Name: in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem
Uploaded: 2017-06-09T13:00:00
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Wir danken Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria und Frau Ximena Optiz-Araya für die erste Unterstützung bei der Protokollierung und zur Bereitstellung von Plasmiden. Diese Arbeit wurde von NIH / NIDCD Grant DC013841 (JTS) unterstützt.

Alle Verfahren wurden von Northwestern University Institutional Animal Care und Use Committees genehmigt und durchgeführt in Übereinstimmung mit den National Institutes of Health Guidelines für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Eierbearbeitung <ol><li> Kaufen Sie befruchtete Eier von einem örtlichen Verkäufer. Eier bei 13 ° C im Kühlschrank für höchstens 5 Tage vor der Inkubation aufbewahren. Die Embryo-Lebensfähigkeit verringert sich nach 1 Woche deutlich. </li><li> ...

<ol>
	<li>Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sound+localization+in+mammals.">Mechanisms of sound localization in mammals.</a> Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).</li><li>Anderson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+timing+is+linked+to+speech+perception+in+noise.">Neural timing is linked to speech perception in noise.</a> J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).</li><li>Shannon, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speech+recognition+with+primarily+temporal+cues.">Speech recognition with primarily temporal cues.</a> Science. 270 (5234), 303-304 (1995).</li><li>Carr, C. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. (8), e306 (2007).</li><li>Sanchez, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+culture+of+chicken+auditory+brainstem+slices.">Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li><li>Jhaveri, S., Morest, D. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+interaural+time+differences+in+the+chick+brain+stem.">The analysis of interaural time differences in the chick brain stem.</a> Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).</li><li>Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+hearing+in+the+chicken+embryo.">Emergence of hearing in the chicken embryo.</a> J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).</li><li>Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. 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In ovo Elektroporation ist eine Methode zur Expression oder Klopfen von Genen von Interesse, um in vivo Gen-Funktion 8 , 9 zu analysieren. Im Hühnerembryo ist es eine innovative Methode zur Expression von Plasmid-codierten Genen in verschiedene akustische Hirnstammregionen 8 . Um einen optimalen Ausdruck zu gewährleisten, sind mehrere kritische Schritte erforderlich. Zuerst nur Embryonen injizieren, deren Otozysten deu...

Eine schnelle neuronale Kodierung von Klängen ist für normale Hörfunktionen unerlässlich. Dazu gehören die Klanglokalisierungsfähigkeiten 1 , die Sprache in der Rauschunterscheidung 2 und das Verständnis anderer verhaltensrelevanter Kommunikationssignale 3 . Analoge Neuronen, die sich im auditorischen Hirnstamm von Vogel und Säugetieren befinden, sind hochspezialisiert für eine schnelle neuronale Kodierung 4 . Dazu gehören der Hühnerkern Magnocellularis (NM), der Nucleus laminaris (NL) und deren Säugetieranaloga, der anteroventrale Cochlearkern (AVCN) und der mediale Superior Olive (MSO) bzw. 5 . Allerdings sind Entwicklungsmechanismen, die eine schnelle neuronale Kodierung regulieren, im auditorischen Hirnstamm schlecht verstanden. Daher ist es vorteilhaft, spezifische Gene zu studieren, die für eine schnelle neuronale Kodierung verantwortlich sind, um ihren Ausdruck, ihre Regulierung und ihre Funktion in au zu verstehenDitory Entwicklung. Der Entwicklung von Hühnerembryo ist ein wirksames und etabliertes Forschungsinstrument, um grundlegende biologische Fragen der auditorischen Systementwicklung zu untersuchen 6 , 7 . Jüngste molekulare Fortschritte haben diese biologischen Fragen in den sich entwickelnden Hühnerembryo durch Ausdrücken oder Klopfen von Genen von Interesse, um in vivo Gen-Funktion 8 , 9 zu analysieren. Die Untersuchung der regulatorischen Rolle von spezifischen Genen ist ein wichtiger Fortschritt beim Verständnis von Pathologien im Zusammenhang mit akustischen Defiziten. Hier präsentieren wir in der Ovo- Elektroporation von Plasmid-codierten Genen in den Hühner-Hirnstamm, wo eine schnelle neuronale Kodierung des Klangs auftritt 10 . Durch die Ausrichtung auf auditorische neuronale Vorläuferregionen, die mit den Rhombomeren 5 und 6, 11 , 12 (R5 /R6) zeigen wir die räumliche Kontrolle der Plasmid-Transfektion in NM und NL. Darüber hinaus zeigen wir eine zeitliche Regulierung des Ausdrucks durch die Annahme eines Tet-on-Vektorsystems. Dies ist ein Arzneimittel-induzierbares Verfahren, das die interessierenden Gene in Gegenwart von Doxycyclin (Dox) 8 exprimiert.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn chicken eggs</td>
			<td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td>Picospritzer III, single or dual channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current/voltage stimulator</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>SD9</td>
			<td>SD9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil syringe needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF28G67-5</td>
			<td>28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1280</td>
			<td>MP Series: Non-Electrical Pressure Applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulating microelectrode</td>
			<td>FHC</td>
			<td>PBSA1075</td>
			<td>PBSA1075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air tank/regulator</td>
			<td>NU Laboratory Services</td>
			<td></td>
			<td>Air dry 300 CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>F7258-25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear plastic tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg refrigerator</td>
			<td>Vissani Wine Refrigerator</td>
			<td></td>
			<td>13.3-16.1&#176; C (56-61&#176; F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Hova-Bator</td>
			<td></td>
			<td>37.8&#176; C (100&#176; F), ~50% humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.35E+15</td>
			<td>SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold-light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.36E+15</td>
			<td>CL6000 LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model: MM-3</td>
			<td>2 Micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td>Thick-walled borosilicate (dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD Precision Glide&#160;</td>
			<td></td>
			<td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>No. 5 Super Fine Dumont</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg holder</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td></td>
			<td>Clay base works as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td>Model P-97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Ultra Cruz</td>
			<td>sc-358811</td>
			<td>PVDF 0.22 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem

Elektroporation ist eine Methode, die interessante Gene in biologisch relevante Organismen wie den Hühnerembryo einführt. Es ist lange festzustellen, dass der Hühnerembryo ein wirksames Forschungsmodell für das Studium der grundlegenden biologischen Funktionen der auditorischen Systementwicklung ist. In jüngster Zeit ist der Hühnerembryo besonders wertvoll bei der Untersuchung von Genexpression, Regulation und Funktion, die mit dem Hören verbunden ist. In ovo Elektroporation kann verwendet werden, um auditorische Hirnstammregionen zu bestimmen, die für hochspezialisierte auditive Funktionen verantwortlich sind. Zu diesen Regionen gehören der Hühnerkern Magnozellularis (NM) und der Kernlaminaris (NL). NM- und NL-Neuronen entstehen aus verschiedenen Vorläufern der Rhombomere 5 und 6 (R5 / R6). Hier präsentieren wir in der Ovo- Elektroporation von Plasmid-codierten Genen, um gen-bezogene Eigenschaften in diesen Regionen zu untersuchen. Wir zeigen eine Methode zur räumlichen und zeitlichen Kontrolle der Genexpression, die entweder Gewinn oder Verlust des funktionellen Phänotyps fördernEs Durch die Ausrichtung auf auditorische neuronale Progenitorregionen, die mit R5 / R6 assoziiert sind, zeigen wir die Plasmid-Transfektion in NM und NL. Die zeitliche Regulation der Genexpression kann durch die Annahme eines Tet-on-Vektorsystems erreicht werden. Dies ist ein Arzneimittel-induzierbares Verfahren, das die interessierenden Gene in Gegenwart von Doxycyclin (Dox) exprimiert. Die in ovo- Elektroporationstechnik - zusammen mit biochemischen, pharmakologischen und oder in vivo funktionellen Assays - bietet einen innovativen Ansatz zur Untersuchung der auditorischen Neuronenentwicklung und der damit verbundenen pathophysiologischen Phänomene.

Wir zeigen hier, dass in ovo Elektroporation die Genexpression in einem normal sich entwickelnden biologischen System erlaubt. Plasmid-codierte Gene werden fokal in das Neuralrohr injiziert, das über R5 / R6 liegt. Ein schematisches Beispiel für die Elektroden- und Pipettenplatzierungen relativ zu wichtigen anatomischen Markern ist in Fig. 1A gezeigt . Die korrekte Position der Plasmidinjektion wird 24 h nach der Elektroporation bestätigt und in 1B ge...

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In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Auditorische Hirnstamm Neuronen von Vogel und Säugetiere sind spezialisiert auf schnelle neuronale Kodierung, ein grundlegendes Verfahren für normale Hörfunktionen. Diese Neuronen entstehen aus verschiedenen Vorläufern des embryonalen Hinterhirns. Wir präsentieren Techniken, die die Elektroporation verwenden, um Gene im Hirnhirn von Hühnerembryonen zu exprimieren, um die Genfunktion während der auditorischen Entwicklung zu untersuchen.

In Ovo Electroporation im Hühnchen auditorischen Hirnstamm

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effizienten Gentransfer in Küken Netzhäute für primäre Zellkulturstudien: Eine<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Elektroporation Ansatz

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Forschung

Entwicklungsbiologie

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse von Zebrafisch-Larven Skelettmuskel Integrität mit Evans Blue Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Whole Retinal Explantaten aus Hühnerembryonen für die Elektroporation und Reagens-Behandlungen

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gentransfer in das Huhn Hörorgan von<em&gt; In Ovo</em&gt; Micro-Elektroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

Ein Roman<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banding-Technik intrakardialer Hämodynamik in einem embryonalen Hühner System ändern

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Mikroinjektions und Elektroporation in der bei Chor<em&gt; Schlauchseescheide</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissektion, Immunofluorescent Färbung der Pilz Körper und Photorezeptor Neuronen im Gehirn Erwachsener Taufliege melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Dreidimensionale organotypischen Kulturen der vestibulären und akustische Sinnesorgane

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

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Visualisierung der Knoten und Notochordal Platte In Gastrulating Maus-Embryonen mittels Rasterelektronenmikroskopie und ganze Mount Immunfluoreszenz

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Electroporation-mediated RNA Interference Method in Odonata

Elektroporationsvermittelte RNA-Interferenzmethode in Odonata

Dragonflies and damselflies (order Odonata) represent one of the most ancestral insects with metamorphosis, in which they change their habitat, ...