Name: light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained tribolium castaneum embryos
Uploaded: 2017-04-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos at JoVE.com

Vi takker Sven Plath til teknisk support. Den Glia-blå transgene linje var en slags gave fra Gregor Bucher (Göttingen, Tyskland). Forskningen blev støttet af Cluster of Excellence Frankfurt am Main til Makromolekylær Komplekser (CEF-MC, EXC 115, højttaler Volker Dötsch) givet delvist til EHKS på Buchmann Institut for Molekylær Life Sciences (BMLS, direktør Enrico Schleiff) på Goethe Universität Frankfurt am Main ved Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

1. Husbandry af Tribolium Cultures BEMÆRK: Standard betingelser er defineret som en inkubationstemperatur på 25 ° C og 70% relativ fugtighed i en 12 h lys / 12 timer mørke cyklus. For mere information om Tribolium dyrehold, respektive retningslinjer er tilgængelige 64. Denne protokol kræver to forskellige mel-baserede medier, som kan fremstilles i kilogram mængder og lagres i flere måneder. <ol><li> Før arbejde med mel og inaktiv tørgær,...

Kvalitetskontrol I levende imaging assays, skal proceduren forberedelse og optagelse være ikke-invasiv, dvs. hverken den mekaniske og kemiske håndtering (indsamling, dechorionation, montering på prøveholderen) eller integrerede energi belastning under observationen bør påvirke levedygtigheden af prøven. For undersøgelser, der karakteriserer WT udvikling, anbefales det kun at bruge data fra forsøg, hvor fosteret overlever optagelsen, hentes med succes og udv...

