Name: light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained tribolium castaneum embryos
Uploaded: 2017-04-28T15:00:00
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私たちは、技術サポートのためのスヴェン・プラス感謝します。グリア青いトランスジェニックラインは、グレゴール・ブッチャー（ゲッティンゲン、ドイツ）から寄贈されました。研究は、ゲーテのBuchmann分子生命科学研究所（BMLS、ディレクターエンリコ・シュリーフ）でEHKSに一部付与された高分子複合体（CEF-MC、EXC 115、スピーカーボルカー・ドッツチ）用のメイン午​​前優秀フランクフルトのクラスタによって賄われていました理学部フランクフルトはドイツForschungsgemeinschaft（DFG）によってメインです。

1.畜産モドキTriboliumの文化注：標準的な条件は、25℃のインキュベーション温度、12時間明/ 12時間暗サイクルにおける相対湿度70％として定義されます。 モドキTriboliumの飼育についての詳細は、それぞれのガイドラインは64利用可能です。このプロトコルは、キログラムの量で調製し、数ヶ月間保存することができる2つの異なる粉ベースのメ...

品質管理 ライブイメージングアッセイでは、準備と記録手順は、非侵襲的でなければならない、 すなわち観察中（コレクション、dechorionation、サンプルホルダーに取り付け）も統合されたエネルギー負荷を処理する機械的および化学的でもないが、試料の生存率に影響を与える必要があります。 WTの開発を特徴づける研究のために、それは胚が正常?...

