Name: electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors
Uploaded: 2017-06-13T13:00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors at JoVE.com

Bu araştırmanın deneysel kısmı ABD-İsrail Bi Ulusal Bilim Vakfı (BM ve IL&#39;ye), İsrail Bilim Vakfı (ISF), Deutsch-İsrail Projeksiyon İşlemi (DIP) (BM&#39;ye) ve Biyoteknoloji Ve Biyolojik Bilimler Araştırma Konseyi (BBSRC Hibe Numaraları: BB / M007006 / 1 ve BB / D007585 / 1) RCH&#39;ye

<ol>
	<li>Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+recordings+of+the+light+induced+current+in+dissociated+Drosophila+photoreceptors:+evidence+for+feedback+by+calcium+permeating+the+light-sensitive+channels.">Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. 245, 203-210 (1991).</li><li>Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Drosophila+mutant+defective+in+extracellular+calcium-+dependent+photoreceptor+deactivation+and+rapid+desensitization.">A Drosophila mutant defective in extracellular calcium- dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization.</a> Nature. 354, 230-232 (1991).</li><li>Martin, J. H., Benzer, S., Rudnicka, M., Miller, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calphotin:+a+Drosophila+photoreceptor+cell+calcium-binding+protein.">Calphotin: a Drosophila photoreceptor cell calcium-binding protein.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (4), 1531-1535 (1993).</li><li>Weiss, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Compartmentalization+and+Ca2++buffering+are+essential+for+prevention+of+light-induced+retinal+degeneration.">Compartmentalization and Ca2+ buffering are essential for prevention of light-induced retinal degeneration.</a> J Neurosci. 32 (42), 14696-14708 (2012).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+activation,+adaptation,+and+cell+survival+functions+of+the+Na+++/Ca+2++exchanger+CalX.">Light activation, adaptation, and cell survival functions of the Na + /Ca 2+ exchanger CalX.</a> Neuron. 45 (3), 367-378 (2005).</li><li>Weckstrom, M., Hardie, R. C., Laughlin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Voltage-activated+potassium+channels+in+blowfly+photoreceptors+and+their+role+in+light+adaptation.">Voltage-activated potassium channels in blowfly photoreceptors and their role in light adaptation.</a> J. Physiol. Lond. 440, (1991).</li><li>Frolov, R. V., Immonen, E. V., Weckstr&#246;m, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Performance+of+blue-+and+green-sensitive+photoreceptors+of+the+cricket+Gryllus+bimaculatus.">Performance of blue- and green-sensitive photoreceptors of the cricket Gryllus bimaculatus.</a> J Comp Physiol A Neuroethol Sens Neural Behav Physiol. 200 (3), 209-219 (2014).</li><li>Nasi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole-cell+clamp+of+dissociated+photoreceptors+from+the+eye+of+Lima+scabra.">Whole-cell clamp of dissociated photoreceptors from the eye of Lima scabra.</a> J Gen Physiol. 97 (1), 35-54 (1991).</li><li>Nasi, E., Gomez, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light-activated+ion+channels+in+solitary+photoreceptors+of+the+scallop+Pecten+irradians.">Light-activated ion channels in solitary photoreceptors of the scallop Pecten irradians.</a> J. Gen. Physiol. 99, 747-769 (1992).</li><li>Hardie, R. C., Peretz, A., Pollock, J. A., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+2++limits+the+development+of+the+light+response+in+Drosophila+photoreceptors.">Ca 2+ limits the development of the light response in Drosophila photoreceptors.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 252, 223-229 (1993).</li><li>Kohn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Cooperation+between+the+IP3+Receptor+and+Phospholipase+C+Secures+the+High+Sensitivity+to+Light+of+Drosophila+Photoreceptors+In+Vivo.">Functional Cooperation between the IP3 Receptor and Phospholipase C Secures the High Sensitivity to Light of Drosophila Photoreceptors In Vivo.</a> J Neurosci. 35 (6), 2530-2546 (2015).</li><li>Hevers, W., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+modulates+the+voltage+dependence+of+delayed+rectifier+and+Shaker+potassium+channels+in+Drosophila+photoreceptors.">Serotonin modulates the voltage dependence of delayed rectifier and Shaker potassium channels in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 14 (4), 845-856 (1995).</li><li>Chen, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity.">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li><li>Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+photon+responses+in+Drosophila+photoreceptors+and+their+regulation+by+Ca+2.">Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2.</a> J. Physiol. Lond. 524 (Pt 1), 179-194 (2000).</li><li>Scott, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+the+Drosophila+phototransduction+cascade+into+a+signalling+complex+shapes+elementary+responses.">Assembly of the Drosophila phototransduction cascade into a signalling complex shapes elementary responses.</a> Nature. 395 (6704), 805-808 (1998).</li><li>Elia, N., Frechter, S., Gedi, Y., Minke, B., Selinger, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Excess+of+G+betae+over+G+qalphae+in+vivo+prevents+dark,+spontaneous+activity+of+Drosophila+photoreceptors.">Excess of G betae over G qalphae in vivo prevents dark, spontaneous activity of Drosophila photoreceptors.</a> J. Cell Biol. 171 (3), 517-526 (2005).</li><li>Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C-Mediated+Suppression+of+Dark+Noise+Enables+Single-Photon+Detection+in+Drosophila+Photoreceptors.">Phospholipase C-Mediated Suppression of Dark Noise Enables Single-Photon Detection in Drosophila Photoreceptors.</a> J. Neurosci. 32 (8), 2722-2733 (2012).</li><li>Hardie, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+basis+of+amplification+in+Drosophila+phototransduction.+Roles+for+G+protein,+phospholipase+C,+and+diacylglycerol+kinase.">Molecular basis of amplification in Drosophila phototransduction. Roles for G protein, phospholipase C, and diacylglycerol kinase.</a> Neuron. 36 (4), 689-701 (2002).</li><li>Reuss, H., Mojet, M. H., Chyb, S., Hardie, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+analysis+of+the+Drosophila+light-sensitive+channels,+TRP+and+TRPL.">In vivo analysis of the Drosophila light-sensitive channels, TRP and TRPL.