Den røde mel bille Tribolium castaneum, der hører til den store familie af skyggebiller (Tenebrionidae), har en lang historie inden for landbrugs- og biovidenskab og er den anden bedst undersøgte model insekt model organisme efter bananfluen Drosophila melanogaster. I løbet af de sidste fire årtier, blev det en kraftfuld og populær insekt model organisme i udviklingsmæssige genetik, i evolutionær udviklingsmæssige biologi og i løbet af de sidste tyve år, i embryonale morfogenese for en række forskellige årsager: Drosophila og Tribolium begge tilhører den Holometabola, men afveg ca. 300 millioner år siden 1, 2, 3, 4. Mens den embryoniske udvikling af Drosophila almindeligvis betragtes som særdeles afledt, Tribolium viser en mere nedarvet tilstand af udvikling, der findes i en væsentligt større andel af insektarter 5, 6, 7, 8, 9. For det første Tribolium udviser ikke-involuted hoved udvikling, dvs. dens munddele og antenner dukke allerede under embryogenese 10, 11, 12, 13, 14, 15. For det andet, Tribolium følger de principper for kortvarige kim udvikling, dvs. abdominal segmenter tilsættes sekventielt fra en posterior vækst zone i germband forlængelse 16, 17, 18, 19. For det tredje, Tribolium udvikler og senere nedbrydesto ekstra-embryonale membraner dvs. amnion, som dækker embryonet kun ventralt, og serosa, som indhyller embryonet helt 20, 21, 22. Begge membraner spiller en afgørende morfogenetiske 23 samt beskyttende rolle mod mikroorganismer 24, 25 og udtørring 26. For det fjerde har embryonically udviklingslandene ben er fuldt funktionelle i larvestadiet livsfase og tjene som primordier for de voksne ben under puppe metamorfose 27, 28, 29, 30, 31. På grund af deres lille størrelse og beskedne krav, dyrkning af Tribolium i laboratoriet er forholdsvis ligetil. Kulturer af vildtype (WT) stammer eller transgene linjer består typisk af omkring 100-300 voksne og kan holdes inden for én-liters glasflasker (fodaftryk 80 cm2) fyldt tre til fire centimeter høje (ca. 50 g) med vækstmedium, som består af fuldnarvet hvede mel suppleret med inaktiv tørgær. En vandforsyning er ikke nødvendig. Dette tillader selv små laboratorier til at holde snesevis af beetle kulturer inden små eller mellemstore kommercielt tilgængelige insekt inkubatorer. Senere udviklingsstadier af Tribolium (larver efter ca. fjerde stadiums, pupper og voksne) adskilles let fra vækstmediet ved sigtning. Synkroniserede embryoner opnås ved at inkubere voksne i korte perioder på æglægning medium. For udvikling bliver beetle kulturer holdt ved 32 ° C (ca. fire uger pr generation), mens lagerføring udføres typisk ved 22-25 ° C (omkring ti uger om generation). Inden for det sidste årti, mange standard techniques gradvist er blevet tilpasset og optimeret til Tribolium, som sammenfattet i det spirende modelorganismer bøger 32. Af stor betydning er avancerede genetiske metoder såsom embryoniske 33, larve- 34, 35 eller parental 36, 37 RNA-interferens-baserede gen knockdown, kimlinietransformation med enten piggyBac 38, 39 eller Minos 40 transposase-system og CRISPR / Cas9-baserede genom engineering 41. Desuden har Tribolium genomet blevet sekventeret omkring et årti siden 42, og er nu i den tredje runde af genom samling frigive 43, der muliggør effektiv og hele genomet identifikation og systematisk analyse af gener 44 </sop&gt; eller andre genetiske elementer 45, 46. Derudover genomerne fra fire andre billelarver arter er tilgængelige til sammenlignende genetiske tilgange 47, 48, 49, 50. I association med den genom, har to store genetiske analyser udført, dvs. en insertionsmutagenese skærm 51 og en systematisk RNA-interferens-baserede gen knockdown skærm 52, 53. Fluorescens billeddannelse med Vidvinklet, konfokal eller lys ark-baserede mikroskopi (LSFM) gør det muligt at observere det embryoniske morfologi Tribolium som funktion af tiden (dvs. den morfogenese) i et flerdimensionalt sammenhæng (tabel 1). I Vidvinklet og konfokal fluorescensmikroskopi, den Excitation og emission lys ledes gennem det samme objektiv. I begge tilgange er hele prøven belyst for hver registreret todimensionalt plan. Derfor er prøverne udsat for meget høje energiniveauer. I LSFM, kun fluoroforerne i brændplanet exciteres på grund af en afkobling af belysning og påvisning ved anvendelse af to vinkelret anbragte objektivlinser (figur 1). LSFM kommer i to kanoniske implementeringer - den enkelt plan belysning mikroskop (SPIM) og de digitale scannede laserlys ark-baserede fluorescensmikroskop (DSLM, figur 2) - og giver flere vigtige fordele i forhold til traditionelle fremgangsmåder: (i) iboende optisk sektionering kapacitet, (ii) god aksial opløsning, (iii) kraftigt reduceret niveau af foto-blegning, (iv) meget lav foto-toksicitet, (v) højt signal-til-støj-forhold, (vi) relativt høj erhvervelse hastighed, (vii) afbildning langs flere retninger og (VIii) dybere vævspenetration grund af brugen af lav numerisk apertur belysningsobjektivsystem linser 54, 55, 56. LSFM er allerede blevet anvendt med succes i Tribolium at dokumentere næsten hele embryonale morfogenese 57 og analysere principperne for ekstra-embryonale membran brud i begyndelsen af dorsale lukning 23. For at hæve tiltrækningskraft LSFM i Tribolium samfundet og for insekt videnskab i almindelighed, er det af stor betydning at etablere standardprocedurer og forbedre de metoder, protokoller og den pulje af ressourcer til et niveau, hvor mikroskopet bliver en lethed-i -Brug standardværktøj i udviklingsmæssige biologiske laboratorier, og de biologiske spørgsmål bo i centrum for opmærksomhed. Denne protokol begynder med det grundlæggende i Tribolium &lt;/ em&gt; dyrkning, dvs. vedligeholdelse, reproduktion og embryonindsamlingsteam. Derefter to eksperimentelle strategier illustreret: (i) levende billeddannelse af skræddersyede transgene linier og (ii) afbildning af faste embryoner, der blev farvet med fluorescerende farvestoffer (tabel 2). Efterfølgende tre monteringsteknikker med lidt forskellige formål forklaret detaljeret (figur 3 og tabel 3): (i) agarosesøjlen, (ii) agarose halvkugle og (iii) spindelvæv holder roman. Protokollen derefter forklarer proceduren for dataopsamling med LSFM. Billeddiagnostiske metoder og centrale overvejelser er skitseret. Endelig embryo hentning forklaret og forslag til grundlæggende databehandling leveres. I de repræsentative resultater, live billeddata fra to hidtil ukendte skræddersyede og Glia-blå 58 transgene linier er vist, og de respektive billeddannende datasæt er tilvejebragt som en downloades ressource. Derudover billededata af faste embryoner, der blev farvet med en række fluorescensfarvestoffer præsenteres. Diskussionen fokuserer på kvalitetskontrol, nuværende begrænsninger i direkte billedvisning tilgang og tilpasning af protokollen til andre arter. Protokollen er skrevet til lette flade baseret fluorescensmikroskoper der er udstyret med et prøvekammer og en roterbar klemme mekanisme for standardiserede prøveholdere 54, 59, 60, der typisk er cylinderformede elementer fremstillet af metal, plast eller glas med en diameter i millimeterområdet. Protokollen er også velegnet til både kanoniske implementeringer, dvs. spim og DSLM samt for opstillinger med to eller flere belysning og afsløring arme 61, 62, 63. De repræsentative resultater viser data i to spektrale kanaler, grøn (illumination med en 488 nm laser, detektion gennem et 525/50 båndpasfilter) og rød (belysning med en 561 nm laser, detektion gennem et 607/70 båndpasfilter), men protokollen kan udvides til tre eller fire spektrale kanaler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">full grain wheat flour</td>
			<td style="width:119px;">Demeter e.V.</td>
			<td style="width:71px;">1.13E+08</td>
			<td style="width:167px;">US: whole wheat flour, UK: whole meal flour</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">405 fine wheat flour</td>
			<td style="width:119px;">Demeter e.V.</td>
			<td style="width:71px;">1.13E+08</td>
			<td style="width:167px;">US: pastry flour, UK: soft flour</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">inactive dry yeast</td>
			<td style="width:119px;">Flystuff / Genesee Scientific</td>
			<td style="width:71px;">62-106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">10010-023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sodium hypochlorite, ~12% active Cl</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">425044-250ML</td>
			<td style="width:167px;">Caution: sodium hypochlorite is corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">low-melt agarose</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:71px;">6351.2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Orange Scientific</td>
			<td style="width:71px;">4430500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">24-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Orange Scientific</td>
			<td style="width:71px;">4430300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">glass capillaries, internal &#216; 0.46 mm</td>
			<td style="width:119px;">Brand GmbH + Co KG</td>
			<td style="width:71px;">7087 09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">SYTOX Green</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">57020</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">YOYO-1 Iodide</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">Y3601</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">BOBO-3 Iodide</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">B3586</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">A22283</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 800 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-051</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 710 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-050</td>
			<td style="width:167px;">for growth medium preparation (step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 300 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-040</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 250 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-038</td>
			<td style="width:167px;">for egg laying medium preparation (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">glass dish, &#216; 100 mm &#215; 20 mm</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">CLS70165102</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">cell strainer, 100 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:71px;">352360</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">paint brush, head &#216; 2 mm</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">149-2121</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">syringe, 1.0 ml</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun Medical AG</td>
			<td style="width:71px;">9166017V</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">scintillation vials</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">M1152-1000EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">158127</td>
			<td style="width:167px;">Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">n-heptane &#8805; 99%</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:71px;">8654.1</td>
			<td style="width:167px;">Caution: n-heptane is flammable and toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">X100-100ML</td>
			<td style="width:167px;">Caution: Trition X-100 is corrosive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained tribolium castaneum embryos