darklingのカブトムシ（ゴミムシダマシ科）の大ファミリーに属するコクヌストモドキTriboliumののcastaneumは 、農業と生命科学の中に長い歴史を持っており、果実はキイロショウジョウバエを飛ぶした後、第2最高の研究のモデル昆虫モデル生物です。最後の四十年の間に、それは、様々な理由のための胚の形態形成に、過去20年の間に、進化の発生生物学では、発生遺伝学における強力かつ人気のある昆虫のモデル生物になったと： ショウジョウバエとモドキTribolium両方がHolometabolaに属しているが、約300万年前に1、2、3、4分岐しました。 ショウジョウバエの胚発生は、一般に、高度に誘導されたとみなされているが、 モドキTriboliumは develのより祖先モードを示します昆虫種5、6、7、8、9のかなり大きい割合で発見されるopment。その口器とアンテナは胚10、11、12、13、14、15の間に既に出現すなわちまず、 モドキTriboliumは 、非インボリュートヘッドの開発を示します。第二に、 モドキTriboliumが短生殖発達の原理に従う、 すなわち、腹部のセグメントがgermband伸び16、17、18、19の間に後部成長ゾーンから連続的に添加されます。第三に、 モドキTriboliumが開発し、後に劣化します2胚体外膜は唯一の腹側に胚をカバー羊膜、および完全に20、21、22胚を包む漿膜を、 すなわち 。両方の膜は、非常に重要な形態形成23と同様に、微生物24、25、乾燥26に対して保護的な役割を果たしています。第四に、胎生開発脚は幼虫のライフステージの間に完全に機能していると蛹変態27、28、29、30、31時の大人の足のための原基としての役割を果たす。 それらの小さなサイズと控えめな要求に、研究室でモドキTriboliumの栽培は非常に簡単です。野生型の培養物（WT）株またはトランスジェニック系統は、典型的には約100~300成人から成り、フルグレイン小麦から成る増殖培地で3〜4センチ高い（約50g充填した1リットルのガラス瓶（フットプリント80センチメートル2））内に維持することができます小麦粉は非アクティブ乾燥酵母を補いました。水の供給は不要です。これは、小規模または中規模の市販の昆虫インキュベーター内甲虫培養物の多数を維持するために小さな研究所を可能にします。 モドキTriboliumの後の発生段階（幼虫後約第四齢、蛹及び成虫）を容易にふるい分けすることにより成長培地から分離されます。同期胚は産卵中に短い期間の成人をインキュベートすることによって得られます。在庫管理は、典型的には22〜25°C（世代あたり約10週間）で行っている間に急速な発展のために、甲虫の培養物を、32°C（世代あたり約4週間）に保たれています。 最後の10年以内に、多くの標準テック新興モデル生物ブック32にまとめたようhniquesは徐々に、 モドキTriboliumに適応され、最適化されています。非常に重要で、このような胚33、幼虫34、35または親36、37 RNA干渉に基づく遺伝子ノックダウン、 のpiggyBac 38、39又はミノス 40トランスポザーゼシステムおよびCRISPR / Cas9ベースゲノムのいずれかと生殖細胞系変換などの高度な遺伝学的方法でありますエンジニアリング41。また、 モドキTriboliumゲノムは、42十年ほど前に配列決定されており、効率的かつゲノムワイドな同定及び遺伝子44の系統的な分析を可能にするゲノムの第三ラウンドアセンブリ43を解放し 、中であります</sアップ&gt;または他の遺伝的要素45、46。また、他の4つの鞘翅目の種のゲノムは、比較遺伝的アプローチ47、48、49、50のために用意されています。配列決定ゲノムとの関連では、二つの大規模な遺伝子分析は、挿入突然変異誘発画面51、画面52、53をノックダウン系統的RNA干渉ベースの遺伝子、すなわち 、実行されています。 広視野共焦点または光シートベース顕微鏡（LSFM）と蛍光ライブイメージングは、多次元コンテキスト（ 表1）に（ すなわち、形態形成）時間の関数としてモドキTriboliumの胚の形態を観察することができます。広視野と共焦点蛍光顕微鏡では、excitエーション発光光が同じ対物レンズを介して導かれます。両方のアプローチにおいて、試料全体がすべて記録された2次元平面のために照射されます。したがって、試料は、非常に高いエネルギーレベルに供されます。 LSFMにおいて、焦点面における唯一のフルオロフォアは、2枚の垂直に配置された対物レンズ（ 図1）を用いて照明および検出の分離に励起されます。単一平面照明顕微鏡（SPIM）とデジタル走査されたレーザ光のシートベースの蛍光顕微鏡（DSLM、 図2） - - LSFMは、二つのカノン実装で来て、従来のアプローチに比べていくつかの重要な利点を提供する：（I）固有の光学セクショニング能力（ii）は、良好な距離分解能、（iii）の光退色を強く減少したレベル、（IV）、非常に低い光毒性、（V）高い信号対雑音比、（VI）、比較的高い取得速度、（VII）イメージング複数の方向および（vi沿って低い開口数の照明対物レンズ54、55、56の使用へII）より深い組織浸透。 LSFMはすでに正常ほぼ全胚の形態形成57を文書化すると背側の閉鎖23の先頭に胚体外膜の破裂の原則を分析するためモドキTriboliumに適用されています。一般的にモドキTriboliumコミュニティで昆虫科学のためLSFMの魅力を高めるために、それは標準的な操作手順を確立し、方法、プロトコルおよび顕微鏡は、使いやすさのとなりのレベルにリソースのプールを改善するために非常に重要です発生生物学研究所での標準的なツールを-use、および生物学的な質問は注目の的に滞在。 このプロトコルはモドキTriboliumの基礎から始まります&lt;/ em&gt;の栽培、 すなわちメンテナンス、生殖および胚のコレクション。次に、2つの実験戦略が示されている：（I）カスタムメイドのトランスジェニック系統のライブイメージングおよび蛍光色素（ 表2）を用いて染色した固定された胚の（ii）のイメージング。その後、わずかに異なる目的を持つ3つの取り付け技術は、（ 図3および表3）について詳細に説明する：（I）アガロースカラム、（ii）のアガロース半球および（iii）新規クモの巣ホルダ。プロトコルは、LSFMとデータ取得手順を説明します。イメージングモダリティとキーの考慮事項が概説されています。最後に、胚の検索について説明すると、基本的なデータ処理のための提案が提供されます。代表的な結果で、よりライブイメージングデータを2つの新規カスタムメイドおよびグリアブルー58個のトランスジェニック系が示されており、それぞれの撮像データセットをダウンロード可能なリソースとして提供されます。また、画像蛍光色素の様々な染色された固定胚のデータが提示されています。議論は、品質管理、ライブイメージングアプローチの現在の制限および他の種へのプロトコルの適応に焦点を当てています。 プロトコルは、試料室及び典型的には、直径を有する金属、プラスチックまたはガラス製の円筒状の要素である標準化された試料ホルダ54、59、60、のための回転可能なクランプ機構が装備されている光シートベースの蛍光顕微鏡用に書かれていますミリの範囲です。プロトコルはまた、両方のカノン実装、 すなわち SPIMとDSLM、ならびに二つ以上の照明および検出腕61、62、63とのセットアップのために適しています。代表的な結果は、2つのスペクトル・チャネルのデータを示し、緑色（IL488nmレーザー、50分の525バンドパスフィルタを介して検出）および561 nmレーザーと赤色（照明、70分の607バンドパスフィルタを介して検出）を有する部分の光量が、プロトコルは、3つのまたは4つのスペクトル・チャネルに拡張することができます。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">full grain wheat flour</td>
			<td style="width:119px;">Demeter e.V.</td>
			<td style="width:71px;">1.13E+08</td>
			<td style="width:167px;">US: whole wheat flour, UK: whole meal flour</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">405 fine wheat flour</td>
			<td style="width:119px;">Demeter e.V.</td>
			<td style="width:71px;">1.13E+08</td>
			<td style="width:167px;">US: pastry flour, UK: soft flour</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">inactive dry yeast</td>
			<td style="width:119px;">Flystuff / Genesee Scientific</td>
			<td style="width:71px;">62-106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">10010-023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sodium hypochlorite, ~12% active Cl</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">425044-250ML</td>
			<td style="width:167px;">Caution: sodium hypochlorite is corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">low-melt agarose</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:71px;">6351.2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Orange Scientific</td>
			<td style="width:71px;">4430500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">24-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Orange Scientific</td>
			<td style="width:71px;">4430300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">glass capillaries, internal &#216; 0.46 mm</td>
			<td style="width:119px;">Brand GmbH + Co KG</td>
			<td style="width:71px;">7087 09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">SYTOX Green</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">57020</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">YOYO-1 Iodide</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">Y3601</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">BOBO-3 Iodide</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">B3586</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">A22283</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 800 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-051</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 710 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-050</td>
			<td style="width:167px;">for growth medium preparation (step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 300 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-040</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 250 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-038</td>
			<td style="width:167px;">for egg laying medium preparation (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">glass dish, &#216; 100 mm &#215; 20 mm</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">CLS70165102</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">cell strainer, 100 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:71px;">352360</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">paint brush, head &#216; 2 mm</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">149-2121</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">syringe, 1.0 ml</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun Medical AG</td>
			<td style="width:71px;">9166017V</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">scintillation vials</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">M1152-1000EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">158127</td>
			<td style="width:167px;">Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">n-heptane &#8805; 99%</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:71px;">8654.1</td>
			<td style="width:167px;">Caution: n-heptane is flammable and toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">X100-100ML</td>
			<td style="width:167px;">Caution: Trition X-100 is corrosive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained tribolium castaneum embryos