</a> Neuron. 19, 1249-1259 (1997).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+identification+and+manipulation+of+the+Ca+2++selectivity+filter+in+the+Drosophila+transient+receptor+potential+channel.">In vivo identification and manipulation of the Ca 2+ selectivity filter in the Drosophila transient receptor potential channel.</a> J. Neurosci. 27 (3), 604-615 (2007).</li><li>Ahmad, S. T., Natochin, M., Barren, B., Artemyev, N. O., O'Tousa, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterologous+expression+of+bovine+rhodopsin+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">Heterologous expression of bovine rhodopsin in Drosophila photoreceptor cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 47 (9), 3722-3728 (2006).</li><li>Scott, K., Sun, Y., Beckingham, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calmodulin+regulation+of+Drosophila+light-activated+channels+and+receptor+function+mediates+termination+of+the+light+response+in+vivo.">Calmodulin regulation of Drosophila light-activated channels and receptor function mediates termination of the light response in vivo.</a> Cell. 91 (3), 375-383 (1997).</li><li>Liu, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca+2++-dependent+metarhodopsin+inactivation+mediated+by+calmodulin+and+NINAC+myosin+III.">Ca 2+ -dependent metarhodopsin inactivation mediated by calmodulin and NINAC myosin III.</a> Neuron. 59 (5), 778-789 (2008).</li><li>Cook, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phospholipase+C+and+termination+of+G-protein-mediated+signalling+in+vivo.">Phospholipase C and termination of G-protein-mediated signalling in vivo.</a> Nat. Cell Biol. 2 (5), 296-301 (2000).</li><li>Hardie, R. C., Franze, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photomechanical+responses+in+Drosophila+photoreceptors.">Photomechanical responses in Drosophila photoreceptors.</a> Science. 338 (6104), 260-263 (2012).</li><li>Huang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+TRP+channels+by+protons+and+phosphoinositide+depletion+in+Drosophila+photoreceptors.">Activation of TRP channels by protons and phosphoinositide depletion in Drosophila photoreceptors.</a> Curr. Biol. 20 (3), 189-197 (2010).</li><li>Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+light-induce+response+of+the+central+retinular+cells+from+the+electroretinogram+of+Drosophila.">Isolation of light-induce response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila.</a> J. Comp. Physiol. 98, 345-355 (1975).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+trp+gene+is+essential+for+a+light-activated+Ca2++channel+in+Drosophila+photoreceptors.">The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors.</a> Neuron. 8, 643-651 (1992).</li><li>Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+light-activated+conductance+is+composed+of+the+two+channels+TRP+and+TRPL.">The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL.</a> Cell. 85 (5), 651-659 (1996).</li><li>Huber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transient+receptor+potential+protein+(Trp),+a+putative+store-+operated+Ca+2++channel+essential+for+phosphoinositide-mediated+photoreception,+forms+a+signaling+complex+with+NorpA,+InaC+and+InaD.">The transient receptor potential protein (Trp), a putative store- operated Ca 2+ channel essential for phosphoinositide-mediated photoreception, forms a signaling complex with NorpA, InaC and InaD.</a> EMBO J. 15 (24), 7036-7045 (1996).</li><li>Shieh, B. H., Niemeyer, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+protein+encoded+by+the+InaD+gene+regulates+recovery+of+visual+transduction+in+Drosophila.">A novel protein encoded by the InaD gene regulates recovery of visual transduction in Drosophila.</a> Neuron. 14 (1), 201-210 (1995).</li><li>Tsunoda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multivalent+PDZ-domain+protein+assembles+signalling+complexes+in+a+G-protein-coupled+cascade.">A multivalent PDZ-domain protein assembles signalling complexes in a G-protein-coupled cascade.</a> Nature. 388 (6639), 243-249 (1997).</li><li>Tsacopoulos, M., Veuthey, A. L., Saravelos, S. G., Perrottet, P., Tsoupras, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial+cells+transform+glucose+to+alanine,+which+fuels+the+neurons+in+the+honeybee+retina.">Glial cells transform glucose to alanine, which fuels the neurons in the honeybee retina.</a> J. Neurosci. 14 (3 Pt 1), 1339-1351 (1994).</li><li>Hardie, R. C., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+activation+of+light-sensitive+channels+in+Drosophila+photoreceptors.">Spontaneous activation of light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors.</a> J. Gen. Physiol. 103, 389-407 (1994).</li><li>Agam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metabolic+stress+reversibly+activates+the+Drosophila+light-sensitive+channels+TRP+and+TRPL+in+vivo.">Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo.</a> J Neurosci. 20 (15), 5748-5755 (2000).</li><li>Agam, K., Frechter, S., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activation+of+the+Drosophila+TRP+and+TRPL+channels+requires+both+Ca2++and+protein+dephosphorylation.">Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca2+ and protein dephosphorylation.</a> Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).</li><li>Delgado, R., Mu&#241;oz, Y., Pe&#241;a-Cort&#233;s, H., Giavalisco, P., Bacigalupo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+activates+the+light-dependent+channel+TRP+in+the+photosensitive+microvilli+of+Drosophila+melanogaster+photoreceptors.">Diacylglycerol activates the light-dependent channel TRP in the photosensitive microvilli of Drosophila melanogaster photoreceptors.</a> J Neurosci. 34 (19), 6679-6686 (2014).</li><li>Parnas, M., Katz, B., Minke, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+channel+block+by+Ca2++underlies+the+voltage+dependence+of+Drosophila+TRPL+channel.">Open channel block by Ca2+ underlies the voltage dependence of Drosophila TRPL channel.</a> J. Gen. Physiol. 129 (1), 17-28 (2007).</li></ol>

Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.

