Name: light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained tribolium castaneum embryos
Uploaded: 2017-04-28T15:00:00
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Agradecemos a Sven Plath para soporte técnico. La línea transgénica glía-azul fue una especie de regalo de Gregor Bucher (Göttingen, Alemania). La investigación fue financiada por el Cluster de Excelencia Frankfurt am Main de complejos macromoleculares (CEF-MC, EXC 115, altavoz Volker Dötsch) otorgado en parte a EHKS en el Instituto Buchmann Molecular Life Sciences (BMLS, director Enrico Schleiff) en el Goethe Universität Frankfurt am Main por la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

1. Cría de Tribolium culturas NOTA: Las condiciones estándar se definen como una temperatura de incubación de 25 ° C y 70% de humedad relativa en un 12 h brillantes / 12 h ciclo de oscuridad. Para obtener más información sobre Tribolium cría, las guías respectivas 64 están disponibles. Este protocolo requiere dos medios a base de harina diferentes, que se pueden preparar en cantidades kilogramo y almacenados durante varios meses. <ol><li> ...

Control de calidad En los ensayos de formación de imágenes en vivo, el procedimiento de preparación y la grabación debe ser no invasivo, es decir, ni la mecánica y manipulación de productos químicos (recogida, dechorionation, de montaje en el soporte de la muestra), ni la carga integrada de energía durante la observación debe afectar a la viabilidad de la muestra. Para los estudios que caracterizan el desarrollo WT, se recomienda el uso de datos sólo a par...