コクヌストモドキTriboliumののcastaneumは、発生遺伝学と進化の発生生物学における重要な昆虫モデル生物となっています。光シートベースの蛍光顕微鏡とモドキTribolium胚の観察は、従来の広視野および共焦点蛍光顕微鏡を介して複数の利点を有します。光シートベース顕微鏡のユニークな特性のために、生きた標本の3次元画像は、高信号対雑音比で記録することができ、大幅にいくつかの持続期間にわたって光退色ならびに複数の方向に沿って光毒性を減少させ日々。以上の4方法論開発の年とデータの継続的な増加に伴い、時間がモドキTriboliumコミュニティでだけでなく、大規模で昆虫コミュニティに光シートの技術の利用のための標準的な操作手順を確立することが適切と思われます。このプロトコルは、適切なF 3つの取り付け技術を説明しますまたは異なる目的、長期的なライブイメージングに適した2つの新規カスタムメイドトランスジェニックモドキTriboliumラインを提示し、固定胚の細胞内構造を標識するのに5つの蛍光色素を示唆して記録されたデータのタイムリーな評価のためのデータの後処理についての情報を提供します。代表的な結果は、長期ライブイメージング、光学セクショニングおよび複数の方向に沿って同じ胚の観察に集中します。それぞれのデータセットは、ダウンロード資源として提供されています。最後に、プロトコルは、ライブイメージングアッセイ、電流制限および他の昆虫種に概説した手順を適用するための品質管理について説明します。 このプロトコルは、主に標準的な実験設備をアウトパフォームイメージングソリューションを模索発達生物学者を対象としています。これは、開発し、ミクロスを絞り込む技術志向の研究室/コミュニティ間のギャップを埋めるために継続的な試みを促進します方法論的にコピーして、技術的な課題への「プラグ・アンド・プレイのソリューションを必要とする生命科学研究所/コミュニティ。さらに、それは注目の的に生物学的な質問を移動公理的アプローチをサポートしています。

このプロトコルは、生活の蛍光イメージング又はLSFMで固定し、染色しモドキTribolium胚の実験の枠組みを記載しています。光退色及び光毒性の低いレベルに、その光学切片機能の直接の結果は、LSFMは長期的なライブイメージングのために特に適しています。 新規AGOC {ATub&#39;H2B-mEmerald}＃1トランスジェニックラインは<...

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Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

光シートベースの蛍光顕微鏡による昆虫の胚の形態形成を撮像する技術の状態となっています。このプロトコルは、輪郭とモドキTribolium castaneumの胚に適した3つの取り付け技術を比較し、ライブイメージングに適して2つの新規のカスタムメイドのトランスジェニック系統を導入し、本質的な品質管理を説明し、現在の実験の限界を示しています。

光シートベースの蛍光生活の顕微鏡または固定し、染色<em&gt;モドキTribolium castaneum</em&gt;胚

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

光変換後の蛍光減衰を使用して生活ゼブラフィッシュ胚におけるタンパク質の安定性の測定（FDAP）

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

早期着床後のマウス胚への細胞やDNAの正確​​ローカライズ転送する方法

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

イメージゼブラフィッシュアイ開発にライトシート蛍光顕微鏡を用いて、

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

生きた蛙およびゼブラフィッシュの胚における低酸素の誘導

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

マウス胚における心臓前駆細胞集団の定量的ホール マウント免疫染色解析

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

大ボリューム内の特定の細胞内標的を見つけるため連続切片的階層構造イメージング

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

等方性光シート顕微鏡と自動細胞系譜分析による、細胞内分解能を Caenorhabditis elegans 胚発生

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

キセノプス・レービス胚における眼芽へのDNAのマイクロインジェクションとGFPのイメージングは、無傷で光学軸軸樹園を発現し、生きているキセノプス・タマジャクシ

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

ゼブラフィッシュ胚全体の延長タイムラプス共焦点顕微鏡法の層状取り付け法

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

光遺伝学的TAEL/C120系を用いたゼブラフィッシュ胚における光誘導GFP発現

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...