Tüm hücre kayıtlarının D. melanogaster fotoreseptörlerine uygulanması TRP kanalları 27 , 28 , 29 ve INAD 30 , 31 , 32 iskele proteini gibi yeni sinyal proteinlerinin keşfedilmesine ve işlevsel aydınlatılmasına izin verdi. Bu tekniğin ilk tanıtımından bu yana, ışık tepkisinin iyonik mekanizması ve voltaja bağımlılığı ile ilgili uzun vadeli temel soruları çözdü. Bu, zar voltajını ve hücre dışı ve hücre içi iyonik kompozisyonu 19 , 28 doğru bir şekilde kontrol etme konusundaki yeteneği nedeniyle meydana geldi. D. melanogaster&#39;deki yama sıkıştırma tekniğinin büyük bir engeli izole ommatidia prepa&#39;nın kırılganlığı olmuşturrasyon. Ayrıntılı çalışmalar, phototransduction makinelerinin bütünlüğünün, özellikle ATP&#39;nin büyük bir tüketimine yol açan, ışık maruziyeti sırasında, ATP&#39;nin kesintisiz beslenmesine eleştirel olarak bağlı olduğunu ortaya koymuştur. Ne yazık ki, yama pipeti ile fotoreseptör zarına ulaşmak için gerekli olan pigment ( yani glia) hücrelerinin mekanik olarak çizilmesi, ATP üretimi için gerekli metabolitlerin ana kaynağını ortadan kaldırmaktadır 33 . Harici ATP&#39;nin kayıt pipetine uygulanması, büyük oranda ATP gereksinimini kısmen yerine getirmektedir. Kısa bir ATP kaynağı, TRP kanallarının kendiliğinden aktivasyonuna ve ışık aktive kanallardan fototransdüksiyon mekanizmalarının ayrışmasına yol açar, bu da hücresel Ca2 + &#39; da büyük bir artışa ve normal tepkinin 34 , 35&#39;e ortadan kalkmasına neden olur. Bu olaylar dizisi,Fotoreseptörlere, aksine de ATP&#39;nin hücresel tükenmesine yol açar. Bu olayların meydana gelmesini önlemek ve normal ışık tepkileri sağlamak için, fotoreseptörler, yoğun ATP ışıklarını tüketen yoğun ışıklara maruz bırakılmamalıdır. Ayrıca, muhtemelen mitokondriyumda ATP üretimini kolaylaştırmak için NAD, kayıt pipetine dahil edilmelidir 18 , 36 . Spontan ve kuantum tümseklerin ölçümleri için yukarıdaki zorluk minimumdur, çünkü yalnızca loş ışıklar kullanılır. Uygulamada, kararlı bir tam hücreli kayıt ~ 20-25 dakika süreyle muhafaza edilebilir, ancak tepki kinetiği bu süre zarfında yavaşlama eğilimi gösterir. Ayrışmış ommatidia&#39;nın tek bir preparatı 2 saate kadar kullanılabilir kalabilir. İzole edilen ommatidia preparasyonunun ek bir eksikliği, mikropların erişilememesidir ve bu da TRP&#39;ye erişilememesine veTRPL kanallarını kayıt pipetine koyarak tek kanallı kayıtları engeller. Geliştirdikleri bir yöntemle Bacigalupo ve meslektaşları, doğrudan rhabdomere 37&#39;den tek kanallı etkinlik kaydetmeyi başardı. Bununla birlikte, bu kanal aktivitesi, doku kültürü hücrelerinde heterolog olarak ifade edilen TRPL kanallanndan ve izole ommatididen elde edilen atımlı ses analizinden türetilen TRP kanal aktivitesinden farklıdır 34 . Muhtemelen disseksiyon prosedürü bu yöntemi kullanırken fotoreseptör hücrelerine büyük zarar vermiştir.

