Name: in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem
Uploaded: 2017-06-09T13:00:00
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우리는 Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria 및 Mrs. Ximena Optiz-Araya와 협력하여 프로토콜 설정 및 플라스미드 제공에 대한 초기 지원을 받았습니다. 이 작품은 NIH / NIDCD 교부금 DC013841 (JTS)에 의해 지원되었다.

모든 절차는 노스 웨스턴 대학교 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받아 실험실 동물의 관리 및 사용에 관한 보건 지침의 국립 연구소 (National Institutes of Health Guidelines)에 따라 수행되었습니다. 1. 계란 취급 <ol><li> 현지 판매 업체에서 수정란을 구입하십시오. 배양 전 5 일 이내에 냉장고에 13 ° C로 계란을 저장하십시오. 배아 생존율은 1 주일 후에 현저히 감소합니다. <...

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	<li>Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sound+localization+in+mammals.">Mechanisms of sound localization in mammals.</a> Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).</li><li>Anderson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+timing+is+linked+to+speech+perception+in+noise.">Neural timing is linked to speech perception in noise.</a> J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).</li><li>Shannon, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speech+recognition+with+primarily+temporal+cues.">Speech recognition with primarily temporal cues.</a> Science. 270 (5234), 303-304 (1995).</li><li>Carr, C. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis.">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li><li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo.">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).</li><li>Oertel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+of+timing+in+the+brain+stem+auditory+nuclei+of+vertebrates.">Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates.</a> Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).</li><li>Cramer, K. 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S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. (8), e306 (2007).</li><li>Sanchez, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+culture+of+chicken+auditory+brainstem+slices.">Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li><li>Jhaveri, S., Morest, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+architecture+in+nucleus+magnocellularis+of+the+chicken+auditory+system+with+observations+on+nucleus+laminaris:+a+light+and+electron+microscope+study.">Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study.</a> Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).</li><li>Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+adeno-associated+virus+vector+efficiently+transduces+neurons+in+the+embryonic+and+post-embryonic+chicken+brain.">Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain.</a> PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).</li><li>Koppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+nerve+terminals+in+the+cochlear+nucleus+magnocellularis:+differences+between+low+and+high+frequencies.">Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies.</a> J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).</li><li>Hyson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+interaural+time+differences+in+the+chick+brain+stem.">The analysis of interaural time differences in the chick brain stem.</a> Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).</li><li>Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+hearing+in+the+chicken+embryo.">Emergence of hearing in the chicken embryo.</a> J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).</li><li>Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+auditory+evoked+responses+in+the+cochlea+and+cochlear+nuclei+of+the+chick.">The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick.</a> Brain Res. 63, 59-74 (1973).</li><li>Woolf, N. K., Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+auditory+function+in+the+cochlea+of+the+mongolian+gerbil.">The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil.</a> Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).</li><li>Walsh, E. J., McGee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+auditory+nerve+and+cochlear+nucleus+neuronal+responses+in+kittens.">Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens.</a> Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).</li><li>Uziel, A., Romand, R., Marot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cochlear+potentials+in+rats.">Development of cochlear potentials in rats.</a> Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).</li></ol>

비켜에서 electroporation는 생체 내 유전자 기능 8 , 9 를 분석하기 위해 관심 유전자를 표현하거나 노크하는 방법입니다. 닭 배아에서, 그것은 다른 청각 brainstem 지역 8 로 플라스미드 인코딩 유전자를 표현하기위한 혁신적인 방법입니다. 최적의 발현을 위해서는 몇 가지 중요한 단계가 필요합니다. 첫째, otocysts 명확하게 볼 ...

소리의 빠른 신경 부호화는 정상적인 청각 기능에 필수적입니다. 여기에는 음향 국소화 능력 1 , 잡음 차별 2 에서의 발언 및 다른 행동 관련 통신 신호 이해 3이 포함 됩니다. 조류와 포유류 모두의 청각 뇌간에 위치한 유사 뉴런은 빠른 신경 엔코딩을 전문으로합니다 4 . 이들은 닭 핵 magnocellularis (NM), 핵 laminaris (NL) 및 그들의 포유류 유사체, anteroventral 달팽이관 핵 (AVCN) 및 중간 우수한 올리브 (MSO), 각각 5 . 그러나, 빠른 신경 부호화를 조절하는 발달 기전은 청각 뇌간에서 잘 이해되지 못한다. 따라서 au에서 발현, 조절 및 기능을 더 잘 이해하기 위해서는 빠른 신경 엔코딩을 담당하는 특정 유전자를 연구하는 것이 유리하다ditory 개발. 개발중인 닭 배아는 청각 시스템 개발의 기본 생물학적 질문을 연구하는 효과적이고 잘 정립 된 연구 도구이다. 최근의 분자 진보는 생체 내 유전자 기능 8 , 9 을 분석하기 위해 관심있는 유전자를 발현하거나 파괴함으로써 닭 배아를 개발하는 생물학적 문제를 해결했습니다. 특정 유전자의 규제 역할을 조사하는 것은 청각 적 결핍과 관련된 병리학을 이해하는 데 중요한 진보입니다. 여기, 우리는 빠른 신경의 소리의 인코딩이 발생 치킨 청각 brainstem에 플라스미드 인코딩 유전자의 비켜 electroporation에 제시 10 . rhombomeres 5 및 6과 관련된 청각 신경 전구 영역을 표적으로함으로써 11 , 12 (R5 /R6), NM 및 NL에서 플라스미드 형질 감염의 공간 제어를 나타낸다. 또한, tet-on 벡터 시스템을 채택하여 표현의 시간적 조절을 보여줍니다. 이것은 doxycycline (Dox) 8 의 존재하에 관심 유전자를 표현하는 약물 유도 과정입니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn chicken eggs</td>
			<td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td>Picospritzer III, single or dual channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current/voltage stimulator</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>SD9</td>
			<td>SD9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil syringe needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF28G67-5</td>
			<td>28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1280</td>
			<td>MP Series: Non-Electrical Pressure Applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulating microelectrode</td>
			<td>FHC</td>
			<td>PBSA1075</td>
			<td>PBSA1075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air tank/regulator</td>
			<td>NU Laboratory Services</td>
			<td></td>
			<td>Air dry 300 CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>F7258-25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear plastic tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg refrigerator</td>
			<td>Vissani Wine Refrigerator</td>
			<td></td>
			<td>13.3-16.1&#176; C (56-61&#176; F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Hova-Bator</td>
			<td></td>
			<td>37.8&#176; C (100&#176; F), ~50% humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.35E+15</td>
			<td>SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold-light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.36E+15</td>
			<td>CL6000 LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model: MM-3</td>
			<td>2 Micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td>Thick-walled borosilicate (dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD Precision Glide&#160;</td>
			<td></td>
			<td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>No. 5 Super Fine Dumont</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg holder</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td></td>
			<td>Clay base works as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td>Model P-97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Ultra Cruz</td>
			<td>sc-358811</td>
			<td>PVDF 0.22 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem

일렉트로 포 레이션 (Electroporation)은 닭 배아와 같은 생물학적으로 관련된 생물체에 관심있는 유전자를 도입하는 방법입니다. 닭 배아는 청각 시스템 개발의 기본적인 생물학적 기능을 연구하기위한 효과적인 연구 모델이라는 것이 오랫동안 입증되어왔다. 보다 최근에, 닭 배아는 청력과 관련된 유전자 발현, 조절 및 기능을 연구하는데 특히 중요하게되었다. 귓볼에서 일렉트로 포 레이션은 고도로 전문화 된 청각 기능을 담당하는 청각 뇌간 영역을 표적으로하는 데 사용될 수 있습니다. 이 지역은 닭 핵 magnocellularis (NM)과 핵 laminaris (NL)을 포함합니다. NM 및 NL 뉴런은 rhombomeres 5 및 6 (R5 / R6)의 별개의 전구체로부터 발생합니다. 여기, 우리는이 지역에서 유전자 관련 특성을 연구하기 위해 플라스미드로 암호화 된 유전자의 비켜 일렉트로 포 레이션을 제시한다. 우리는 기능적 표현형의 증가 또는 감소를 촉진시키는 유전자 발현의 공간적 및 일시적 제어 방법을 제시한다es. R5 / R6와 연관된 청각 신경 전구 영역을 표적으로함으로써, 우리는 NM 및 NL에서 플라스미드 형질 감염을 나타낸다. 유전자 발현의 일시적인 조절은 tet-on 벡터 시스템을 채택함으로써 성취 될 수있다. 이것은 doxycycline (Dox)의 존재하에 관심 유전자를 표현하는 약물 유도 과정입니다. 생체 화학, 약리학 및 생체 내 기능 분석과 함께 in ovo electroporation 기술은 청각 신경 세포 발달 및 관련 병리 생리 현상을 연구하는 혁신적인 방법을 제공합니다.

우리는 비켜 일렉트로 포 레이션에서 정상적으로 발전하는 생물계에서 유전자 발현이 가능하다는 것을 보여줍니다. 플라스미드 - 코딩 유전자는 R5 / R6 위에있는 신경 튜브에 국소 적으로 주사된다. 중요한 해부학 적 마커와 관련된 전극 및 피펫 배치의 개략적 인 예가 그림 1A 에 나와 있습니다. 플라스미드 주사의 정확한 위치는 electroporati...

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In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

조류와 포유류의 청각 뇌간 신경은 빠른 청력 엔코딩에 특화되어있어 정상적인 청력 기능을위한 기본적인 과정입니다. 이러한 뉴런은 배아 뒷다리의 뚜렷한 전구체에서 발생합니다. 우리는 청각 발달 과정에서 유전자 기능을 연구하기 위해 닭 배아의 뒷배부에 유전자를 발현시키기 위해 일렉트로 포 레이션을 이용하는 기술을 제시한다.

닭 오라클 Brainstem의 Ovo Electroporation에서

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

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차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 :<em&gt; 전 비켜</em&gt; Electroporation에 접근

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

연구

발생학

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

에반스 블루 염료와 Zebrafish의 애벌레 골격 근육 무결성 분석

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

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일렉트로 화학 시약 트리트먼트의 닭 배아에서 전체 망막의 Explants

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

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치킨 청각 기관에 유전자 전달에 의한<em&gt; 비켜에서</em&gt; 마이크로 전기

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

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소설<em&gt; 예 비켜</em&gt; 밴딩 기법 닭 배아 시스템에서 심장 내 혈류를 변경할

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척색에서 배아 미세 주입 및 Electroporation에<em&gt; Ciona intestinalis의</em

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The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

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노드 및 스캐닝 전자 현미경 검사 법, 면역 형광 산 전체를 사용 하 여 Gastrulating 마우스 배아에서 Notochordal 접시를 시각화

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Electroporation-mediated RNA Interference Method in Odonata

오도나타에서 전기 기화 매개 RNA 간섭 방법

Dragonflies and damselflies (order Odonata) represent one of the most ancestral insects with metamorphosis, in which they change their habitat, ...