Name: light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained tribolium castaneum embryos
Uploaded: 2017-04-28T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos at JoVE.com

Vi tackar Sven Plath för teknisk support. Den Glia-blå transgen linje var en vänlig gåva från Gregor Bucher (Göttingen, Tyskland). Forskningen har finansierats av Cluster of Excellence Frankfurt am Main för Makromolekylär (CEF-MC, EXC 115, högtalare Volker Dötsch) beviljades delvis EHKS vid Buchmann Institutet för molekylär Life Sciences (BMLS, regissören Enrico Schleiff) vid Goethe Universität Frankfurt am Main av Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG).

1. Husbandry av Tribolium kulturer OBS: Standardbetingelser definieras som en inkubationstemperatur av 25 ° C och 70% relativ fuktighet i en 12 h ljus / 12 h mörker-cykel. För mer information om Tribolium djurhållning, respektive riktlinjer finns 64. Detta protokoll kräver två olika mjölbaserade media, som kan framställas i kilogram kvantiteter och lagras under flera månader. <ol><li> Före arbetet med mjöl och inaktiv torrjäst, lagra de...

Kvalitetskontroll I levande imaging assays, måste beredningen och inspelningsförfarande vara icke-invasiv, dvs varken den mekaniska och kemiska hantering (insamling, dechorionation, montering på provhållaren) eller den integrerade energibelastningen under observationen bör påverka viabiliteten av provet. För studier som kännetecknar WT utveckling, är det rekommenderat att bara använda data från experiment där embryot överlever inspelningsprocessen, häm...

