Name: harnessing the dna dye-triggered side population phenotype to detect and purify cancer stem cells from biological samples
Uploaded: 2017-05-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples at JoVE.com

Maximilian Boesch è sostenuto da una borsa Erwin Schrödinger del Fondo australiano di scienze FWF (numero di sovvenzione J-3807).

Questo protocollo è in piena conformità con le linee guida del consiglio di revisione etica istituzionale. Se il tessuto umano o animale viene studiato utilizzando il protocollo qui descritto, i ricercatori sono tenuti ad avere l&#39;approvazione del pertinente organo di revisione della loro istituzione o paese. Attenzione: per questo protocollo si applicano le precauzioni standard per la manipolazione sicura dei campioni biologici. Ciò include indossare guanti e un cappotto di laboratori...

<ol>
	<li>Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+the+cancer+stem+cells+-+what+challenges+do+they+pose?.">Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose?.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Cancer+Stem+Cells:+Rationale+for+Targeting+the+Stem+Cell+Niche.">Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche.</a> Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+cancer+relapse+and+metastasis+by+inhibiting+cancer+stemness.">Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).</li><li>Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., G&#246;tte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+in+cancer+stem+cell+analysis+and+separation.">Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation.</a> Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).</li><li>Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase:+its+role+as+a+cancer+stem+cell+marker+comes+down+to+the+specific+isoform.">Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform.</a> Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).</li><li>Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+appraisal+of+the+side+population+assay+in+stem+cell+and+cancer+stem+cell+research.">Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+&amp;#34;side+population&amp;#34;+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct &amp;#34;side population&amp;#34; of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+side+population+of+ovarian+cancer+cells+defines+a+heterogeneous+compartment+exhibiting+stem+cell+characteristics.">The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics.</a> Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).</li><li>Szotek, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+side+population+defines+cells+with+stem+cell-like+characteristics+and+Mullerian+Inhibiting+Substance+responsiveness.">Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).</li><li>Brown, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+benign+and+malignant+prostate+epithelial+Hoechst+33342+side+populations.">Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations.</a> Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).</li><li>Mathew, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCG2-mediated+DyeCycle+Violet+efflux+defined+side+population+in+benign+and+malignant+prostate.">ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate.</a> Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).</li><li>Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCF7+side+population+cells+with+characteristics+of+cancer+stem/progenitor+cells+express+the+tumor+antigen+MUC1.">MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1.</a> Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).</li><li>Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+human+lung+cancer+cell+lines+and+tumors+is+enriched+with+stem-like+cancer+cells.">Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells.</a> Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).</li><li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometrial+cancer+side-population+cells+show+prominent+migration+and+have+a+potential+to+differentiate+into+the+mesenchymal+cell+lineage.">Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage.</a> Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).</li><li>Bleau, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN/PI3K/Akt+pathway+regulates+the+side+population+phenotype+and+ABCG2+activity+in+glioma+tumor+stem-like+cells.">PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).</li><li>Harris, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+are+enriched+in+the+side+population+cells+in+a+mouse+model+of+glioma.">Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma.</a> Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).</li><li>Murase, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+cells+have+the+characteristics+of+cancer+stem-like+cells/cancer-initiating+cells+in+bone+sarcomas.">Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas.</a> Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).</li><li>Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Stem+Cell+Detection+Using+the+DyeCycle-Triggered+Side+Population+Phenotype.">Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype.</a> Stem Cells Int. 2016, 1652389 (2016).</li><li>Golebiewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+human+glioblastoma+is+non-tumorigenic+and+characterizes+brain+endothelial+cells.">Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells.</a> Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+transporter-mediated+protection+of+cancer+stem+cells+from+ionophore+antibiotics.">Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics.</a> Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).</li><li>Fukunaga-Kalabis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin-C+promotes+melanoma+progression+by+maintaining+the+ABCB5-positive+side+population.">Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population.</a> Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).</li><li>Dean, M., Fojo, T., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+stem+cells+and+drug+resistance.">Tumour stem cells and drug resistance.</a> Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+analysis+using+a+violet-excited+cell-permeable+DNA+binding+dye.">Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye.</a> Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+side+population+in+human+cancer+cell+lines.">High prevalence of side population in human cancer cell lines.</a> Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).</li><li>Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Primary+Human+Colon+Tumor+Cells+from+Surgical+Tissues+and+Culturing+Them+Directly+on+Soft+Elastic+Substrates+for+Traction+Cytometry.">Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry.</a> J Vis Exp. (100), e52532 (2015).</li><li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+human+glioblastoma+multiforme+tumor+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. (56), e3633 (2011).</li><li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry.">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> J Vis Exp. (83), e51088 (2014).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DyeCycle+Violet+used+for+side+population+detection+is+a+substrate+of+P-glycoprotein.">DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein.</a> Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).</li><li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+is+enriched+in+tumorigenic,+stem-like+cancer+cells,+whereas+ABCG2++and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic.">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li><li>Guha, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+promotes+apoptosis+resistance+of+breast+cancer+cells+and+enrichment+of+side+population+cells+with+cancer+stem+cell-like+properties+via+a+signaling+cascade+involving+galectin-3,+alpha9+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+STAT3.">Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3.</a> Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).</li></ol>