100 yıldan fazla bir süre önce başlatılan Drosophila melanogaster ( D. melanogaster) meyve sineği genetik çalışmaları, karmaşık biyolojik süreçlerin genetik diseksiyonu için son derece faydalı bir deney modeli olarak D. melanogaster sinekini kurdu. Aşağıda açıklanan metodoloji, D. melanogaster moleküler genetiğin birikmiş gücünü, tüm hücre yaması tutam kayıtlarının yüksek sinyal-gürültü oranı ile birleştirmektedir. Bu kombinasyon hem doğal ortamda hem de tekli moleküllerin en yüksek çözünürlüğünde inositol-lipit sinyallemesi ve TRP kanal düzenleme ve aktivasyonunun bir modeli olarak D. melanogaster fototransdüksiyonunun incelenmesine olanak tanır. Tüm hücre kayıt yönteminin D. melanogaster fotoreseptörlerine uygulanması, omurgasız fototransdüksiyon çalışmalarında devrim yarattı. Bu yöntem Hardie 1 ve bağımsız olarak geliştirilmiştir.Sonsuza dek Ranganathan ve meslektaşları tarafından 2 ila 26 yıl önce ve D. melanogaster&#39;ın geniş genetik manipülasyon araçlarından istifade etmek ve bunları fototransdüksiyon ve inositol-lipid sinyalizasyon mekanizmalarını ortaya çıkarmak için kullanmak üzere tasarlandı. İlk başta, bu teknik, detaylı niceliksel çalışmaları engelleyen, diseksiyon işlemi sırasında ışık hassasiyetinde hızlı bir düşüş ve ommatidia düşük bir hasar gördü. Daha sonra, yama pipetine ATP ve NAD ilavesi, preparatın uzun süreli niceliksel kayıtlar için uygunluğunu önemli ölçüde artırdı. Bundan sonra, moleküler düzeyde sinyal iletim mekanizmasının kapsamlı karakterizasyonu gerçekleştirildi. Halen, D. melanogaster fototransdüksiyonu, fosfoinositid sinyali ve TRP kanallarının tek molekül çözünürlüğünde ex vivo incelenebildiği az sayıdaki sistemden biridir. Bu, D. melanogasterin fototransdüksiyonunu yapar ve benBu mekanizmayı oldukça hassas bir model sistem olarak incelemek için geliştirilen trodoloji. Bu protokol, D. melanogaster retinanın ayrıştırılacağını ve çevredeki pigment (glia) hücrelerinden izole edilmiş ommatidiyi mekanik olarak soyduğunu açıklamaktadır. Bu, fotoreseptör hücre gövdeleri üzerinde bir giga sızdırmazlık elemanı ve bir tam hücre yama kelepçesi oluşumunu mümkün kılar. Neyse ki, en sinyal veren proteinler rabdomere ile sınırlıdır ve yayılmaz. İlaveten, sinyal bölmesi ile hücre gövdesi 3 , 4 arasında bulunan kalphotin adı verilen hareketsiz bir Ca 2+ tamponu ve mikrovillide Na + / Ca 2+ eşanjörünün (CalX) yüksek ekspresyon seviyesi vardır 5 . Birlikte, rhabdomere&#39;ye protein salıverme, calphotin tamponu ve CalX&#39;in yüksek ekspresyonu, gerekli bileşenlerin kaybı olmadan nispeten uzatılmış (yaklaşık ~ 20 dk&#39;ya kadar) tüm hücre kayıtlarına olanak tanırVe ışığa karşı yüksek duyarlılığı korurken. Aşağıdaki protokol izole ommatidia&#39;yı nasıl elde edeceğinizi ve fototranskülasyon kaskadının yerli özelliklerini koruyan tüm hücre kayıtlarını nasıl yapacağınızı açıklamaktadır. Ayrılmış hamam böceği ( Periplaneta americana ) 6 ve kriket ( Gryllus bimaculatus ) 7 ommatidia üzerinde D-melanogaster için tarif edilene benzer şekilde tam hücre yama kelepçe deneyleri yapıldı . Ek olarak, file clam ( Lima scabra ) ve tarak ( Pecten irradians ) ayrıştırılmış fotoreseptörleri üzerindeki patch clamp deneyleri D. melanogaster üzerinde gerçekleştirilenlerden biraz daha farklı bir şekilde gerçekleştirildi , hem tüm hücre 8 hem de tek kanallı ölçümler yapıldı 9 . Burada, D. melanogaster&#39;te bu tekniği kullanarak elde edilen başlıca başarılar anlatılmaktadır. Tartışma iBu tekniğin bazı tuzakları ve kısıtlamaları tanımını içermez.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1363">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;width:292px;">10 ml syringe</td>
			<td style="width:255px;"></td>
			<td style="width:309px;"></td>
			<td style="width:508px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">5 ml syringe</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">1 ml syringe with elongated tip</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Petri dish</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">60 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Silicone dissection dish/block</td>
			<td align="left">Dow Corning</td>
			<td align="left">Sylguard 184 Silicone Elastomer Kit</td>
			<td align="left">Throughly mix both components, pour into mould and cure for 2 hours at 60&#7506;C</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Syringe filters</td>
			<td align="left">Millex</td>
			<td></td>
			<td align="left">22 &#181;m PVDF filter&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Capillaries (for omatidia separation)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Glass, 1.2 x 0.68 mm (~7.5 cm each)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Polyethylene Tubing</td>
			<td align="left">Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td align="left">1.57 x 1.14 mm (35 cm)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">&#160;2 small beakers</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">50 ml or less</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">2 paraffin film sheets</td>
			<td align="left">Parafilm M</td>
			<td></td>
			<td align="left">~5 x 5 cm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Bath chamber</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Cover slips</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">22 x 22 mm No. 0</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Paraplast Plus</td>
			<td align="left">Sigma</td>
			<td align="left">Paraffin &#8211; polyisobutylene mixture</td>
			<td align="left">To glue the coverslip onto the bottom of the bath chamber</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Ground</td>
			<td align="left">Warner Instruments&#160;</td>
			<td align="left">64-1288</td>
			<td align="left">Hybrid Assembly Ag-AgCl Wire Assembly</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Headless micro dissection needle</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Entomology, 12 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Micro dissecting needle holder</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Vise</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">2 fine tweezers + 1 rough tweezers</td>
			<td></td>
			<td align="left">Dumont #5, Biology&#160;</td>
			<td align="left">0.05 x 0.02 mm, length 110 mm, Inox</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Stereoscopic zoom Microscope&#160;</td>
			<td align="left">Nikon</td>
			<td align="left">SMZ-2B</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Cold light source</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">KL1500 LCD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter (Color) for cold light source</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">RG620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Delicate wipers</td>
			<td align="left">Kimtech</td>
			<td></td>
			<td align="left">Kimwipes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Electrode holder</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td align="left">QSW-T10P</td>
			<td align="left">Q series Holders compatible with Axon amplifiers, straight body style</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Silver Wire</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td align="left">0.25 mm diameter, needs to be chloridized</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Micromanipulator</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">MP 85</td>
			<td align="left">Huxley-Wall Style Micromanipulator</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Faraday cage</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td align="left">Electromagnetic noise shielding and black front curtain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Anti-vibration Table</td>
			<td align="left">Newport</td>
			<td align="left">VW-3036-OPT-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Osilloscope</td>
			<td align="left">GW</td>
			<td align="left">GOS-622G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Perfusion system</td>
			<td align="left">Warner Instruments</td>
			<td align="left">VC-8P</td>
			<td align="left">Pinch valve control system</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Perfusion valve controller</td>
			<td align="left">Scientific instruments</td>
			<td align="left">BPS-8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td align="left" height="20" style="height:20px;">Suction system</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Amplifier</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">Axopatch-1D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Head-stage</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">CV - 4</td>
			<td align="left">Gain: x 1/100</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">A/D converter</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td align="left">Digidata 1440A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Clampex</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td dir="LTR">10</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">pCLAMP</td>
			<td align="left">Molecular Device</td>
			<td>10</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light source (Xenon Arc lamp)</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">Lambda LS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light detector</td>
			<td align="left">home made</td>
			<td></td>
			<td align="left">phototransistor</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter wheel and shutter controller</td>
			<td align="left">Sutter Instruments</td>
			<td align="left">Lambda 10-2 with a Uniblitz shutter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filters (Natural density filter)</td>
			<td align="left">Chroma</td>
			<td align="left">6,5,4,3,2,1,0.5,0.3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filter (Color)</td>
			<td align="left">Schott</td>
			<td align="left">OG590, Edge filter</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Xenon Flash Lamp system</td>
			<td align="left">Dr. Rapp OptoElecftronic</td>
			<td align="left">JML-C2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Light guide</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">Quartz&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Pulse generator</td>
			<td align="left">AMPI</td>
			<td align="left">Master 8</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Microscope</td>
			<td align="left">Olympus</td>
			<td align="left">IX71, Inverted</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Red illumination filter (Microscope)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td align="left">RG630 / RG645 &#248;45mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Microscope objective</td>
			<td align="left">Olympus</td>
			<td align="left">X60/0.9 UplanFL N air or X60/1.25 UplanFI oil</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">CCD Camera</td>
			<td align="left">Andor</td>
			<td align="left">iXon DU885K</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">NIS Element&#160;</td>
			<td align="left">Nikon</td>
			<td align="left">AR</td>
			<td align="left">software</td>
		</tr>
		<tr height="24">
			<td align="left" height="24" style="height:24px;">Ca+2 indicator</td>
			<td align="left">Invitrogen</td>
			<td align="left">Calcium green 5N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Excitation &#38; emission filters and dichroic mirror</td>
			<td align="left">Chroma</td>
			<td align="left">19002 - AT - GFP/FITC Longpass set</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Vertical pipette puller</td>
			<td align="left">Narishige&#160;</td>
			<td align="left">Model PP83</td>
			<td align="left">Use either vertical or horizontal puller, as preferred.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Horizontal pipette puller</td>
			<td align="left">Sutter Instrument&#160;</td>
			<td align="left">Model P-1000 Flaming/Brown Micropipette Puller</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Filament</td>
			<td align="left">Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td align="left">3 mm trough or square box</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td align="left" height="21" style="height:21px;">Capillaries</td>
			<td align="left">Harvard Apparatus</td>
			<td align="left">borosilicate glass capillaries</td>
			<td align="left">1 x 0.58 mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors

