Name: light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained tribolium castaneum embryos
Uploaded: 2017-04-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos at JoVE.com

Мы благодарим Свен Плата за техническую поддержку. Глия-голубой трансгенная линия была своего рода подарок от Грегор Бачер (Геттинген, Германия). Исследование финансировалось Скопление Превосходство Франкфурт-на-Майне для макромолекулярных комплексов (CEF-MC, EXC 115, динамик Фолькер Дотш) предоставившей частично EHKS в Buchmann Института молекулярной Life Sciences (BMLS, режиссер Энрико Шлифф) в Гете Universität Франкфурт на Майне Немецким Исследовательским (DFG).

1. Земледелие из Tribolium культур Примечание: Стандартные условия определяются как при температуре инкубации 25 ° С и 70% относительной влажности в течение 12 ч светлых / 12 ч темнота. Для получения более подробной информации о Tribolium хозяйства, соответствующие рекоменда?...

Контроль качества В анализах живых изображений, процедура подготовки и записей должна быть неинвазивной, то есть ни механический и обработки химических (сбор, dechorionation, монтаж на держатель образца) , ни интегрированной энергетической нагрузку во время набл...

Красная мука жук Tribolium castaneum, который принадлежит к большому семейству чернотелок (Tenebrionidae), имеет долгую историю в области сельского хозяйства и наук о жизни и является вторым наиболее изученным модель модель насекомое организм после того, как плодовой мушки дрозофилы. В течение последних четырех десятилетий, она стала мощной и популярной моделью насекомых организм в генетике развития, эволюционной биологии развития и, в течение последних двадцати лет, в эмбриональном морфогенезе по целому ряду причин: Drosophila и Tribolium оба принадлежат к Holometabola, но расходились около 300 миллионов лет назад 1, 2, 3, 4. В то время как эмбриональное развитие дрозофилы обычно считаются весьма производными, Tribolium показывает более наследственный режим Develтие , который найден в значительно большем количестве видов насекомых 5, 6, 7, 8, 9. Во - первых, Tribolium демонстрирует развитие не-инволютированную головы, то есть его ротовые и усики появляются уже в процессе эмбриогенеза 10, 11, 12, 13, 14, 15. Во- вторых, Tribolium следует принципам развития короткого ростка, т.е. брюшные сегменты последовательно добавляют из зоны роста задней во germband удлинением 16, 17, 18, 19. В- третьих, Tribolium развивается и позже деградируетдва внеэмбриональные мембраны , т.е. амнион, который покрывает только эмбрион вентрально, и серозное, который обволакивает эмбрион полностью 20, 21, 22. Обе мембрана играет важные морфогенетическое 23, а также защитную роль в отношении микроорганизмов , 24, 25 и 26 высыхания. В- четвертых, в зародыше развивающиеся ноги полностью работоспособны в течение личиночной стадии жизни и служат зачатков для взрослых ног во время куколки метаморфоза 27, 28, 29, 30, 31. Из - за их малого размера и скромные требования, выращивание Tribolium в лаборатории довольно просто. Культуры дикого типа (WT) , штаммы или трансгенные линии , как правило , состоит из около 100-300 взрослых и может храниться в течение одного-литровых стеклянных бутылок (80 следа см 2) , заполненные от трех до четырех сантиметров (около 50 г) с ростовой средой, состоящей из полного зерна пшеницы муки с добавлением неактивных сухих дрожжей. Подача воды не требуется. Это позволяет даже небольшие лаборатории, чтобы держать десятки жука культур в пределах малых и средних коммерчески доступных инкубаторах насекомых. Более поздние стадии развития Tribolium (личинки примерно через четвертую возрастную стадию, куколки и взрослые) легко отделяются от ростовой среды путем просеивания. Синхронные эмбрионы получаются путем инкубирования взрослых в течение коротких периодов времени на яйцекладки среды. Для быстрого развития, жук культуры выдерживают при 32 ° C (около четырех недель в поколение), в то время складского учета обычно проводят при температуре 22-25 ° С (около десяти недель на поколение). В течение последнего десятилетия, многие стандартные ТЕСhniques постепенно адаптированы и оптимизированы для Tribolium, как представлено в книгах Emerging модельных организмов 32. Большое значение имеют расширенный генетические методы , такие как эмбриональное 33, личиночной 34, 35 или родительская 36, 37 РНК - интерференции на основе гена нокдаун, зародышевой преобразование либо с PiggyBac 38, 39 или система транспозаза Минос 40 и CRISPR / геном cas9 на основе инжиниринг 41. Кроме того, Tribolium геном был секвенирован около десяти лет назад 42, и в настоящее время в третьем раунде генома узла выпуска 43, что позволяет эффективно и геном идентификации и систематический анализ генов 44 </sвверх&gt; или другие генетические элементы 45, 46. Кроме того, геном четырех других видов жесткокрылых доступны для сравнительных генетических подходов 47, 48, 49, 50. В ассоциации с виртуализированным геномом, два крупномасштабных генетические анализы были выполнены, т.е. инсерционного мутагенеза экрана 51 и гена нокдаун экрана 52, 53 Систематическое РНК - интерференция основы. Флуоресцентный живой визуализации с широкопольных, конфокальной или легкого листа на основе микроскопии (LSFM) позволяет наблюдать эмбриональных морфологии Tribolium как функцию времени (т.е. морфогенез) в многомерном контексте (таблица 1). В широкопольными и конфокальной флуоресцентной микроскопии excitция и излучение света направляется через ту же самую линзу объектива. В обоих подходах весь образец освещается для каждого записываемого двухмерной плоскости. Таким образом, образцы подвергают очень высокий уровень энергии. В LSFM, только флуорофоры в фокальной плоскости возбуждаются за счет расцепления освещения и обнаружения с помощью двух перпендикулярно расположенных линз объектива (фиг.1). LSFM поставляется в двух канонические реализаций - единственная плоскость освещения микроскопа (SPIM) и цифровой сканируется лазерный луч листа на основе флуоресцентного микроскопа (DSLM, рисунок 2) - и предлагает несколько важных преимуществ по сравнению с традиционными подходами: (я) внутренняя способность оптического секционирования, (II) хорошее осевое разрешение, (III) сильно сниженный уровень фото-отбеливания, (IV) очень низкая фото-токсичность, (v) высокое отношение сигнал-шум, (VI) относительно высокая скорость сбора данных, (VII) формирования изображения по нескольким направлениям и (VIб) более глубокое проникновение ткани за счет использования низкой освещенности числовая апертура линзы объектива 54, 55, 56. LSFM уже успешно применяется в Tribolium к документу почти весь эмбриональный морфогенеза 57 и проанализировать принципы внеэмбрионального разрыва мембраны в начале закрытия дорсальных 23. Для того, чтобы повысить привлекательность LSFM в сообществе Tribolium и для науки насекомых в целом, это имеет большое значение для установления стандартных рабочих процедур и совершенствование методов, протоколов и пула ресурсов до уровня , где микроскоп становится простотой -Использование стандартного инструмента в развитии биологии лабораторий, а также биологические вопросы остаются в центре внимания. Этот протокол начинается с основами Tribolium &lt;/ EM&gt; выращивание, т.