I progressi nella gestione clinica del cancro dipendono anche dallo sviluppo delle modalità di trattamento che mirano ai CSC. I metodi che consentono l&#39;isolamento affidabile dei CSC da campioni biologici accelerano l&#39;individuazione di obiettivi idonei e sono quindi di fondamentale importanza in questo sforzo. L&#39;analisi SP è una tecnica consolidata e preziosa per identificare le popolazioni CSC che esprimono i trasportatori di farmaci ABC e l&#39;implementazione di DCV ha esteso la sua applicabilità agli s...

L&#39;efficacia delle terapie tumorali primarie è migliorata sostanzialmente nell&#39;ultimo decennio a causa di progressi impellenti nella comprensione genetica e molecolare della malattia e l&#39;avvento di farmaci mirati come anticorpi terapeutici e inibitori di piccole molecole. Al contrario, la malattia metastatica e recidiva è ancora tipicamente incurabile e la morbilità e la mortalità rimangono elevate in questi ambiti clinici. I CSC rappresentano una sottopopolazione distinta all&#39;interno dei tumori e sono dotate di proprietà canoniche delle cellule staminali come la clonogenicità / tumorigenicità, la resistenza multi-farmaco e la divisione asimmetrica delle cellule 1 , 2 . Così, i CSC non solo guidano la progressione metastatica e l&#39;eterogeneità dei tumori, ma persistono anche durante il trattamento per predisporre il paziente alla ricaduta. L&#39;eliminazione terapeutica del CSC è quindi un importante bisogno medico per prevenire la ricorrenza delle malattie e consentire la cura a lungo termine del cancro 3 </sup&gt;. L&#39;identificazione delle vulnerabilità e la spiegazione delle strategie di eradicazione dei CSC dipendono fortemente da metodi che permettono la loro depurazione da campioni biologici per la successiva profilazione dell&#39;espressione e / o l&#39;analisi funzionale. A loro volta, tali metodi si basano su marcatori superficiali, intracellulari o funzionali che sono specifici per queste cellule. I marcatori di superficie specifici del CSC includono, ma non sono limitati a, CD44, CD133, CD24 e CD90 e sono stati utilizzati per identificare le popolazioni CSC in una varietà di entità tumorali tra cui il cancro al seno e il cancro del colon 4 . Un altro marcatore, l&#39;aldehyde dehydrogenase (ALDH), mostra localizzazione intracellulare e può essere rilevato funzionalmente fornendo un rispettivo substrato la cui conversione enzimatica produce luce. Utilizzando questo test, le popolazioni CSC sono state identificate anche in diverse entità tumorali 5 . Un metodo complementare, comunemente indicato come analisi SP e rappresentato qui in m<html> Dettaglio etodologico, utilizza efflux attivo di coloranti da parte dei trasportatori di droga ABC per identificare piccole popolazioni di cellule simili allo stelo-like fluorescenza 6 , 7 , 8 . A tal fine, un determinato campione viene incubato in presenza di un fluoroforo lipofilico legato al DNA che entra in tutte le cellule attraverso la diffusione passiva e colpisce DNA nucleare e mitocondriale per il legame. Non-CSC privi di espressione di trasportatore di droga ABC accumulano il colorante con conseguente fluorescenza luminosa, mentre CSC estrudono attivamente il colorante che riduce la fluorescenza. L&#39;inibizione farmacologica dell&#39;attività del trasportatore di farmaci abroga e conferma funzionalmente il fenotipo della SP e deve essere utilizzato per scopi di controllo. Le popolazioni CSC che presentano caratteristiche SP sono state divulgate, tra l&#39;altro, nei tumori ovarici 9 , 10 , cancro alla