Drosophila melanogaster fotoreseptörlerinden alınan tüm hücre voltaj kelepçesi kayıtları, inositol-lipid sinyal verme ve Geçici Alıcı Potansiyel (TRP) kanallarını tek molekül seviyesinde incelemek için D. melanogaster moleküler genetiğin kullanılmasını sağlayan omurgasız görsel transdüksiyon alanını devrim yarattı. Bir avuç laboratuvar, yüksek kontrollü koşullardaki ışığa fizyolojik cevapların analizini sağlayan bu güçlü tekniği hakimiyet altına almıştır. Bu teknik, hücre içi ve hücre dışı ortamları kontrol etmeye izin verir; Membran voltajı; Ve çeşitli iyonik veya pH indikatörleri gibi farmakolojik bileşiklerin intra-ve hücre dışı medyaya hızlı uygulanması. Son derece yüksek bir sinyal-gürültü oranı ile bu yöntem, karanlık kendiliğinden ışığa neden olan üniter akımları ( örn. Spontan ve kuantum darbe) ve makroskopik Işık Tarafından Akıtan Akımları (LIC)Gle D. melanogaster fotoreseptörler. Bu protokol, hem elektrofizyolojik hem de optik kayıtları içeren bu tekniği gerçekleştirmek için gerekli olan tüm önemli adımları ayrıntılı bir şekilde özetlemektedir. Hamam odasında sağlam ve uygulanabilir ex vivo izole ommatidia elde etmek için sinek retina diseksiyon prosedürü anlatılmıştır. Tüm hücre ve floresan görüntüleme ölçümlerini gerçekleştirmek için gerekli ekipman da detaylandırılmıştır. Son olarak, uzun deneyler sırasında bu hassas preparatın kullanımındaki tuzaklar açıklanmaktadır.