Den røde mel bille Tribolium castaneum er blevet et vigtigt insekt model organisme i udviklingsmæssige genetik og evolutionær udviklingsmæssige biologi. Observationen af Tribolium embryoer med lys ark-baserede fluorescensmikroskopi har flere fordele i forhold til konventionel Vidvinklet og konfokal fluorescensmikroskopi. På grund af de unikke egenskaber af en lyspladen-baserede mikroskop, kan tredimensionelle billeder af levende prøver registreres med højt signal-støj-forhold og væsentligt reduceret foto-blegning samt foto-toksicitet langs flere retninger over perioder, der varer flere dage. Med mere end fire års metodeudvikling og en fortsat stigning af data, synes passende tid til at etablere standardprocedurer for brugen af lys ark teknologi i Tribolium samfund såvel som i insekt samfundet som helhed. Denne protokol beskrives tre monteringsteknikker egnede feller forskellige formål, præsenterer to nye skræddersyede transgene Tribolium linjer passende for langsigtet direkte billedvisning, foreslår fem fluorescerende farvestoffer at mærke intracellulære strukturer af faste embryoner og giver oplysninger om data efterbehandling til rettidig evaluering af de registrerede data. Repræsentative resultater koncentrere sig om langsigtet billeddannelse, optiske sektionering og observation af den samme embryo langs flere retninger. De respektive datasæt leveres som en download ressource. Endelig protokollen diskuterer kvalitetskontrol for lever imaging-analyser, aktuelle begrænsninger og anvendeligheden af ​​de skitserede procedurer til andre insektarter. Denne protokol er primært beregnet til udviklingsmæssige biologer, der søger imaging-løsninger, der udkonkurrerer standard laboratorieudstyr. Det fremmer den kontinuerlige forsøg på at lukke hullet mellem de teknisk orienterede laboratorier / samfund, der udvikler og forfiner mikroerkopiere metodisk, og life science laboratorier / samfund, som kræver &#39;plug-and-play&#39; løsninger på tekniske udfordringer. Desuden er det understøtter en aksiomatisk tilgang, der bevæger de biologiske spørgsmål i centrum for opmærksomhed.