El escarabajo de la harina Tribolium castaneum rojo, que pertenece a la gran familia de escarabajos negros (Tenebrionidae), tiene una larga historia dentro de las ciencias agrícolas y de la vida y es el organismo modelo modelo de insectos segunda mejor estudiado después de la mosca de la fruta Drosophila melanogaster. Durante las últimas cuatro décadas, se convirtió en un poderoso y popular organismo modelo en la genética del desarrollo de insectos, en la biología del desarrollo evolutivo y, durante los últimos veinte años, en la morfogénesis embrionaria para una variedad de razones: Drosophila y Tribolium ambos pertenecen a la Holometabola, pero se separaron hace aproximadamente 300 millones de años 1, 2, 3, 4. Mientras que el desarrollo embrionario de Drosophila se considera comúnmente como altamente derivada, Tribolium muestra un modo más ancestral de develrrollo que se encuentra en una proporción considerablemente mayor de especies de insectos 5, 6, 7, 8, 9. En primer lugar, Tribolium exhibe desarrollo de la cabeza no involutiva, es decir, sus partes de la boca y las antenas ya surgen durante la embriogénesis 10, 11, 12, 13, 14, 15. En segundo lugar, Tribolium sigue los principios de desarrollo a corto germen, es decir, segmentos abdominales se añaden secuencialmente a partir de una zona de crecimiento posterior durante la elongación germband 16, 17, 18, 19. En tercer lugar, Tribolium desarrolla y se degrada más tardedos membranas extraembrionarias es decir, el amnios, que cubre el embrión solamente ventralmente, y la serosa, que envuelve el embrión completamente 20, 21, 22. Ambas membranas juegan un morfogenética fundamental 23 así como la función de protección contra los microorganismos 24, 25 y la desecación 26. En cuarto lugar, las piernas embrionaria en desarrollo son totalmente funcionales durante la etapa de la vida de las larvas y sirven como los primordios de las piernas de adultos durante la metamorfosis de pupa 27, 28, 29, 30, 31. Debido a su tamaño y modestos pequeñas demandas, el cultivo de Tribolium en el laboratorio es bastante sencillo. Los cultivos de tipo salvaje (WT) cepas o líneas transgénicas consisten típicamente de alrededor de 100-300 adultos y puede mantenerse dentro de botellas de un litro de vidrio (la huella de 80 cm 2) lleno de tres a cuatro centímetros de alto (aproximadamente 50 g) con medio de crecimiento que consiste en trigo de grano completo harina suplementado con levadura seca inactiva. Un suministro de agua no es necesario. Esto permite que incluso pequeños laboratorios para mantener docenas de culturas escarabajo dentro de incubadoras de insectos comercialmente disponibles pequeñas o medianas. Etapas de desarrollo posteriores de Tribolium (larvas después de aproximadamente el cuarto instar, pupas y adultos) se separan fácilmente del medio de crecimiento por tamizado. embriones sincronizados se obtienen mediante la incubación de los adultos, por períodos cortos en medio de puesta de huevos. Para el desarrollo rápido, culturas escarabajo se mantienen a 32 ° C (alrededor de cuatro semanas por generación), mientras se mantiene de stock se realiza típicamente a 22-25 ° C (aproximadamente diez semanas por generación). En la última década, muchos tec normahniques se han ido adaptando y optimizado para Tribolium, que se resumen en los libros Emergentes organismos modelo 32. De gran importancia son avanzados métodos genéticos tales como embrionario 33, larval 34, 35 o parental 36, 37 de ARN basado en la interferencia desmontables gen, la transformación de la línea germinal, ya sea con la piggyBac 38, 39 o el sistema de transposasa de Minos 40 y CRISPR / genoma basado en Cas9 ingeniería 41. Además, el genoma Tribolium ha sido secuenciado hace aproximadamente una década 42, y ahora está en la tercera ronda del genoma conjunto de liberación 43, que permite la identificación eficiente y de todo el genoma y el análisis sistemático de los genes 44 </sarriba&gt; u otros elementos genéticos 45, 46. Además, los genomas de otras cuatro especies de coleópteros están disponibles para los enfoques genéticos comparativos 47, 48, 49, 50. En asociación con el genoma secuenciado, dos análisis genéticos a gran escala se han realizado, es decir, una pantalla de mutagénesis de inserción 51 y una pantalla gen desmontables basado en la interferencia de ARN sistemática 52, 53. Fluorescencia de imágenes en vivo con campo amplio, confocal o microscopía basada en la lámina de luz (LSFM) permite observar la morfología embrionaria de Tribolium como una función del tiempo (es decir, la morfogénesis) en un contexto multi-dimensional (Tabla 1). En campo amplio y fluorescencia confocal de microscopía, la Excitación y la emisión de luz se guía a través de la misma lente objetivo. En ambos enfoques, la muestra entera se ilumina para cada plano de dos dimensiones grabado. Por lo tanto, las muestras se someten a niveles muy altos de energía. En LSFM, sólo los fluoróforos en el plano focal se excitan debido a un desacoplamiento de la iluminación y la detección mediante el uso de dos lentes de objetivo perpendicularmente dispuestas (Figura 1). LSFM viene en dos implementaciones canónicas - el plano único de iluminación de microscopio (SPIM) y el microscopio de fluorescencia basada en la lámina de luz láser escaneado digital (DSLM, la Figura 2) - y ofrece varias ventajas cruciales sobre los enfoques tradicionales: (i) capacidad de seccionamiento óptico intrínseco, (ii) resolución buena axial, (iii) fuertemente reducido nivel de foto-blanqueo, (iv) muy bajo foto-toxicidad, (v) alta relación señal-ruido, (vi) relativamente alta velocidad de adquisición, (vii) de formación de imágenes a lo largo de múltiples direcciones y (viii) la penetración de tejido más profundo debido a la utilización de apertura numérica iluminación baja lentes de objetivo 54, 55, 56. LSFM ya se ha aplicado con éxito en Tribolium para documentar casi toda la morfogénesis embrionaria 57 y para analizar los principios de la ruptura de la membrana extra-embrionario al inicio del cierre dorsal 23. Para aumentar el atractivo de LSFM en la comunidad Tribolium y para la ciencia de insectos en general, es de gran importancia para establecer procedimientos normalizados de trabajo y para mejorar los métodos, protocolos y el conjunto de recursos a un nivel en el microscopio se convierte en una facilidad de -use herramienta estándar en los laboratorios de biología del desarrollo, y las cuestiones biológicas permanecen en el centro de atención. Este protocolo comienza con los fundamentos de Tribolium &lt;/ em&gt; cultivo, es decir, el mantenimiento, la reproducción y la recolección de los embriones. A continuación, se ilustran dos estrategias experimentales: (i) de formación de imágenes en vivo de las líneas transgénicas a medida y (ii) de formación de imágenes de embriones fijos que se tiñeron con colorantes fluorescentes (Tabla 2). Posteriormente, tres técnicas de montaje con ligeramente diferentes propósitos se explican en detalle (Figura 3 y en la Tabla 3): (i) la columna de agarosa, (ii) el hemisferio agarosa y (iii) el nuevo soporte de tela de araña. El protocolo a continuación se explica el procedimiento de adquisición de datos con LSFM. modalidades de imagen y consideraciones clave se describen. Por último, la recuperación de embriones se explica y se proporcionan sugerencias para el procesamiento de datos básicos. En los resultados representativos, datos de imágenes en vivo de dos novela hechos a medida y se muestran las 58 líneas transgénicas Glia-azul y los respectivos conjuntos de datos de formación de imágenes se proporcionan como un recurso descargable. Además, una imagense presentan los datos de los embriones fijos que se tiñeron con una variedad de colorantes fluorescentes. La discusión se centra en el control de calidad, las limitaciones actuales del enfoque de imágenes en vivo y la adaptación del protocolo con otras especies. El protocolo está escrito para microscopios de fluorescencia basada en la lámina de luz que están equipadas con una cámara de muestra y un mecanismo de abrazadera giratoria para los titulares estandarizados de muestra 54, 59, 60, que son típicamente elementos en forma de cilindro de metal, plástico o vidrio con un diámetro en el rango de milímetros. El protocolo también es adecuado tanto para las implementaciones canónicas, es decir, SPIM y DSLM, así como para configuraciones con dos o más brazos de iluminación y detección 61, 62, 63. Los resultados representativos muestran datos de dos canales espectrales, verde (ILlumination con un láser de 488 nm, la detección a través de un filtro de 525/50 de paso de banda) y rojo (iluminación con un láser de 561 nm, la detección a través de un filtro de 607/70 de paso de banda), pero el protocolo se puede ampliar a tres o cuatro canales espectrales.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">full grain wheat flour</td>
			<td style="width:119px;">Demeter e.V.</td>
			<td style="width:71px;">1.13E+08</td>
			<td style="width:167px;">US: whole wheat flour, UK: whole meal flour</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">405 fine wheat flour</td>
			<td style="width:119px;">Demeter e.V.</td>
			<td style="width:71px;">1.13E+08</td>
			<td style="width:167px;">US: pastry flour, UK: soft flour</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">inactive dry yeast</td>
			<td style="width:119px;">Flystuff / Genesee Scientific</td>
			<td style="width:71px;">62-106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">10010-023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sodium hypochlorite, ~12% active Cl</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">425044-250ML</td>
			<td style="width:167px;">Caution: sodium hypochlorite is corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">low-melt agarose</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:71px;">6351.2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Orange Scientific</td>
			<td style="width:71px;">4430500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">24-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Orange Scientific</td>
			<td style="width:71px;">4430300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">glass capillaries, internal &#216; 0.46 mm</td>
			<td style="width:119px;">Brand GmbH + Co KG</td>
			<td style="width:71px;">7087 09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">SYTOX Green</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">57020</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">YOYO-1 Iodide</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">Y3601</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">BOBO-3 Iodide</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">B3586</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">A22283</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 800 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-051</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 710 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-050</td>
			<td style="width:167px;">for growth medium preparation (step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 300 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-040</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 250 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-038</td>
			<td style="width:167px;">for egg laying medium preparation (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">glass dish, &#216; 100 mm &#215; 20 mm</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">CLS70165102</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">cell strainer, 100 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:71px;">352360</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">paint brush, head &#216; 2 mm</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">149-2121</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">syringe, 1.0 ml</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun Medical AG</td>
			<td style="width:71px;">9166017V</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">scintillation vials</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">M1152-1000EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">158127</td>
			<td style="width:167px;">Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">n-heptane &#8805; 99%</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:71px;">8654.1</td>
			<td style="width:167px;">Caution: n-heptane is flammable and toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">X100-100ML</td>
			<td style="width:167px;">Caution: Trition X-100 is corrosive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained tribolium castaneum embryos