Den röda mjölbagge Tribolium castaneum, som tillhör den stora familjen av mjölmaskar (Tenebrionidae), har en lång historia inom jordbruks- och biovetenskap och är den näst bäst studerade modellen insekt modellorganism efter bananfluga Drosophila melanogaster. Under de senaste fyra decennierna, blev det en mäktig och populär insekt modellorganism i utvecklingsgenetik, i evolutionär utvecklingsbiologi och under de senaste tjugo åren, embryonala morfogenes för en rad olika skäl: Drosophila och Tribolium båda tillhör Holometabola, men avvek ungefär 300 miljoner år sedan 1, 2, 3, 4. Medan den embryonala utvecklingen av Drosophila anses allmänt som mycket härstammar visar Tribolium mer fäderneärvda sätt develling som finns i en betydligt större andel av insektsarter 5, 6, 7, 8, 9. För det första, Tribolium uppvisar icke-inrullade huvud utveckling, dvs dess mundelar och antenner uppstår redan under embryogenes 10, 11, 12, 13, 14, 15. För det andra, Tribolium följer principerna för kortgroddar utveckling, dvs abdominala segmenten tillsätts i tur och ordning från en bakre tillväxtzonen under germband töjning 16, 17, 18, 19. För det tredje utvecklar Tribolium och senare bryts nedtvå extra-embryonala membranen dvs amnion, som täcker embryot endast ventralt, och serosa, vilket omsluter embryot helt 20, 21, 22. Båda membranen spelar en avgörande morfogenetiska 23 liksom skyddande roll mot mikroorganismer 24, 25 och uttorkning 26. För det fjärde, de embryonal utveckling benen är fullt fungerande under larvstadiet och fungera som primordia för vuxna ben under PUPP metamorfos 27, 28, 29, 30, 31. På grund av sin ringa storlek och blygsamma krav, är odling av Tribolium i laboratoriet ganska enkelt. Kulturer av vildtyp (WT) stammar eller transgena linjerna består typiskt av omkring 100-300 vuxna och kan hållas inom en-liters glasflaskor (fotavtryck 80 cm 2) fylld tre till fyra centimeter hög (omkring 50 g) med tillväxtmedium som består av full grain vete mjöl kompletterat med inaktiv torrjäst. En vattenförsörjning är inte nödvändigt. Detta gör att även små laboratorier för att hålla dussintals skalbagge kulturer inom små och medelstora kommersiellt tillgängliga insekts inkubatorer. Senare utvecklingsstadier Tribolium (larver efter ungefär den fjärde stadiet, puppor och vuxna) kan lätt separeras från tillväxtmediet genom siktning. Synkroniserade embryon erhålls genom inkubation vuxna för korta perioder på äggläggning medium. För snabb utveckling, är skalbagge kulturer hölls vid 32 ° C (omkring fyra veckor per generation), medan lagerhållning utförs typiskt vid 22-25 ° C (cirka tio veckor per generation). Inom det senaste decenniet har många standard techniques har successivt anpassas och optimeras för Tribolium, som sammanfattas i Emerging modellorganismer böcker 32. Av stor betydelse är avancerade genetiska metoder såsom embryonal 33, larval 34, 35 eller moder 36, 37 RNA-interferens-baserad gen knockdown, arvslinjetransformation med antingen piggyBac 38, 39 eller Minos 40 transposas systemet och CRISPR / Cas9 baserade genomet engineering 41. Vidare har Tribolium genomet sekvenserats ungefär ett decennium sedan 42, och är nu i den tredje omgången av genomet aggregatet släpp 43, som tillåter effektiv och genomet hela identifiering och systematisk analys av gener 44 </supp&gt; eller andra genetiska element 45, 46. Dessutom, genomen av fyra andra ordningen skalbaggar arter är tillgängliga för jämförande genetiska tillvägagångssätt 47, 48, 49, 50. I association med den sekvense genomet, har två storskaliga genetiska analyser utförts, dvs en infogningsmutagenes skärm 51 och en systematisk RNA-interferens-baserad gen knockdown skärm 52, 53. Fluorescens levande avbildning med widefield, konfokal eller ljus ark baserad mikroskopi (LSFM) gör det möjligt att observera den embryonala morfologi Tribolium som en funktion av tiden (dvs morfogenes) i en flerdimensionell sammanhang (tabell 1). I Widefield och konfokal fluorescensmikroskopi, den EXCITation och emissionsljuset leds genom samma objektivlins. I bägge metoderna är hela provet belyses för varje inspelad tvådimensionellt plan. Därmed är proverna utsattes för mycket höga energinivåer. I LSFM, endast fluoroforerna i fokalplanet exciteras på grund av en frikoppling av belysning och detektering genom att använda två vinkelrätt anordnade objektivlinser (figur 1). LSFM kommer i två kanonisk implementeringar - den enda plan belysningsmikroskop (SPIM) och den digitala avsökta laserljuset arket baserade fluorescensmikroskop (DSLM, figur 2) - och erbjuder flera avgörande fördelar jämfört med traditionella metoder: (i) inneboende optisk sektione kapacitet, (ii) god axiell upplösning, (iii) kraftigt reducerad nivå av fotoblekning, (iv) mycket låg fototoxicitet, (v) högt signal-till-brusförhållande, (vi) relativt hög uppsamlingshastighet, (vii) imaging längs flera riktningar och (viii) djupare vävnadspenetrering på grund av användningen av låg numerisk apertur belysning objektivlinser 54, 55, 56. LSFM har redan framgångsrikt tillämpats i Tribolium att dokumentera nästan hela embryonala morfogenes 57 och analysera principerna för extra embryonala membran bristning i början av rygglutning 23. För att höja attraktionskraft LSFM i Tribolium samhället och för insekts vetenskap i allmänhet, är det av stor vikt att etablera standardrutiner och förbättra metoder, protokoll och den pool av resurser till en nivå där mikroskopet blir en enkel att -använda standardverktyg i utvecklingsbiologiska laboratorier och biologiska frågor bo i centrum för uppmärksamheten. Detta protokoll börjar med grunderna i Tribolium &lt;/ em&gt; odling, dvs underhåll, reproduktion och embryosamlings. Nästa, är två experimentella strategier illustreras: (i) levande avbildning av skräddarsydda transgena linjerna och (ii) bildåtergivning av fasta embryon som var färgade med fluorescerande färgämnen (tabell 2). Därefter tre monteringstekniker med något olika ändamål förklaras i detalj (figur 3 och tabell 3): (i) agaroskolonn, (ii) agarosen hemisfären och (iii) den nya spindelvävshållaren. Protokollet förklarar sedan datainsamlings förfarandet med