Name: in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem
Uploaded: 2017-06-09T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem at JoVE.com

Vi vil gjerne takke Drs. Leslayann Schecterson, Yuan Wang, Andres Barria og Fru Ximena Optiz-Araya for førstehjelp med protokolloppsett og for å levere plasmider. Dette arbeidet ble støttet av NIH / NIDCD grant DC013841 (JTS).

Alle prosedyrer ble godkjent av Institutt for dyrepleie og brukskomiteer fra Northwestern University, og utført i samsvar med National Institutes of Health Retningslinjer for pleie og bruk av laboratoriedyr. 1. Egghåndtering <ol><li> Kjøpt befruktet egg fra en lokal leverandør. Oppbevar egg ved 13 ° C i kjøleskap i ikke mer enn 5 dager før inkubering. Livskraften i embryoen minker betydelig etter 1 uke. </li><li> Vask hvert egg med 70% etanol før du setter inn i inkubatoren. </li><...

<ol>
	<li>Grothe, B., Pecka, M., McAlpine, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+sound+localization+in+mammals.">Mechanisms of sound localization in mammals.</a> Physiol Rev. 90 (3), 983-1012 (2010).</li><li>Anderson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+timing+is+linked+to+speech+perception+in+noise.">Neural timing is linked to speech perception in noise.</a> J Neurosci. 30 (14), 4922-4926 (2010).</li><li>Shannon, R. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Speech+recognition+with+primarily+temporal+cues.">Speech recognition with primarily temporal cues.</a> Science. 270 (5234), 303-304 (1995).</li><li>Carr, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolution+and+development+of+time+coding+systems.">Evolution and development of time coding systems.</a> Curr Opin Neurobiol. 11 (6), 727-733 (2001).</li><li>Carr, C. E., Soares, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+convergence+and+shared+computational+principles+in+the+auditory+system.">Evolutionary convergence and shared computational principles in the auditory system.</a> Brain Behav Evol. 59 (5-6), 294-311 (2002).</li><li>Rubel, E. W., Parks, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken:+tonotopic+organization+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris.">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: tonotopic organization of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 164 (4), 411-433 (1975).</li><li>Rubel, E. W., Smith, D. J., Miller, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Organization+and+development+of+brain+stem+auditory+nuclei+of+the+chicken:+ontogeny+of+n.+magnocellularis+and+n.+laminaris.">Organization and development of brain stem auditory nuclei of the chicken: ontogeny of n. magnocellularis and n. laminaris.</a> J Comp Neurol. 166 (4), 469-489 (1976).</li><li>Schecterson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TrkB+downregulation+is+required+for+dendrite+retraction+in+developing+neurons+of+chicken+nucleus+magnocellularis.">TrkB downregulation is required for dendrite retraction in developing neurons of chicken nucleus magnocellularis.</a> J Neurosci. 32 (40), 14000-14009 (2012).</li><li>Chesnutt, C., Niswander, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmid-based+short-hairpin+RNA+interference+in+the+chicken+embryo.">Plasmid-based short-hairpin RNA interference in the chicken embryo.</a> Genesis. 39 (2), 73-78 (2004).</li><li>Oertel, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encoding+of+timing+in+the+brain+stem+auditory+nuclei+of+vertebrates.">Encoding of timing in the brain stem auditory nuclei of vertebrates.</a> Neuron. 19 (5), 959-962 (1997).