El escarabajo rojo de la harina Tribolium castaneum se ha convertido en un importante organismo modelo de insectos en la genética del desarrollo y la biología del desarrollo evolutivo. La observación de embriones Tribolium con microscopía de fluorescencia basada en la lámina de luz tiene múltiples ventajas sobre widefield convencional y microscopía de fluorescencia confocal. Debido a las propiedades únicas de un microscopio a base de lámina de luz, imágenes en tres dimensiones de los especímenes vivos se pueden grabar con altas relaciones de señal a ruido y redujeron significativamente foto-blanqueo, así como foto-toxicidad a lo largo de múltiples direcciones durante períodos que duran varios días. Con más de cuatro años de desarrollo metodológico y un aumento continuo de datos, el tiempo parece conveniente establecer procedimientos operativos estándar para el uso de la tecnología de lámina de luz en la comunidad Tribolium, así como en la comunidad de insectos en general. Este protocolo describe tres técnicas de montaje adecuadas fo diferentes propósitos, presenta dos nuevas líneas Tribolium transgénicos medida apropiada para imágenes en vivo a largo plazo, sugiere cinco colorantes fluorescentes para etiquetar las estructuras intracelulares de embriones fijos y proporciona información acerca de post-procesamiento de datos para la evaluación oportuna de los datos registrados. Los resultados representativos se concentran en imágenes en vivo a largo plazo, seccionamiento óptico y la observación del mismo embrión a lo largo de múltiples direcciones. Los respectivos conjuntos de datos se proporcionan como un recurso descargable. Por último, el protocolo analiza los controles de calidad para los ensayos de formación de imágenes en vivo, las limitaciones actuales y la aplicabilidad de los procedimientos que se indican a otras especies de insectos. Este protocolo está destinado principalmente a los biólogos del desarrollo que buscan soluciones de imágenes que superan a equipo de laboratorio estándar. Promueve el intento continuo para cerrar la brecha entre los laboratorios / comunidades técnicamente orientada, que se desarrollan y refinan microscopiar metodológicamente, y los laboratorios de ciencias de la vida / comunidades, que requieren soluciones &#39;plug-and-play&#39; a los desafíos técnicos. Además, es compatible con un enfoque axiomático que mueve las cuestiones biológicas en el centro de atención.