LSFM. Avbildningsmetoder och nyckel överväganden beskrivs. Slutligen embryo hämtning förklaras och förslag på grundläggande databehandling tillhandahålls. I de representativa resultat, aktuella bilddata från två nya skräddarsydda och Glia-blå 58 transgena linjerna visas och de respektive avbildningsdatauppsättningar är anordnade som en nedladdningsbar resurs. Dessutom, avbildadata för fasta embryon som färgades med en mängd olika fluorescensfärgämnen presenteras. Diskussionen fokuserar på kvalitetskontroll, nuvarande begränsningar av levande avbildningsteknik och anpassning av protokollet till andra arter. Protokollet är skriven för lätta skivbaserade fluorescensmikroskop som är utrustade med en provkammare och en roterbar klämmekanism för standardiserade provhållare 54, 59, 60, vilka typiskt är cylinderformade element tillverkade av metall, plast eller glas med en diameter i millimeterområdet. Protokollet är också lämplig för både kanonisk implementeringar, dvs. SPIM och DSLM, såväl som för uppställningar med två eller flera belysnings- och detekteringsarmarna 61, 62, 63. De representativa resultat visar data i två spektralkanaler, grön (illumination med en 488 nm laser, upptäckt genom ett 525/50 bandpassfilter) och röd (belysning med en 561 nm laser, upptäckt genom ett 607/70 bandpassfilter), men protokollet kan utökas till tre eller fyra spektralkanaler.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="573">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">full grain wheat flour</td>
			<td style="width:119px;">Demeter e.V.</td>
			<td style="width:71px;">1.13E+08</td>
			<td style="width:167px;">US: whole wheat flour, UK: whole meal flour</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">405 fine wheat flour</td>
			<td style="width:119px;">Demeter e.V.</td>
			<td style="width:71px;">1.13E+08</td>
			<td style="width:167px;">US: pastry flour, UK: soft flour</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">inactive dry yeast</td>
			<td style="width:119px;">Flystuff / Genesee Scientific</td>
			<td style="width:71px;">62-106</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">phosphate-buffered saline (PBS), pH 7.4</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">10010-023</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sodium hypochlorite, ~12% active Cl</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">425044-250ML</td>
			<td style="width:167px;">Caution: sodium hypochlorite is corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">low-melt agarose</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:71px;">6351.2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">6-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Orange Scientific</td>
			<td style="width:71px;">4430500</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">24-well plate</td>
			<td style="width:119px;">Orange Scientific</td>
			<td style="width:71px;">4430300</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">glass capillaries, internal &#216; 0.46 mm</td>
			<td style="width:119px;">Brand GmbH + Co KG</td>
			<td style="width:71px;">7087 09</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">SYTOX Green</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">57020</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">YOYO-1 Iodide</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">Y3601</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">BOBO-3 Iodide</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">B3586</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Alexa Fluor 488 Phalloidin</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">A12379</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Alexa Fluor 546 Phalloidin</td>
			<td style="width:119px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:71px;">A22283</td>
			<td style="width:167px;">Staining solution preparation is explained in Table 2</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 800 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-051</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 710 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-050</td>
			<td style="width:167px;">for growth medium preparation (step 1.1)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 300 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-040</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">sieve, 250 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">200.025.222-038</td>
			<td style="width:167px;">for egg laying medium preparation (step 1.2)</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">glass dish, &#216; 100 mm &#215; 20 mm</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">CLS70165102</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">cell strainer, 100 &#181;m mesh size</td>
			<td style="width:119px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:71px;">352360</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">paint brush, head &#216; 2 mm</td>
			<td style="width:119px;">VWR International</td>
			<td style="width:71px;">149-2121</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">syringe, 1.0 ml</td>
			<td style="width:119px;">B. Braun Medical AG</td>
			<td style="width:71px;">9166017V</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">scintillation vials</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">M1152-1000EA</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">paraformaldehyde</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">158127</td>
			<td style="width:167px;">Caution: paraformaldehyde is toxic and corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">n-heptane &#8805; 99%</td>
			<td style="width:119px;">Carl Roth</td>
			<td style="width:71px;">8654.1</td>
			<td style="width:167px;">Caution: n-heptane is flammable and toxic</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Triton X-100</td>
			<td style="width:119px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:71px;">X100-100ML</td>
			<td style="width:167px;">Caution: Trition X-100 is corrosive</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