</li><li>Cramer, K. S., Fraser, S. E., Rubel, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+origins+of+auditory+brain-stem+nuclei+in+the+chick+hindbrain.">Embryonic origins of auditory brain-stem nuclei in the chick hindbrain.</a> Dev Biol. 224 (2), 138-151 (2000).</li><li>Cramer, K. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EphA4+signaling+promotes+axon+segregation+in+the+developing+auditory+system.">EphA4 signaling promotes axon segregation in the developing auditory system.</a> Dev Biol. 269 (1), 26-35 (2004).</li><li>Korn, M. J., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Windowing+chicken+eggs+for+developmental+studies.">Windowing chicken eggs for developmental studies.</a> J Vis Exp. (8), e306 (2007).</li><li>Sanchez, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+and+culture+of+chicken+auditory+brainstem+slices.">Preparation and culture of chicken auditory brainstem slices.</a> J Vis Exp. (49), (2011).</li><li>Jhaveri, S., Morest, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+architecture+in+nucleus+magnocellularis+of+the+chicken+auditory+system+with+observations+on+nucleus+laminaris:+a+light+and+electron+microscope+study.">Neuronal architecture in nucleus magnocellularis of the chicken auditory system with observations on nucleus laminaris: a light and electron microscope study.</a> Neuroscience. 7 (4), 809-836 (1982).</li><li>Matsui, R., Tanabe, Y., Watanabe, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Avian+adeno-associated+virus+vector+efficiently+transduces+neurons+in+the+embryonic+and+post-embryonic+chicken+brain.">Avian adeno-associated virus vector efficiently transduces neurons in the embryonic and post-embryonic chicken brain.</a> PLoS One. 7 (11), e48730 (2012).</li><li>Koppl, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Auditory+nerve+terminals+in+the+cochlear+nucleus+magnocellularis:+differences+between+low+and+high+frequencies.">Auditory nerve terminals in the cochlear nucleus magnocellularis: differences between low and high frequencies.</a> J Comp Neurol. 339 (3), 438-446 (1994).</li><li>Hyson, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+analysis+of+interaural+time+differences+in+the+chick+brain+stem.">The analysis of interaural time differences in the chick brain stem.</a> Physiol Behav. 86 (3), 297-305 (2005).</li><li>Jones, T. A., Jones, S. M., Paggett, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emergence+of+hearing+in+the+chicken+embryo.">Emergence of hearing in the chicken embryo.</a> J Neurophysiol. 96 (1), 128-141 (2006).</li><li>Saunders, J. C., Coles, R. B., Gates, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+auditory+evoked+responses+in+the+cochlea+and+cochlear+nuclei+of+the+chick.">The development of auditory evoked responses in the cochlea and cochlear nuclei of the chick.</a> Brain Res. 63, 59-74 (1973).</li><li>Woolf, N. K., Ryan, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+development+of+auditory+function+in+the+cochlea+of+the+mongolian+gerbil.">The development of auditory function in the cochlea of the mongolian gerbil.</a> Hear Res. 13 (3), 277-283 (1984).</li><li>Walsh, E. J., McGee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Postnatal+development+of+auditory+nerve+and+cochlear+nucleus+neuronal+responses+in+kittens.">Postnatal development of auditory nerve and cochlear nucleus neuronal responses in kittens.</a> Hear Res. 28 (1), 97-116 (1987).</li><li>Uziel, A., Romand, R., Marot, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+cochlear+potentials+in+rats.">Development of cochlear potentials in rats.</a> Audiology. 20 (2), 89-100 (1981).</li></ol>