Denne protokol beskriver en eksperimentel ramme for fluorescensafbildning af levende eller fikseret og farvet Tribolium embryoer med LSFM. På grund af de lave niveauer af foto-blegning og foto-toksicitet, en direkte konsekvens af dets optiske sektionering kapacitet, LSFM er særligt velegnet til langsigtede direkte billedvisning. Den hidtil ukendte AGOC {ATub&#39;H2B-mEmerald} # 1 transgen linje udtrykker et histone2...

Watch this Scientific Journal Video about Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos at JoVE.com

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Billeddannelse af morfogenese af insekt embryoer med lys ark-baserede fluorescensmikroskopi er blevet stade. Denne protokol skitserer og sammenligner tre monteringsteknikker passende for Tribolium castaneum embryoner, indfører to hidtil ukendte skræddersyede transgene linier velegnede til billeddannelse, diskuterer væsentlige kvalitetskontrol og angiver de aktuelle eksperimentelle begrænsninger.

Lys Sheet-baserede Fluorescence Microscopy af Leve- eller fikseres og farves<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryoner

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Måling Protein Stabilitet i Living zebrafisk embryoner anvendelse af fluorescens Decay Efter fotoomdannelse (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Metoder til Præcist Lokaliseret Overførsel af Celler eller DNA i Early implantation museembryoer

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Brug Light Sheet Fluorescens mikroskopi til billede zebrafisk Eye Development

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induktion af hypoxi i levende frø og zebrafiskembryoner

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitative hele-mount immunofluorescens analyse af Cardiac stamfader populationer i mus embryoner

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Multimodal hierarkisk billeddannelse af serielle sektioner for at finde specifikke cellulære mål inden for store mængder

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropisk lys-Sheet mikroskopi og automatiseret celle Lineage analyser til kataloget Caenorhabditis elegans Embryogenesis med Subcellular opløsning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Mikroinjektion af DNA i øjen knopper i xenopus laevis embryoner og billeddannelse af Gfp udtrykker optiske Axonal Arbors i intakt, levende xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

En lagdelt monteringsmetode til forlænget tidsforskudt Konfokal mikroskopi af hele Zebrafish-embryoner

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Lysfremkaldt GFP-udtryk i zebrafiskembryoner ved hjælp af det optogenetiske TAEL/C120-system

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...