Tanımlanan yöntem, spontan ve ışığa uyarılmış kuantum darbeleri üreten temel birim akımların doğru kayıt edilmesini sağladı ve bu kuantum darbe, makroskopik yanıtı tanımlanmış koşullar altında ışığa dönüştürmek için toplandı. Ayrıca, kritik sinyal moleküllerinde kusur bulunan vahşi tip ve mutant sinekler arasındaki karşılaştırmaya izin verildi ( Şekil 3 ve 5 ) 14 , 15 , 16 , 17 , 18 . Buna ek olarak, bi-iyonik koşullar altında geri dönüşüm potansiyelini ölçme kabiliyeti, TRP ve TRP benzeri (TRPL) kanalların temel biyofiziksel özelliklerini ortaya çıkardı 18,19. Aynı zamanda, TRP&#39;nin gözenek alanındaki amino asit substitüsyonlarının etkilerini, Ca2 +Geçirgenlik 20 . Yama klemp tam hücreli kayıtlarla elde edilen ışık tepkisi, ışık yoğunluğunda doğrusal olarak en az 4 derece büyüklüğüne bağlıdır. Bu, ERG ve hücreiçi kayıt yöntemleri kullanılarak çözülemedi. Buna göre, artan şiddetin kısa süreli yanıp sönmesi ve yoğunluk tepki fonksiyonunun bir çizimi üzerine bir dizi yanıt, artan ışık şiddeti ile yanıp sönme tepkisinin katı bir doğrusallığını ortaya çıkardı. Sıkı doğrusallık en az yüz pA kadar tutar, ancak bundan sonra lineerlik mi yoksa kısmi kıvrılma kontrolü olup olmadığı tartışmalıdır ( Şekil 6 ). Bu sonuçlar, ışığa karşı makroskopik yanıtların, ışığa verilen üniter tepkilerin doğrusal bir toplamı olduğunu göstermektedir ( yani, kuantum darbeleri). Işık uyarı ışığını dim eden voltaj kayıtları kullanılarak iyi kurulmuştur.Birçok omurgasız türde ayrı voltaj dalgalanmaları ( yani kuantum darbeleri). D. melanogaster kuantum tümsekleri, ~ 15 TRP kanallarının ve ~ 2 TRPL kanallarının çarpma zirvesinin 18 en üstünde uyumlu bir şekilde açılmasından kaynaklanır. Her darbe, tek bir fotonun emilmesi ile üretilirken, daha yoğun ışıklara makroskopik tepki, bu temel tepkiler 14 , 21&#39;in toplamıdır. Uyarıcı koşulları aynı olsa bile, darbeler, gecikme, zaman yönü ve genlikte önemli ölçüde değişir. Damga üretimi, her etkili emilen fotonun sadece bir yumru oluşturduğu Poisson istatistiği tarafından tanımlanan stokastik bir süreçtir. Tekli foton-tekli-yumru ilişkisi, kademeli kademedeki her adımın sadece etkili bir &quot;açma&quot; mekanizmasını değil aynı zamanda etkili bir &quot;kapatma&quot; mekanizmasını içermesini gerektirir. Fonksiyonel avantajı, birGörsel sistemin gerektirdiği zamansal çözünürlük ve hassaslık için çok hızlı bir geçici tepki veren çok hassas foton sayacı. Aktif bir kapatma mekanizması için gereklilik, aktif fotopigment ( yani metarodopezin, M) veya hedefi G q α&#39;nın etkisiz hale getirilmesinde başarısız olması ve ışık kesildikten sonra uzun süre buruşukluk üretimine neden olması durumunda ortaya çıkar. 3 ) 15 , 22 , 23 , 24 . Darbe TRP / TRPL kanallarının bir mikrovillus içindeki kooperatif faaliyetini temsil eder. Bu nedenle, kanal aktivasyonunun herhangi bir hipotezi kooperatif kanal aktivasyonunu da açıklamak zorundadır. Son zamanlarda, Hardie ve meslektaşları fotoreptörlerin hızlı kasılmalarını uyandırdığını göstermişler ve ışık hassasiyetininE kanalları (TRP / TRPL) mekanik olarak kaplanabilir 25 . Bu mekanik aktivasyon, PLC aracılı PIP 2 hidrolizi ile açığa çıkan gözlenen protonlarla birlikte TRP / TRPL kanallarının açılmasını teşvik eder ve yumru üretiminin kooperatif doğasını açıklar 26 . Şu anda, D. melanogaster fotoreseptörleri fosfoinositid sinyali ve TRP kanallarının in vivo incelenebildiği az sayıdaki sistemden biridir ve böylece D. melanogaster fototransdüksiyonu yapmaktadır ve bu mekanizmayı oldukça değerli bir model sistem olarak incelemek için geliştirilen metodoloji. <img alt="Şekil 3" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig3.jpg" /> Şekil 3: inaC P209 ve inaD P215 Mutantları, Işık ve Tekli Kuantum Tümsekleri için Makroskopik Yanıtın Yavaş Yanıt Vermesinin Sona Ermesi&#39;ni Ortaya Çıkarmaktadır. ( A ) İzole edilmiş ommatidyum prepaFloresan Lucifer Yellow CH boya (uyarma: 430 nm; emisyon: 540 nm) ile doldurulmuş bir yama pipeti ile rasyon, bütün hücre kayıt sırasında sunulmuştur. Floresan boya, tek bir fotoreseptör hücre gövdesine yayılmış ve etiketlenmiştir ve fotoreseptör hücre gövdeleri, uzatılmış aksonlarından ayrılır, ancak canlı kalırlar. Bu preparat aynı anda tüm hücre kayıtları ve görüntüleme deneyleri için uygundur. ( BD ) Üst paneller: WT, inaC P209 ve inaD P215 mutant sineklerinde sürekli loş ışığa (açık çubuk) tam hücreli voltaj sıkıştırmalı kuantum darbe tepkileri. InaC P209 ve inaD P215 mutantlarında WT sineklerine göre darbelerin yavaş yavaş sonlandırılması gözlemlenir. Aşağıdaki ilaveler, tek dirseklerin büyütülmüş şeklini görüntüler. Alt paneller: Yukarıdaki vahşi türün 500-ms&#39;lik bir ışık darbesine (1.5 x 105 foton / s) normalleştirilmiş tam hücreli makroskopik tepkiler<html> Ve mutant sinekler. (EG) Üst paneller: Vahşi tip, arr2 3 ve ninaC P235 mutant sineklerde tek foton yanıtları ortaya çıkaran kısa (1 ms), loş ışıkta tam hücreli voltaj sıkıştırmalı kuantum çarpma tepkileri. Arr2 3 ve ninaC P235 mutantlarında gözlemlenen darbenin trenini tek bir foton emilimine tepki olarak not edin. Alt paneller: Karşılık gelen mutantlarda 500 ms ışık pulsuna (1.5 x 104 foton / s) tam hücreli voltaj sıkıştırmalı normalleştirilmiş tepkiler. Arr2&#39;de gözlenen makroskopik tepkilerin yavaş sonlandırılmasına dikkat edin 3 Ve ninaC P235 mutant WT&#39;ye göre uçar. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> D / 55627 / 55627fig4.jpg &quot;/&gt; Şekil 4: Sinyal ile indüklenen Ca 2+ Akışı Takip Eden Hücresel Ca 2+ Dinamiği, Calphotin&#39;den etkilenir. Işık uyarımı sırasında Ca 2+ göstergesinin flüoresansını gösteren vahşi tipli ve Cpn % 1&#39;lik fotoreptör görüntülerin bir zaman dizisi. Ham yoğunluk görüntüleri sahte renk kodlaması kullanılarak çizilir (çubuk = 10 μm; ok uçları pipete işaret eder). Şekil, Weiss ve diğerlerinin izniyle tekrar basıldı . 4 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig5.jpg" /> Şekil 5: WT, trp ve trpl Mutantlarının Elektrofizyolojik Özellikleri. ( A ) Tam Hücreli voltaj kelepçesi recoWT, trpl 302 ve trp P343 boş mutant sineklerde sürekli loş ışığa (açık çubuk) yanıt olarak kuantum darbe sayısı. Trp P34 3 darbelerinin oldukça azaltılmış amplitütleri gözlemlenir. Inset: Yabanıl tip ve trp P343 boş mutant sineklerin büyütülmüş tek kuantum darbeleri gösterilmiştir . ( B ) Yabani tipin ve ilgili mutantların 3 saniyelik ışık darbesine yanıt olarak tüm hücre voltaj kelepçesi kayıtları. Trp P343 mutantının geçici kararlı durum yanıtı gözlemlenir . Başlangıç: WT ve trp P343 mutantlarının büyütülmüş ışık yanıtları gösterilmiştir. ( C ) Yukarıdaki sinek suşlarının ışıkla indüklenen akıntılarının bir ailesi, ters potansiyel (E devir ) etrafında ölçülen 3 mV&#39;luk voltaj adımlarında 20 ms&#39;lik bir ışık darbesine yanıt olarak ortaya çıkmıştır. ( D ) Vahşi türün ve çeşitli mutanların ortalama E rev&#39;sini gösteren bir histogramts. Hata çubukları SEM&#39;dir WT&#39;nin geri dönüş potansiyeli (E rev ), yalnızca TRP&#39;yi ifade eden trpl 302&#39;nin pozitif E rev değeri ile yalnızca TRPL&#39;yi ifade eden trp P343 boş mutantın E rev&#39;idir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6" src="/files/ftp_upload/55627/55627fig6.jpg" /> Şekil 6: Işık Yoğunluğu Artan Işık Tepkisi Kesinlikle Doğrusaltır. Artan ışık yoğunluğunun kısa süreli yanıp sönmeye karşı bir dizi güncel yanıt ve kısa yanıp sönen ışık yoğunluğuna ışık tepkisinin tepe amplitüdünün bağımlılığının bir çizimi. Bu ilişki, flaş tepkisi ile artan ışık yoğunluğu arasında katı bir doğrusallık ortaya koymaktadır. Bu katı doğrusallıkDoğrusallık mı yoksa sonradan kırılan kelepçe kontrolü olup olmadığı tartışılabilir iken, ışık şiddeti 4 dereceden fazla alanla en az yüz pA kadar tutmaktadır. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55627/55627fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15 (NaOH ile ayarlanır) </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Konsantrasyon (mM) </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> KCl </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> Proline </td><td> 25 </td></tr><tr><td> alanin </td><td> 5 </td></tr><tr><td></td><td> -20 ° C&#39;de saklayın. </td></tr><tr><td colspan= &quot;2&quot;&gt; Not: Bu çözüm nominal olarak Ca 2+ içermez ancak Ca 2+ tamponları eklenmez ve dolayısıyla yaklaşık 5 - 10 μM iz Ca 2+ olacaktır. Ekstraselüler çözelti (ES) = 0.5 veya 1 M stok solüsyonundan CaCl2&#39;yi ES-0Ca 2+&#39; ye ekleyerek yapılan 1.5 mM CaCl2 ile ES-0Ca 2+ . </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Ca +2 içermeyen Ekstrasellüler Solüsyon (ES). Kimyasal tanımlama ve Ca +2 içermeyen ES üretmek için gereken spesifik miktarlar. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> reaktif </td><td> Tutar </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 15 mL </td></tr><tr><td> sakaroz </td><td> 1.5 g </td></tr><tr><td colspan="2"> 1.5 mL&#39;lik şişelerde 150 uL&#39;lik alikotlara bölün ve -20 ° C&#39;de saklayın 76 ° C. </td></tr><tr><td> Toz haline getirme çözeltisi (TS) </td><td> Diseksiyon sırasında kullanılan çözeltiyle eşleşecek şekilde, stok solüsyonunun 150 mL&#39;sinin 1 şişesini 1.350 mL ES veya ES-0Ca 2+ ile doldurun. </td></tr></tbody></table> Tablo 2: Fetal Sığır Serumu (FBS) + Sakroz - Stok Çözeltisi. Kimyasal tanımlama ve fetüs sığırı serumu (FBS) + sakaroz stok solüsyonu üretmek için gereken spesifik miktarlar. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15 (KOH ile ayarlayın) </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Konsantrasyon (mM) </td></tr><tr><td> Potasyum glukonat (Kglu) </td><td> 140 </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATP magnezyum tuzu (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTP sodyum tuzu (Na2GTP) </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Β-Nicotinamid adenin dinükleotid hidrat (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td></td><td> -20 ° C&#39;de saklayın. </td></tr></tbody></table> Tablo 3: Hücre içi çözelti (IS1). Kimyasal tanımlama ve çoğunlukla yoğunluk yanıtı ve kuantum darbe ölçümleri için kullanılan IS1 üretmek için gereken spesifik miktarlar. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> pH </td><td> 7.15 (CsOH ile ayarlanır) </td></tr><tr><td> reaktif </td><td> Konsantrasyon (mM) </td></tr><tr><td> CsCl </td><td> 120 </td></tr><tr><td> MgCI2 </td><td> 2 </td></tr><tr><td> TES </td><td> 10 </td></tr><tr><td> ATP magnezyum tuzu (MgATP) </td><td> 4 </td></tr><tr><td> GTP sodyum tuzu (Na2GTP) </td><td> 0.4 </td></tr><tr><td> Β-Nicotinamid adenin dinükleotid hidrat (NAD) </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Tetra-etil-amonyum klorür (TAE) </td><td> 15 </td></tr><tr><td></td><td> -20 ° C&#39;de saklayın. </td></tr></tbody></table> Tablo 4: Hücre içi çözelti (IS2). Kimyasal tanımlama ve çoğunlukla ışık kaynaklı akımın ters potansiyel ölçümleri için kullanılan Hücre içi Çözüm IS2&#39;yi üretmek için gereken spesifik miktarlar.