I ovo elektroporation er en metode for å uttrykke eller slå ned gener av interesse for å analysere in vivo genfunksjon 8 , 9 . I kyllingembryoen er det en nyskapende metode for å uttrykke plasmidkodede gener i forskjellige auditive hjernestammeområder 8 . For å sikre optimal uttrykk, er det nødvendig med flere kritiske trinn. Først injiser bare embryoer hvis otocystene er tydelige. Hvis otocytter ikke er synlige,...

Rask neural koding av lyd er viktig for normale lydfunksjoner. Disse inkluderer lyd lokaliseringsevner 1 , tale i støy diskriminering 2 , og forståelsen av andre adferdsrelevante kommunikasjonssignaler 3 . Analoge nevroner som er lokalisert i den hørbare hjernestammen til både avianer og pattedyr, er høyt spesialiserte for rask neural koding 4 . Disse inkluderer kyllingekernen magnocellularis (NM), nucleus laminaris (NL) og deres pattedyranaloger, den anteroventrale cochleære kjernen (AVCN) og den mediale overlegne oliven (MSO) henholdsvis 5 . Imidlertid er utviklingsmekanismer som regulerer rask nervekoding, dårlig forstått i den hørbare hjernestammen. Derfor er det fordelaktig å studere spesifikke gener som er ansvarlige for rask nervekoding for å bedre forstå deres uttrykk, regulering og funksjon i auSykdomsutvikling. Den utviklende kyllingembryoen er et effektivt og veletablert forskningsverktøy for å studere grunnleggende biologiske spørsmål om lydsystemutvikling 6 , 7 . Nylige molekylære fremskritt har adressert disse biologiske spørsmålene i det utviklende kyllingembryoen ved å uttrykke eller slå ned gener av interesse for å analysere in vivo genfunksjon 8 , 9 . Undersøkelse av regulerende rolle av spesifikke gener er en betydelig fremgang i forståelse av patologier forbundet med auditiv underskudd. Her presenterer vi i ovo elektroporasjon av plasmidkodede gener inn i kylling-auditiv hjernestammen, hvor rask nervekoding av lyd forekommer 10 . Ved å målrette auditiv nevrale progenitorregioner assosiert med rombomerer 5 og 6 11 , 12 (R5 /R6), viser vi romlig kontroll av plasmidtransfeksjon i NM og NL. I tillegg viser vi temporal regulering av uttrykk ved å vedta et tet-on vektorsystem. Dette er en medisininducerbar prosedyre som uttrykker genene av interesse i nærvær av doxycyklin (Dox) 8 .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Fertilized white leghorn chicken eggs</td>
			<td>Sunnyside Inc. (Beaver Dam, WI)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Picospritzer</td>
			<td>Parker Hannifin</td>
			<td>052-0500-900</td>
			<td>Picospritzer III, single or dual channel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current/voltage stimulator</td>
			<td>Grass Technologies</td>
			<td>SD9</td>
			<td>SD9</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfil syringe needles</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>MF28G67-5</td>
			<td>28 Gauge, 67 mm Long, (Pack of 5)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Electrode holder</td>
			<td>Warner Instruments</td>
			<td>64-1280</td>
			<td>MP Series: Non-Electrical Pressure Applications</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stimulating microelectrode</td>
			<td>FHC</td>
			<td>PBSA1075</td>
			<td>PBSA1075</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air tank/regulator</td>
			<td>NU Laboratory Services</td>
			<td></td>
			<td>Air dry 300 CF</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fast green</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>F7258-25G</td>
			<td>F7258-25G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Clear plastic tape</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>191</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Doxycycline hyclate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>D9891-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg refrigerator</td>
			<td>Vissani Wine Refrigerator</td>
			<td></td>
			<td>13.3-16.1&#176; C (56-61&#176; F)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Incubator</td>
			<td>Hova-Bator</td>
			<td></td>
			<td>37.8&#176; C (100&#176; F), ~50% humidity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection scope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.35E+15</td>
			<td>SteREO Discovery, V8 Microscope, 50.4X</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cold-light source</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>4.36E+15</td>
			<td>CL6000 LED</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micromanipulators</td>
			<td>Narishige Japan</td>
			<td>Model: MM-3</td>
			<td>2 Micromanipulators</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Capillary tubes</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BF150-86-10</td>
			<td>Thick-walled borosilicate (dimensions)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringes</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>1 mL, 3 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Needles</td>
			<td>BD Precision Glide&#160;</td>
			<td></td>
			<td>27 G x 1 1/4, 19 G x 1 1/2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Forceps</td>
			<td>Stoelting</td>
			<td></td>
			<td>No. 5 Super Fine Dumont</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Egg holder</td>
			<td>Custom Made</td>
			<td></td>
			<td>Clay base works as well</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micropipette puller</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td>Model P-97</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe filter</td>
			<td>Ultra Cruz</td>
			<td>sc-358811</td>
			<td>PVDF 0.22 &#956;m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in ovo electroporation in the chicken auditory brainstem