prostata 11 ,&gt; 12, cancro mammario 13 , cancro polmonare 14 , cancro endometriale 15 , glioma 16 , 17 e sarcoma osseo 18 . Importante, il saggio SP è compatibile sia con le linee cellulari sia con i tessuti tumorali primari, anche se il materiale primario presenta ulteriori sfide, come il requisito di una specifica strategia di discriminazione delle cellule tumorali (alcune popolazioni delle cellule ospitanti possono anche esibire le caratteristiche della SP) 19 , 20 . I due più tradizionali trasportatori di farmaci che forniscono SP sono ABCB1 / P-glicoproteina / MDR1 / CD243 e ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Tuttavia, altri trasportatori di farmaci possono essere un determinante molecolare del fenotipo SP ( ad es. , ABCB5) 22 . ABCB1Possono essere bloccati in modo efficace con verapamil mentre l&#39;attività di ABCG2 può essere specificamente abrogata con fumitremorgina C (FTC) 6,19. Una particolare forza di analisi SP è che può essere combinata con altri colorazioni ( ad esempio , marcatori superficiali e ALDH) e che consente il recupero delle cellule vive in modo compatibile con le indagini funzionali a valle. Inoltre, la rilevazione di SP è ampiamente applicabile a causa dell&#39;alta conservazione dei trasportatori di farmaci ABC tra le popolazioni CSC 9 , 23 . In origine, il rilevamento della SP è stato eseguito usando Hoechst 33342 come un colorante di innesco 24 . Questo colorante raggiunge un&#39;ottima risoluzione ma richiede l&#39;eccitazione laser ultravioletta; Pertanto la sua applicabilità è naturalmente limitata agli strumenti citometrici a flusso di alta gamma. L&#39;avvento di DyeCycle Violet (DCV) 25 ha aperto un nuovo avenuEs per l&#39;analisi SP e ha esteso l&#39;applicabilità di questo metodo a standard strumenti citometrici a flusso senza una sorgente laser ultravioletta (una sorgente laser viola è sufficiente a risolvere le cellule DCV-SP). Importante, Hoechst 33342 e DCV condividono le specifiche specifiche della pompa, indicando che entrambi i coloranti dovrebbero identificare le stesse popolazioni cellulari. Qui forniamo un protocollo sperimentale dettagliato di analisi SP basata su DCV per una riproduzione rapida e facile in laboratori indipendenti. Riconosciamo pertanto il nostro articolo come risorsa per i ricercatori CSC che dovrebbero contribuire all&#39;ottimizzazione e alla standardizzazione di questo metodo cellulare-biologico utile.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vybrant DyeCycle Violet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V35003</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td>Dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumitremorgin C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9054</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD (or propidium iodide)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420403</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Violet laser source required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes (round-bottom)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Tubes with cap recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cut-off strainers</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Optional but recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Only relevant for tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>01700</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harnessing the dna dye-triggered side population phenotype to detect and purify cancer stem cells from biological samples