Watch this Scientific Journal Video about Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors at JoVE.com

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Drosophila melanogaster fotoreptörlerinden alınan bütün hücreli kayıtlar, çeşitli koşullar altında kendiliğinden oluşan karanlık yumruları, kuantum darbeleri, ışığa karşı makroskopik tepkileri ve akım-voltaj ilişkilerini ölçebilir. D. melanogaster genetik manipülasyon araçları ile birlikte bu yöntem, her yerde bulunan inositol-lipid sinyal yolunu ve TRP kanalının hedefini incelemeyi mümkün kılar.

Tam Hücreli Gerilim Kelepçesi Kayıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</emPhotoreceptors

Whole-cell voltage clamp recordings from Drosophila melanogaster photoreceptors have revolutionized the field of invertebrate visual transduction, ...

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Electrophysiological Method for Whole-cell Voltage Clamp Recordings from Drosophila Photoreceptors

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Electrophysiological Recordings from the Giant Fiber Pathway of D. melanogaster

Dev Fiber Pathway Elektrofizyolojik Kayıtlar D. melanogaster</em

When startled adult D. melanogaster react by jumping into the air and flying away. In many invertebrate species, including D. melanogaster, the "escape" ...

Simultaneous Whole-cell Recordings from Photoreceptors and Second-order Neurons in an Amphibian Retinal Slice Preparation

Bir Amfibi Retina Dilim hazırlanması Fotoreseptörler ve İkinci dereceden nöronlar eş zamanlı tam hücreli Kayıtlar

One of the central tasks in retinal neuroscience  is to understand the circuitry of retinal neurons and how those connections are  responsible for shaping ...

Whole Cell Patch Clamp for Investigating the Mechanisms of Infrared Neural Stimulation

Kızılötesi Sinir Stimülasyon en mekanizmaları incelenmesi için tüm Hücre Patch Kelepçe

It has been  demonstrated in recent years that pulsed, infrared laser light can be used to  elicit electrical responses in neural tissue, independent of ...

Patch Clamp Recordings from Embryonic Zebrafish Mauthner Cells

Embriyonik Zebra balığı Mauthner Hücreler Patch Kelepçe Kayıtlar

Mauthner cells (M-cells) are large  reticulospinal neurons located in the hindbrain of teleost fish. They are key  neurons involved in a characteristic ...

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

Electrophysiological Recording From Drosophila Labellar Taste Sensilla

Elektrofizyolojik Kayıt<em&gt; Drosophila</em&gt; Labellar Sensilla Taste

The peripheral taste response of insects can be powerfully investigated with electrophysiological techniques. The method described here allows the ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings from Morphologically- and Neurochemically-identified Hippocampal Interneurons

Morphologically- ve nörokimyasal tanımlanan hipokampal internöronlardan gelen tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

GABAergic inhibitory interneurons play a central role within neuronal circuits of the brain. Interneurons comprise a small subset of the neuronal ...

Paired Whole Cell Recordings in Organotypic Hippocampal Slices

Organotipik Hipokampal Dilimleri eşleştirilmiş Tüm Hücre Kayıtlar

Pair recordings involve simultaneous whole cell patch clamp recordings from two synaptically connected neurons, enabling not only direct ...

Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings

Akut Beyin Dilimleri nöronal Mikro şemalar Elektrofizyolojik ve Morfolojik Karakterizasyonu Eşleştirilmiş Patch-Kelepçe Kayıtlar Kullanma

The combination of patch clamp recordings from two (or more) synaptically coupled neurons (paired recordings) in acute brain slice preparations with ...

Whole-cell Patch-clamp Recordings in Brain Slices

Beyin Dilimleri tüm hücre Patch-kelepçe Kayıtlar

Whole-cell patch-clamp recording is an electrophysiological technique that allows the study of the&#160;electrical properties of a substantial part of the ...

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Electrophysiological Method for Recording Intracellular Voltage Responses of Drosophila Photoreceptors and Interneurons to Light Stimuli In Vivo

Recording Hücre içi Gerilim Yanıtları için Elektrofizyolojik Yöntem<em&gt; Drosophila</em&gt; Işık Uyaranların için Fotoreseptörler ve internöronlar<em&gt; İn Vivo</em