Elektroporation er en metode som introduserer gener av interesse for biologisk relevante organismer som kyllingembryoen. Det er lenge fastslått at kyllingembryoen er en effektiv forskningsmodell for å studere grunnleggende biologiske funksjoner for lydsystemutvikling. Mer nylig har kyllingembryoen blitt spesielt verdifull i å studere genuttrykk, regulering og funksjon forbundet med hørsel. I ovo kan elektroporasjon brukes til å målrette auditiv hjernestamregion som er ansvarlig for høyt spesialiserte hørselsfunksjoner. Disse områdene inkluderer kyllingekernen magnocellularis (NM) og nucleus laminaris (NL). NM- og NL-neuroner oppstår fra tydelige forløpere av rombomerer 5 og 6 (R5 / R6). Her presenterer vi i ovo elektroporation av plasmidkodede gener for å studere genrelaterte egenskaper i disse regionene. Vi viser en metode for romlig og tidsmessig kontroll av genuttrykk som fremmer enten gevinst eller tap av funksjonell fenotypees. Ved å målrette auditoriske neurale progenitorregioner assosiert med R5 / R6, viser vi plasmidtransfeksjon i NM og NL. Temporal regulering av genuttrykk kan oppnås ved å vedta et tet-on-vektorsystem. Dette er en legemiddelinducerbar prosedyre som uttrykker genene av interesse i nærvær av doxycyklin (Dox). I ovo elektroporasjonsteknikken - sammen med enten biokjemiske, farmakologiske og eller in vivo funksjonelle analyser - er det en nyskapende tilnærming til å studere lydutvikling og tilhørende patofysiologiske fenomener.

Vi viser her at i ovo elektroporation tillater genuttrykk i et normalt utviklende biologisk system. Plasmidkodede gener injiseres fokalt i nevrale røret som ligger over R5 / R6. Et skjematisk eksempel på elektroden og pipettplasseringene i forhold til viktige anatomiske markører er vist i figur 1A . Den korrekte plassering av plasmidinjeksjon bekreftes 24 timer etter elektroporasjon og vist i figur IB . Den målrettede injeksjonen av plasmide...

Watch this Scientific Journal Video about In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem at JoVE.com

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Auditoriske hjernestammenes neuroner av avians og pattedyr er spesialisert på rask nervekoding, en grunnleggende prosess for normale hørefunksjoner. Disse nevronene oppstår fra tydelige forløperne av embryonale hindbrain. Vi presenterer teknikker som benytter elektroporasjon til å uttrykke gener i hindre av kyllingembryoer for å studere genfunksjon under auditiv utvikling.

I Ovo Electroporation i Kylling Auditory Brainstem

Electroporation is a method that introduces genes of interest into biologically relevant organisms like the chicken embryo. It is long established that ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Ovo Electroporation in the Chicken Auditory Brainstem

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Efficient Gene Transfer in Chick Retinas for Primary Cell Culture Studies: An Ex-ovo Electroporation Approach

Effektiv Gene Transfer i Chick netthinne for primære cellekulturstudier: An<em&gt; Ex-ovo</em&gt; Electroporation Approach

The cone photoreceptor-enriched cultures derived from embryonic chick retinas have become an indispensable tool for researchers around the world studying ...

Analysis of Zebrafish Larvae Skeletal Muscle Integrity with Evans Blue Dye

Analyse av Sebrafisk Larver Skeletal Muscle Integrity med Evans blå Dye

The zebrafish model is an emerging system for the study of neuromuscular disorders.  In the study of neuromuscular diseases, the integrity of the muscle ...

Whole Retinal Explants from Chicken Embryos for Electroporation and Chemical Reagent Treatments

Hele Retinal eksplantater fra kylling embryoer for Electroporation og kjemisk reagens behandlinger

The retina is a good model for the developing central nervous system. The large size of the eye and most importantly the accessibility for experimental ...

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer into the Chicken Auditory Organ by In Ovo Micro-electroporation

Gene Transfer inn i Chicken hørbar Organ av<em&gt; I Ovo</em&gt; Micro-electroporation

Chicken embryos are ideal model systems for studying embryonic development as manipulations of gene function can be conducted with relative ease in ovo. ...

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

A Novel Ex Ovo Banding Technique to Alter Intracardiac Hemodynamics in an Embryonic Chicken System

En novelle<em&gt; Ex Ovo</em&gt; Banding Technique Alter Intrakardial hemodynamikken i en Embryonic Chicken System

The new model presented here can be used to understand the influence of hemodynamics on specific cardiac developmental processes, at the cellular and ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Embryo Mikroinjeksjon og Electroporation i chordate<em&gt; Ciona intestinalis</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Disseksjon og Immunofluorescent flekker av sopp kropp og Photoreceptor Neurons i voksen Drosophila melanogaster hjernen

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

Tredimensjonale Organotypic kulturer av Vestibular og auditiv Sanseorganer

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...