Il cancro è una malattia a base di cellule staminali e l&#39;eradicazione di queste cellule è diventata un importante obiettivo terapeutico. Decifrare le vulnerabilità delle cellule staminali del cancro (CSC) e identificare opportuni obiettivi molecolari si basa su metodi che permettono la loro discriminazione specifica in campioni eterogenei come linee cellulari e tessuti tumorali ex vivo . La citometria di flusso / FACS è una tecnologia potente per analizzare in maniera multiparametrica campioni biologici a livello di singola cellula e finora è il metodo di scelta per recuperare le cellule vive per analisi a valle. I marcatori di superficie come CD44 e CD133 e la rilevazione di attività enzimatica di aldeideideideide sono state spesso utilizzate per definire e risolvere CSC da campioni tumorali da parte di FACS. Un approccio complementare, descritto qui in dettaglio metodologico, utilizza l&#39;estrusione funzionale di coloranti da parte dei trasportatori di farmaci ABC, che identifica una popolazione distinta di cellule di fluorescenza dimamente comunemente definite come popolazione laterale (SP). SP, Le cellule tumorali presentano caratteristiche delle cellule staminali canoniche e possono essere abrogate e confermate funzionalmente utilizzando agenti che inibiscono il trasportatore di droga estrudente (più spesso ABCB1 / P-glicoproteina / MDR1 / CD243 e ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Inoltre, il saggio SP è compatibile con altre valutazioni citometriche di flusso, quali la colorazione di antigeni superficiali, la rilevazione di deidrogenasi di aldeide e la discriminazione delle cellule morte ( ad es . Con 7-AAD o ioduro di propidium (PI)). Quindi descriviamo un metodo prezioso e ampiamente applicabile per l&#39;identificazione, l&#39;isolamento e la sub-caratterizzazione CSC meccanicamente basata su un parametro funzionale, piuttosto che fenotipico. Anche se in origine viene eseguito con Hoechst 33342 come tintura di innesco, qui ci concentriamo sul più recente fenotipo SP a base di coloranti Violet che è risolvibile su qualsiasi cytometro di flusso dotato di una sorgente laser viola.

Fornito è un&#39;analisi SP rappresentativa delle cellule A2780, una linea di cellule tumorali ovariche umane precedentemente dimostrato di portare una contabilità SP per meno dell&#39;1% delle cellule 9 . Le cellule sono state coltivate a 37 ° C in RPMI 1640 integrato con 10% ( v / v ) FBS, 2mM L-glutammina e 1x penicillina / streptomicina e raccolte a confluenza dell&#39;85% utilizzando il trattamento con 0,05% di tripsina EDTA. Le cellule sono state...

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Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

I metodi che consentono la caratterizzazione e l&#39;isolamento delle popolazioni di cellule staminali da campioni biologici sono critici per l&#39;avanzamento dei trattamenti mirati alle cellule staminali nei cancri e oltre. Qui forniamo un protocollo dettagliato per l&#39;isolamento delle cellule staminali del cancro usando il fenotipo della popolazione laterale innescato dal colorante.

Sfruttamento del fenotipo della popolazione laterale innescato dal DNA per rilevare e purificare le cellule staminali del cancro da campioni biologici

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Cell-libero DNA analisi di integrità nei campioni di urina

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Ricerca

Ricerca sul cancro

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Metodo semplice e veloce per ottenere alta qualità tumore del DNA da campioni clinico-patologiche utilizzando Touch Imprint citologia

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modellazione di Osteosarcoma con la sindrome di Li-Fraumeni paziente-derivato indotto Pluripotent Stem Cells

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Isolamento di cellule staminali mesenchimali da tessuto della polpa e co-coltura con cellule tumorali per studiare le loro interazioni

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Ottenere le sfere delle cellule staminali tumorali da tumori ginecologici e tumori del cancro

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analisi della popolazione laterale nelle linee cellulari tumorali solide

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Rilevamento di DNA privo di cellule in campioni di plasma sanguigno di pazienti oncologici

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolamento e valutazione funzionale di cellule staminali di cancro al seno umano da campioni di cellule e tessuti

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Screening della libreria di shRNA in pool per identificare i fattori che modulano un fenotipo di resistenza ai farmaci

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Simple and Fast Rolling Circle Amplification-Based Detection of Topoisomerase 1 Activity in Crude Biological Samples

Rilevazione semplice e veloce basata sull'amplificazione del cerchio di rotolamento dell'attività della topoisomerasi 1 in campioni biologici grezzi

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, ...