light sheet-based fluorescence microscopy of living or fixed and stained tribolium castaneum embryos

Den röda mjölbagge Tribolium castaneum har blivit en viktig insekt modellorganism i utvecklingsgenetik och evolutionär utvecklingsbiologi. Observationen av Tribolium embryon med ljus ark baserade fluorescensmikroskopi har flera fördelar jämfört med konventionell widefield och konfokal fluorescensmikroskopi. På grund av de unika egenskaperna hos en ljus ark baserad mikroskop, kan tredimensionella bilder av levande exemplar registreras med högt signal-till-brusförhållanden och signifikant reducerad fotoblekning liksom foto-toxicitet längs flera riktningar över perioder som varar flera dagar. Med mer än fyra år av metodutveckling och en kontinuerlig ökning av data, verkar tiden lämpligt att fastställa standardrutiner för användning av ljus ark teknik i Tribolium samhället samt i insekts samhället i stort. Detta protokoll beskriver tre monteringstekniker lämpliga feller olika syften, presenterar två nya skräddarsydda transgena Tribolium linjer lämpliga för långsiktig levande avbildning, föreslår fem fluorescerande färgämnen för att märka intracellulära strukturer fasta embryon och ger information om uppgifter efterbehandling för tid utvärdering av de registrerade uppgifterna. Representativa resultat koncentrera sig på långsiktig levande avbildning, optisk sektione och observationen av samma embryo längs flera riktningar. Respektive dataset tillhandahålls som en nedladdningsbar resurs. Slutligen diskuterar protokoll kvalitetskontroller för live imaging assays, aktuella begränsningar och tillämpligheten av de beskrivna förfarandena till andra insektsarter. Detta protokoll är främst avsedd för utvecklingsbiologer som söker bildlösningar som överträffar standardlaboratorieutrustning. Det främjar den kontinuerliga försök att stänga gapet mellan de tekniskt inriktade laboratorier / samhällen, som utvecklar och förbättra microskopiera metodiskt och life science laboratorier / samhällen, som kräver &#39;plug-and-play&#39; lösningar på tekniska utmaningar. Dessutom stöder ett självklart synsätt som flyttar biologiska frågor i centrum för uppmärksamheten.

Detta protokoll beskriver en experimentell ram för fluorescens avbildning av levande eller fixerade och färgade Tribolium embryon med LSFM. På grund av de låga nivåer av fotoblekning och fototoxicitet, en direkt följd av dess optiska sektionering kapacitet, är LSFM särskilt väl lämpad för långsiktig levande avbildning. Den nya AGOC {ATub&#39;H2B-mEmerald} # 1 transgen linje uttrycker ett histone2B-mEmerald...

Watch this Scientific Journal Video about Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos at JoVE.com

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Avbildning av morfogenes av insektsembryon med ljus ark baserade fluorescensmikroskopi har blivit teknikens ståndpunkt. Detta protokoll beskriver och jämför tre monteringstekniker som är lämpliga för Tribolium castaneum embryon, introducerar två nya skräddarsydda transgena linjerna väl lämpade för levande avbildning, diskuterar väsentliga kvalitetskontroller och indikerar aktuella experimentella begränsningar.