е. содержание, размножение и сбор эмбрионов. Далее, две экспериментальные стратегии проиллюстрированы: (я) живая визуализация заказных линий трансгенных и (б) формирования изображения фиксированных эмбрионов , которые были окрашенными флуоресцентными красителями (Таблица 2). Впоследствии три монтажные методы с несколько различными целями подробно описаны (рис 3 и таблицей 3): (я) агарозный колонок, (II) агарозное полушарие и (III) роман держатель паутины. Протокол затем объясняет процедуру сбора данных с LSFM. методы визуализации и ключевые соображения изложены. И, наконец, извлечение эмбриона объясняется и предложения для основной обработки данных предоставляются. В репрезентативных результатов, живые данные изображений из двух новых на заказ и глии-голубые 58 трансгенные линии показаны и соответствующие наборы данных изображений представлены в виде загружаемого ресурса. Кроме того, изображениеДанные фиксированных эмбрионов, которые были окрашены с различными флуоресцентными красителями представлены. Обсуждение фокусируется на контроле качества, существующих ограничения подхода живого изображения и адаптацию протокола к другим видам. Протокол написан для легких листовых на основе флуоресцентных микроскопов, которые оснащены отборную камеру и с возможностью вращения механизма зажима для стандартных держателей образцов 54, 59, 60, которые , как правило цилиндрической формы элементы , изготовленные из металла, пластика или стекла с диаметром в миллиметровом диапазоне. Протокол также подходит для обоих канонические реализаций, т.е. SPIM и DSLM, а также для установок с двумя или более освещения и обнаружения оружия 61, 62, 63. Представительные результаты показывают данные в двух спектральных каналах, зеленый (ILLumination с 488 нм лазера, обнаружение с помощью 525/50 полосовой фильтр) и красный (освещение с 561 нм лазера, обнаружение через 607/70 полосовой фильтр), но протокол может быть расширена до трех или четырех спектральных каналов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">full grain wheat flour</td>
			<td style="width:119px;">Demeter e.V.</td>
			<td style="width:71px;">1.13E+08</td>
			<td style="width:167px;">US: whole wheat flour, UK: whole meal flour</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">405 fine wheat flour</td>
			<td style="width:119px;">Demeter e.V.</td>
			<td style="width:71px;">1.13E+08</td>
			<td style="width:167px;">US: pastry flour, UK: soft flour</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">inactive dry yeast</td>
			<td style="width:119px;">Flystuff / Genesee Scientific</td>
			<td style="width:71px;">62-106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">10010-023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sodium hypochlorite, ~12% active Cl</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">425044-250ML</td>
			<td style="width:167px;">Caution: sodium hypochlorite is corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">low-melt agarose</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:71px;">6351.2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Orange Scientific</td>
			<td style="width:71px;">4430500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">24-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Orange Scientific</td>
			<td style="width:71px;">4430300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">glass capillaries, internal &#216; 0.46 mm</td>
			<td style="width:119px;">Brand GmbH + Co KG</td>
			<td style="width:71px;">7087 09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">SYTOX Green</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">57020</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">YOYO-1 Iodide</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">Y3601</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">BOBO-3 Iodide</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">B3586</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">A22283</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 800 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-051</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 710 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-050</td>
			<td style="width:167px;">for growth medium preparation (step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 300 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-040</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 250 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-038</td>
			<td style="width:167px;">for egg laying medium preparation (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">glass dish, &#216; 100 mm &#215; 20 mm</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">CLS70165102</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">cell strainer, 100 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:71px;">352360</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">paint brush, head &#216; 2 mm</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">149-2121</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">syringe, 1.0 ml</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun Medical AG</td>
			<td style="width:71px;">9166017V</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">scintillation vials</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">M1152-1000EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">158127</td>
			<td style="width:167px;">Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">n-heptane &#8805; 99%</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:71px;">8654.1</td>
			<td style="width:167px;">Caution: n-heptane is flammable and toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">X100-100ML</td>
			<td style="width:167px;">Caution: Trition X-100 is corrosive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained tribolium castaneum embryos