Este protocolo describe un marco experimental para formación de imágenes de fluorescencia de vida o embriones fijados y teñidos Tribolium con LSFM. Debido a los bajos niveles de foto-blanqueador y foto-toxicidad, una consecuencia directa de su capacidad de seccionamiento óptico, LSFM es particularmente muy adecuado para imágenes en vivo a largo plazo. La novela AGOC {ATub&#39;H2B-mEmerald} # 1 línea transgénica...

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Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Imágenes de la morfogénesis de los embriones de insectos con microscopía de fluorescencia basada en la hoja de luz se ha convertido en estado de la técnica. Este protocolo describe y compara tres técnicas de montaje adecuadas para los embriones Tribolium castaneum, introduce dos nuevos líneas transgénicas medida muy adecuado para imágenes en vivo, discute los controles de calidad esenciales e indica limitaciones experimentales actuales.

Microscopía de fluorescencia de vida o fijadas y teñidas a base de hoja de luz<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Los embriones

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Medición de la estabilidad de proteínas en la sala de embriones de pez cebra Utilizando fluorescencia Decay Después Fotoconversión (FDAP)

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Investigación

Biología del Desarrollo

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Microscopía de lámina de luz isotrópica y análisis de linaje celular automatizado para catalogar Caenorhabditis elegans embriogénesis con resolución subcelular

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Microinyección de ADN en los oculares en embriones de Xenopus laevis e imágenes de gFP que expresan los árboles axonales ópticos en los renacuajos de Xenopus vivos

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

Un método de montaje en capas para la microscopía confocal de lapso de tiempo extendido de embriones enteros de pez cebra

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Expresión de GFP inducida por la luz en embriones de pez cebra utilizando el sistema optogenético TAEL/C120

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...