Ljus Sheet-baserade fluorescensmikroskopi av levande eller fixeras och färgas<em&gt; Tribolium castaneum</em&gt; Embryon

The red flour beetle Tribolium castaneum has become an important insect model organism in developmental genetics and evolutionary developmental biology. ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Light Sheet-based Fluorescence Microscopy of Living or Fixed and Stained Tribolium castaneum Embryos

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion (FDAP)

Measuring Protein Stability in Living Zebrafish Embryos Using Fluorescence Decay After Photoconversion FDAP

Mätning Protein Stabilitet i Living Zebrafish embryon Använda Fluorescens Decay Efter Photoconversion (FDAP)

Protein stability influences many aspects of biology, and measuring the clearance kinetics of proteins can provide important insights into biological ...

Methods for Precisely Localized Transfer of Cells or DNA into Early Postimplantation Mouse Embryos

Metoder för Exakt Lokaliserad Överföring av celler eller DNA i tidig postimplantationsförlust musembryon

Manipulation and culture of early mouse embryos is a powerful yet largely under-utilized technology enhancing the value of this model system. Conversely, ...

Using Light Sheet Fluorescence Microscopy to Image Zebrafish Eye Development

Använda ljus Sheet fluorescensmikroskopi till bild Zebrafish Eye utveckling

Light sheet fluorescence microscopy (LSFM) is gaining more and more popularity as a method to image embryonic development. The main advantages of LSFM ...

Induction of Hypoxia in Living Frog and Zebrafish Embryos

Induktion av hypoxi i levande groda och zebrafiskembryon

Here, we introduce a novel system for hypoxia induction, which we developed to study the effects of hypoxia in aquatic organisms such as frog and ...

Quantitative Whole-mount Immunofluorescence Analysis of Cardiac Progenitor Populations in Mouse Embryos

Kvantitativa hela-mount immunofluorescens analys av hjärt stamceller populationer i musembryon

The use of ever-advancing imaging techniques has contributed broadly to our increased understanding of embryonic development. Pre-implantation development ...

Multimodal Hierarchical Imaging of Serial Sections for Finding Specific Cellular Targets within Large Volumes

Multimodal hierarkiska avbildning av seriell avsnitt för att hitta specifika cellulära mål inom stora volymer

Targeting specific cells at ultrastructural resolution within a mixed cell population or a tissue can be achieved by hierarchical imaging using a ...

Isotropic Light-Sheet Microscopy and Automated Cell Lineage Analyses to Catalogue Caenorhabditis elegans Embryogenesis with Subcellular Resolution

Isotropisk Ljusplåt Mikroskopi och automatiserad cell Lineage analyser till katalogen Caenorhabditis elegans Embryogenesis med subcellulär upplösning

Caenorhabditis elegans (C. elegans) stands out as the only organism in which the challenge of understanding the cellular origins of an entire nervous ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

Mikroinjektion av DNA i Ögonknoppar i Xenopus laevis embryon och avbildning av GFP uttrycker optiska Axonala arbors i intakt, levande Xenopus grodyngel

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

A Layered Mounting Method for Extended Time-Lapse Confocal Microscopy of Whole Zebrafish Embryos

En skiktad monteringsmetod för utökad tidsfördröjning konfokalmikroskopi av hela Zebrafish embryon

Dynamics of development can be followed by confocal time-lapse microscopy of live transgenic zebrafish embryos expressing fluorescence in specific tissues ...

Light-Induced GFP Expression in Zebrafish Embryos using the Optogenetic TAEL/C120 System

Ljusinducerat GFP-uttryck i zebrafiskembryon med optogenetisk TAEL/C120-system

Inducible gene expression systems are an invaluable tool for studying biological processes. Optogenetic expression systems can provide precise control ...