Красный жук муки Tribolium castaneum стала важной моделью насекомых организма в области генетики развития и эволюционной биологии развития. Наблюдение Tribolium эмбрионов с легкой листовой основой флуоресцентной микроскопией имеет несколько преимуществ по сравнению с обычными широкопольным и конфокальной флуоресцентной микроскопией. Из-за уникальных свойств светового листа на основе микроскопа, трехмерные изображения живых образцов могут быть записаны с высоким соотношением сигнал-шум и значительно уменьшить фото-отбеливание, а также фото-токсичностью по нескольким направлениям в течение периодов, которые длятся несколько дней. Обладая более чем четырех лет развития методологии и непрерывного увеличение данных, время представляется целесообразным установить стандартные рабочие процедуры для использования светотехники листов в сообществе Tribolium, а также в сообществе насекомых в целом. Этот протокол описывает три крепежных методов, пригодных еили различные цели, представляют два новых заказные трансгенные линии Tribolium подходят для долгосрочного живого изображения, предлагают пять флуоресцентных красители для маркировки внутриклеточных структур фиксированных эмбрионов и предоставляют информацию о данных постобработке для своевременной оценки записанных данных. Представитель результатов сосредоточиться на долгосрочном живом изображении, оптическое секционирование и наблюдении того же эмбрион вдоль нескольких направлений. Соответствующие наборы данных предоставляются в виде загружаемого ресурса. И, наконец, протокол обсуждает контроль качества для анализов живых изображений, существующих ограничений и применимости, указанных процедур к другим видам насекомых. Этот протокол предназначен прежде всего для биологов развития, которые ищут решение визуализации, превосходящую стандартное лабораторное оборудование. Это способствует непрерывную попытке ликвидировать разрыв между технически ориентированными лабораториями / сообществами, которые разрабатывают и уточняют Microsкопировать методологически, и жизнь научные лаборатории / сообщества, которые требуют решения «подключи и работай» технических проблем. Кроме того, он поддерживает аксиоматический подход, который перемещает биологические вопросы в центре внимания.

Этот протокол описывает экспериментальную основу для флуоресцентной визуализации живых или фиксированных и окрашенных эмбрионов Tribolium с LSFM. Из-за низкие уровни фото-отбеливание и фото-токсичность, является прямым следствием его способности оптического секцион...

Watch this Scientific Journal Video about Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos at JoVE.com

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Визуализации морфогенеза эмбрионов насекомых с легкой листовой основой флуоресцентной микроскопией стало состоянием искусства. Этот протокол описывает и сравнивает три монтажных методов , подходящих для Tribolium castaneum эмбрионов, представляет две новые заказные линии трансгенные хорошо подходят для живых изображений, обсуждает основные контроля качества и указывает на существующие экспериментальные ограничения.

Легкий лист на основе флуоресцентной микроскопии живых или фиксированных и окрашенных<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Эмбрионы

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Измерение белка стабильности в жизни у эмбрионов данио рерио с помощью флуоресцентной упадок после фотопреобразования (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Методы Именно локализованного передачи ячеек или ДНК в начале постимплантационных эмбрионов мыши

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Использование Light Sheet флуоресцентной микроскопии для изображения развития данио глаз

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Индукция гипоксии у живых лягушек и эмбрионов рыбок данио

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Анализ количественного состава Гора иммунофлюоресценции сердечной прародитель населения в эмбрионов мыши

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Смешанных иерархических изображений последовательных секций для нахождения конкретных клеточных мишеней в больших объемах

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Изотропная световая микроскопия и автоматизированный анализ линии клеток для каталога Caenorhabditis elegans Embryogenesis с подклеточным разрешением

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Микроинъекция ДНК в глазные будни в Xenopus laevis Эмбрионы и изображения GFP Экспрессинг Оптические аксональные беседки в Intact, живые Ксенопус Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Слойный монтаж Метод для расширенного времени Lapse Конфокальная микроскопия целых эмбрионов зебрафиш

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Светоиндуцированная экспрессия GFP у эмбрионов рыбок данио с использованием оптогенетической системы TAEL/C120

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...