cellspänningen klämde fast normaliserade svar på en 500 ms ljuspuls (1,5 x 104 foton / s) i motsvarande mutanter. Notera den långsamma avslutningen av de makroskopiska svaren som observeras i punkt 2 Och ninaC P235 mutantflyger i förhållande till WT. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> D / 55627 / 55627fig4.jpg &quot;/&gt; Figur 4: Cellulär Ca 2+ -dynamik Följande signalframkallad Ca 2+ -tillströmning påverkas av kalfotin. En tidsserie av fotoreceptorbilder av vildtyp och Cpn 1% flugor som visar fluorescensen av Ca 2+ -indikatorn under ljusstimulering. Råintensitetsbilder ritas med falskfärgskodning (bar = 10 μm; pilhuvud anger pipetten). Figur återtryckt med tillstånd från Weiss et al. 4 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig5.jpg" /> Figur 5: De elektrofysiologiska egenskaperna hos WT-, trp- och trpl-mutanter. ( A ) Hela cellens spänningsklemrekonRdings av quantum bumps som svar på kontinuerligt dim ljus (öppen bar) i WT, trpl 302 och trp P343 null mutant flugor. Mycket reducerade amplitud av trp P34 3 bump observeras. Inset: Förstorrade singelkvumstötar av vildtyp och trp P343 null mutanta flugor visas. ( B ) Whole-cell spänningsklem inspelningar som svar på en 3 s ljus puls av vildtyp och motsvarande mutanter. Det transienta steady-state-svaret hos trp P343- mutanten observeras . Inset: Förstorade ljusresponser av WT och trp P343 mutant visas. ( C ) En familj av överlagrade ljusinducerade strömmar av ovanstående flugstammar, framkallade som svar på en 20 ms ljuspuls vid spänningssteg av 3 mV mätt kring omkastningspotentialen (E rf). ( D ) Ett histogram som visar medelvärdet E rev av vildtyp och de olika mutanernats. Felstängerna är SEM. Växlingspotentialen (E rev ) för WT ligger mellan den positiva E-omkretsen av trpl 302 , som endast uttrycker TRP, och E revet av trp P343 null-mutanten, som endast uttrycker TRPL. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig6.jpg" /> Figur 6: Flash-svaret är strängt linjärt med ökande ljusintensitet. En serie aktuella svar på korta blinkar med ökande ljusintensitet och en plot av beroende av toppamplituden för ljusresponsen på den ökade intensiteten av korta ljusflöden. Detta förhållande visar en strikt linjäritet mellan blixtresponsen och ökad ljusintensitet. Denna strikta linjäritetRymmer upp till åtminstone flera hundra pA, med ljusintensitet som sträcker sig över 4 storleksordningar, medan det är diskutabelt om det är linjäritet eller klämstyrningen som bryter ner därefter. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig6large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7,15 (justera med NaOH) </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Koncentration (mM) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> KCI </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Proline </td><td> 25 </td></tr><tr><td> alanin </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> Förvaras vid -20 ° C. </td></tr><tr><td colspan= &quot;2&quot;&gt; Obs! Denna lösning är nominellt Ca 2+ fri men har inga Ca 2+ buffertar tillsatta och kommer följaktligen att ha ca 5 - 10 μM spår Ca 2+ . Extracellulär lösning (ES) = ES-0Ca 2+ med 1,5 mM CaCl2, framställd genom tillsats av CaCl2 från en 0,5 eller 1 M stamlösning till ES-0Ca 2+ . </td></tr></tbody></table> Tabell 1: Ca + 2- fri extracellulär lösning (ES). Kemisk beskrivning och de specifika kvantiteter som krävs för att producera Ca + 2 -fri ES. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Reagens </td><td> mängd </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 15 ml </td></tr><tr><td> sackaros </td><td> 1,5 g </td></tr><tr><td colspan="2"> Del i 150 μl alikvoter i 1,5 ml ampuller och lagra vid -20 76; C. </td></tr><tr><td> Triturationslösning (TS) </td><td> Fyll 1 injektionsflaska med 150 ml av stamlösningen med 1,350 ml ES eller ES-0Ca 2+ , för att matcha lösningen som användes vid dissektionen. </td></tr></tbody></table> Tabell 2: Fetal bovint serum (FBS) + sackaros-stamlösning. Kemisk beskrivning och de specifika kvantiteter som krävs för att producera fetalt bovint serum (FBS) + sackaros-stamlösning. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7,15 (justera med KOH) </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Koncentration (mM) </td></tr><tr><td> Kaliumglukonat (Kglu) </td><td> 140 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATP-magnesiumsalt (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTP natriumsalt (Na2 GTP) </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> P-Nikotinamid-adenin-dinukleotidhydrat (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> Förvaras vid -20 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabell 3: Intracellulär lösning (IS1). Kemisk beskrivning och de specifika kvantiteter som krävs för att producera IS1, som oftast används för intensitetsrespons och kvantmåttmätningar. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7,15 (justera med CsOH) </td></tr><tr><td> Reagens </td><td> Koncentration (mM) </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> MgCl2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATP-magnesiumsalt (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTP natriumsalt (Na2 GTP) </td><td> 0,4 </td></tr><tr><td> P-Nikotinamid-adenin-dinukleotidhydrat (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tetra-etylammoniumklorid (TAE) </td><td> 15 </td></tr><tr><td></td><td> Förvaras vid -20 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabell 4: Intracellulär lösning (IS2). Kemisk beskrivning och de specifika kvantiteter som krävs för att producera intracellulär lösning IS2, som oftast används för reverseringspotentialmätningar av den ljusinducerade strömmen.

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors at JoVE.com

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Hela cellinspelningar från Drosophila melanogaster fotoreceptorer möjliggör mätning av spontana mörka stötar, kvantstötar, makroskopiska svar på ljus och strömspänningsrelationer under olika förhållanden. I kombination med D. melanogaster genetiska manipulationsverktyg möjliggör denna metod studien av den allestädes närvarande inositol-lipid-signalvägen och dess mål, TRP-kanalen.

Elektrofysiologisk metod för helcells spänningskläminspelningar från<em&gt; Drosophila</em&gt; Photoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Elektrofysiologiska inspelningar från Giant Fiber stig D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Samtidiga Hel-Inspelningar från fotoreceptorer och andra ordningens neuron i ett Amfibie näthinnan Slice Förberedelser

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Whole Cell Patch Clamp för att undersöka mekanismer Infraröd nervstimulering

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Patch Clamp Inspelningar från embryonala Zebrafish Mauthner Cells

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

Elektrofysiologiska inspelning Från<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Taste sensilla

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Hel-cell Patch-clamp Inspelningar från Morphologically- och neurokemiskt identifierade Hippocampus Interneuroner

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Kopplade Hela Cell Inspelningar i Organotypic hippocampus Slices

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Elektro och morfologisk karakterisering av neurala Microcircuits i akut hjärnan skivor Använda Kopplade Patch-Clamp Inspelningar

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Hel-cell patch-clamp inspelningar i hjärnan skivor

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo