Name: harnessing the dna dye-triggered side population phenotype to detect and purify cancer stem cells from biological samples
Uploaded: 2017-05-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples at JoVE.com

Maximilian Boesch é apoiado por uma Erwin Schrödinger Fellowship do Austrian Science Fund FWF (concessão número J-3807).

Este protocolo está em total conformidade com as diretrizes padrão do Conselho Institucional de Revisão Ética. Se o tecido humano ou animal for investigado usando o protocolo descrito aqui, os pesquisadores são obrigados a ter aprovação do conselho de revisão relevante de sua instituição ou país. Cuidado: As precauções padrão para o manuseio seguro de amostras biológicas aplicam-se a este protocolo. Isso inclui usar luvas e um jaleco, e realizar o trabalho sob um gabinete de b...

<ol>
	<li>Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+the+cancer+stem+cells+-+what+challenges+do+they+pose?.">Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose?.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Cancer+Stem+Cells:+Rationale+for+Targeting+the+Stem+Cell+Niche.">Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche.</a> Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+cancer+relapse+and+metastasis+by+inhibiting+cancer+stemness.">Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).</li><li>Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., G&#246;tte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+in+cancer+stem+cell+analysis+and+separation.">Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation.</a> Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).</li><li>Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase:+its+role+as+a+cancer+stem+cell+marker+comes+down+to+the+specific+isoform.">Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform.</a> Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).</li><li>Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+appraisal+of+the+side+population+assay+in+stem+cell+and+cancer+stem+cell+research.">Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+&amp;#34;side+population&amp;#34;+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct &amp;#34;side population&amp;#34; of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+side+population+of+ovarian+cancer+cells+defines+a+heterogeneous+compartment+exhibiting+stem+cell+characteristics.">The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics.</a> Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).</li><li>Szotek, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+side+population+defines+cells+with+stem+cell-like+characteristics+and+Mullerian+Inhibiting+Substance+responsiveness.">Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).</li><li>Brown, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+benign+and+malignant+prostate+epithelial+Hoechst+33342+side+populations.">Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations.</a> Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).</li><li>Mathew, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCG2-mediated+DyeCycle+Violet+efflux+defined+side+population+in+benign+and+malignant+prostate.">ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate.</a> Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).</li><li>Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCF7+side+population+cells+with+characteristics+of+cancer+stem/progenitor+cells+express+the+tumor+antigen+MUC1.">MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1.</a> Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).</li><li>Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+human+lung+cancer+cell+lines+and+tumors+is+enriched+with+stem-like+cancer+cells.">Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells.</a> Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).</li><li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometrial+cancer+side-population+cells+show+prominent+migration+and+have+a+potential+to+differentiate+into+the+mesenchymal+cell+lineage.">Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage.</a> Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).</li><li>Bleau, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN/PI3K/Akt+pathway+regulates+the+side+population+phenotype+and+ABCG2+activity+in+glioma+tumor+stem-like+cells.">PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).</li><li>Harris, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+are+enriched+in+the+side+population+cells+in+a+mouse+model+of+glioma.">Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma.</a> Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).</li><li>Murase, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+cells+have+the+characteristics+of+cancer+stem-like+cells/cancer-initiating+cells+in+bone+sarcomas.">Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas.</a> Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).</li><li>Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Stem+Cell+Detection+Using+the+DyeCycle-Triggered+Side+Population+Phenotype.">Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype.</a> Stem Cells Int. 2016, 1652389 (2016).</li><li>Golebiewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+human+glioblastoma+is+non-tumorigenic+and+characterizes+brain+endothelial+cells.">Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells.</a> Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+transporter-mediated+protection+of+cancer+stem+cells+from+ionophore+antibiotics.">Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics.</a> Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).</li><li>Fukunaga-Kalabis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin-C+promotes+melanoma+progression+by+maintaining+the+ABCB5-positive+side+population.">Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population.</a> Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).</li><li>Dean, M., Fojo, T., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+stem+cells+and+drug+resistance.">Tumour stem cells and drug resistance.</a> Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+analysis+using+a+violet-excited+cell-permeable+DNA+binding+dye.">Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye.</a> Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+side+population+in+human+cancer+cell+lines.">High prevalence of side population in human cancer cell lines.</a> Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).</li><li>Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Primary+Human+Colon+Tumor+Cells+from+Surgical+Tissues+and+Culturing+Them+Directly+on+Soft+Elastic+Substrates+for+Traction+Cytometry.">Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry.</a> J Vis Exp. (100), e52532 (2015).</li><li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+human+glioblastoma+multiforme+tumor+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. (56), e3633 (2011).</li><li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry.">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> J Vis Exp. (83), e51088 (2014).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DyeCycle+Violet+used+for+side+population+detection+is+a+substrate+of+P-glycoprotein.">DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein.</a> Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).</li><li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+is+enriched+in+tumorigenic,+stem-like+cancer+cells,+whereas+ABCG2++and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic.">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li><li>Guha, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+promotes+apoptosis+resistance+of+breast+cancer+cells+and+enrichment+of+side+population+cells+with+cancer+stem+cell-like+properties+via+a+signaling+cascade+involving+galectin-3,+alpha9+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+STAT3.">Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3.</a> Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).</li></ol>

O progresso no manejo clínico do câncer também depende do desenvolvimento de modalidades de tratamento que visam as CSCs. Métodos que permitem o isolamento fiável de CSCs a partir de amostras biológicas irão acelerar a identificação de alvos adequados e são, portanto, de importância crítica neste esforço. SP é uma técnica estabelecida e valiosa para identificar populações de CSC que expressam transportadores de droga ABC e a implementação de DCV ampliou sua aplicabilidade a instrumentos de citometria ...

A eficácia das terapias primárias contra o cancro melhorou substancialmente durante a última década devido aos avanços convincentes na compreensão genética e molecular da doença e ao advento de fármacos direccionados tais como anticorpos terapêuticos e inibidores de moléculas pequenas. Em contraste, a doença metastática e recorrente ainda é tipicamente incurável, ea morbidade e mortalidade permanecem altas nestes cenários clínicos. As CSCs representam uma subpopulação distinta dentro dos tumores e são dotadas de propriedades de células estaminais canónicas tais como clonogenicidade / tumorigenicidade, resistência a múltiplos fármacos e divisão celular assimétrica 1 , 2 . Assim, as CSCs não apenas conduzem à progressão metastática e à heterogeneidade tumoral, mas também persistem durante o tratamento para predispor o paciente a recaída. Terapêutica CSC eliminação é, portanto, uma importante necessidade médica para prevenir a recorrência da doença e permitir a longo prazo cura do câncer 3 </suP&gt;. A identificação de vulnerabilidades e elucidação de estratégias para erradicar CSC depende fortemente de métodos que permitam a sua purificação a partir de amostras biológicas para posterior perfil de expressão e / ou investigação funcional. Por sua vez, tais métodos dependem de marcadores de superfície, intracelulares ou funcionais que são específicos para estas células. Os marcadores de superfície específicos para CSC incluem, mas não estão limitados a, CD44, CD133, CD24 e CD90 e foram utilizados para identificar populações de CSC numa variedade de entidades tumorais incluindo cancro da mama e cancro do cólon 4 . Outro marcador, a aldeído desidrogenase (ALDH), apresenta localização intracelular e pode ser detectado funcionalmente proporcionando um substrato respectivo cuja conversão enzimática produz luz. Utilizando este teste, as populações CSC foram também identificadas em diversas entidades tumorais 5 . Um método complementar, comumente referido como análise SP e retratado aqui em m<html> Detalhe etodológico, aproveita o efluxo de corante ativo por transportadores de droga ABC para identificar pequenas populações de células fluorescentes dim-stem-like 6 , 7 , 8 . Para conseguir isto, uma determinada amostra é incubada na presença de um fluoróforo de ligação ao ADN lipófilo que penetra em todas as células através de difusão passiva e alveja ADN nuclear e mitocondrial para ligação. Os não-CSCs desprovidos de expressão de transportador de droga ABC acumulam o corante resultando em fluorescência brilhante, ao passo que os CSCs extrudem activamente o corante que reduz a fluorescência. A inibiï¿½o farmacolï¿½ica da actividade do transportador de fï¿½maco anula e confirma funcionalmente o fenï¿½ipo de SP e deve ser utilizada para fins de controlo. As populações de CSC que exibem características de SP foram reveladas, entre outras, no cancro do ovário 9 , 10 , cancro da próstata 11 ,&gt; 12, cancro da mama 13 , cancro do pulmão 14 , cancro endometrial 15 , glioma 16 , 17 e sarcoma ósseo 18 . Importante, o ensaio de SP é compatível com ambas as linhas celulares de cancro e tecido de tumor primário, embora o material primário apresente desafios adicionais tais como a exigência de uma estratégia de discriminação de células tumorais específicas (certas populações de células hospedeiras também podem exibir características de SP) 19 , 20 . Os dois transportadores de fármaco que conferem SP mais estabelecidos são ABCB1 / P-glicoproteína / MDR1 / CD243 e ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; No entanto, outros transportadores de droga podem ser um determinante molecular do fenótipo SP também ( por exemplo , ABCB5) 22 . ABCB1Pode ser eficazmente bloqueada com verapamil enquanto que a actividade de ABCG2 pode ser especificamente revogada com fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 . Uma força particular da análise de SP é que ela pode ser combinada com outras colorações ( por exemplo , marcadores de superfície e ALDH) e que permite a recuperação de células vivas sendo assim compatível com investigações funcionais a jusante. Além disso, a detecção de SP é amplamente aplicável devido à alta conservação de transportadores de droga ABC entre as populações CSC 9 , 23 . Originalmente, a detecï¿½o SP foi realizada utilizando Hoechst 33342 como um corante desencadeante 24 . Este corante atinge uma resolução excelente, mas requer a excitação do laser ultravioleta; Daí a sua aplicabilidade é naturalmente limitada a instrumentos de citometria de fluxo high-end. O advento do DyeCycle Violet (DCV) 25 abriu nova avenidaEs para análise de SP e estendeu a aplicabilidade deste método aos instrumentos de citometria de fluxo padrão sem fonte de laser ultravioleta (uma fonte de laser violeta é suficiente para resolver as células DCV-SP). Importante, Hoechst 33342 e DCV compartilham especificidades de bomba comuns, indicando que qualquer corante deve identificar as mesmas populações de células. Aqui, fornecemos um protocolo experimental detalhado de análise de SP baseada em DCV para reprodução rápida e fácil em laboratórios independentes. Assim, percebemos nosso artigo como um recurso para os pesquisadores da CSC que deve contribuir para a otimização e padronização deste útil método biológico-celular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vybrant DyeCycle Violet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V35003</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td>Dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumitremorgin C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9054</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD (or propidium iodide)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420403</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Violet laser source required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes (round-bottom)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Tubes with cap recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cut-off strainers</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Optional but recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Only relevant for tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>01700</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harnessing the dna dye-triggered side population phenotype to detect and purify cancer stem cells from biological samples

O câncer é uma doença causada por células-tronco e a erradicação dessas células tornou-se um importante objetivo terapêutico. A decifração de vulnerabilidades de Células-Tronco de Câncer (CSCs) e a identificação de alvos moleculares adequados baseiam-se em métodos que permitem a sua discriminação específica em amostras heterogéneas, tais como linhas celulares e tecido tumoral ex vivo . Citometria de fluxo / FACS é uma tecnologia poderosa para multi-parametricamente dissecar amostras biológicas no nível de célula única e é até à data o método de escolha para recuperar células vivas para análises a jusante. Os marcadores de superfície tais como CD44 e CD133, bem como a detecção de actividade enzimática de aldeído desidrogenase, têm sido frequentemente utilizados para definir e separar CSCs de amostras de tumor por FACS. Uma abordagem complementar, aqui descrita em detalhe metodológico, utiliza a extrusão de corante funcional por transportadores de fármacos ABC, que identifica uma população distinta de células fluorescentes-dim vulgarmente designadas por população lateral (SP). SP, As células de cancro exibem características de células estaminais canónicas e podem ser anuladas e confirmadas funcionalmente utilizando agentes que inibem o transportador de fármaco de extrusão de corantes (mais frequentemente ABCB1 / P-glicoproteína / MDR1 / CD243 e ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Além disso, o ensaio SP é compatível com outras avaliações de citometria de fluxo, tais como coloração de antigénios de superfície, detecção de aldeído desidrogenase e discriminação de células mortas ( por exemplo , com 7-AAD ou iodeto de propídio (PI)). Assim, descrevemos um método valioso e amplamente aplicável para identificação, isolamento e sub-caracterização de CSC mecanisticamente baseado em um parâmetro funcional, e não fenotípico. Embora inicialmente realizado com Hoechst 33342 como corante desencadeante, aqui focalizamos o mais recente Violeta corante baseada em fenótipo SP que é resolvível em qualquer citómetro de fluxo equipado com uma fonte de laser violeta.

Ï¿½proporcionada uma anï¿½ise SP especï¿½ica de cï¿½ulas A2780, uma linha de cï¿½ulas de cancro do ovï¿½io humano anteriormente mostrada para abrigar um SP que representa menos de 1% de cï¿½ulas 9 . As células foram cultivadas a 37 ° C em RPMI 1640 suplementado com FBS a 10% ( v / v ), L-glutamina 2 mM e 1x penicilina / estreptomicina e colhidas a 85% de confluência utilizando tratamento com tripsina-EDTA a 0,05%. As cï¿½ulas fo...

Watch this Scientific Journal Video about Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples at JoVE.com

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Métodos que permitem a caracterização e isolamento de populações de células estaminais a partir de amostras biológicas são fundamentais para o avanço de células-tronco-alvo tratamentos em câncer e além. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para o isolamento de células estaminais do câncer usando o fenótipo de população lateral desencadeada por corante.

Aprovação do DNA Dye-desencadeada fenótipo de população lateral para detectar e purificar células-tronco de câncer de amostras biológicas

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Análise integridade do DNA de células-Free em amostras de urina

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Pesquisa do câncer

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Método simples e rápido para obter alta qualidade Tumor DNA de espécimes clínico-patológica usando toque citologia de impressão

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modelagem de osteossarcoma usando síndrome de Li-Fraumeni paciente-derivado induzido Pluripotent Stem Cells

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Isolamento de células-tronco mesenquimais de tecido pulpar e co-cultura com células cancerosas para estudar suas interações

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Obtenção de esferas de células-tronco cancerígenas de tumores ginecológicos e de câncer de mama

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Análise da população lateral em linhas celulares tumorais sólidas

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Detecção de DNA livre de células em amostras de plasma de sangue de pacientes com câncer

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolamento e Avaliação Funcional de Células-Tronco de Câncer de Mama Humano de Amostras de Células e Tecidos

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Triagem de biblioteca shRNA agrupada para identificar fatores que modulam um fenótipo de resistência a drogas

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Simple and Fast Rolling Circle Amplification-Based Detection of Topoisomerase 1 Activity in Crude Biological Samples

Detecção Simples e Rápida de Amplificação por Círculo de Rolamento da Atividade da Topoisomerase 1 em Amostras Biológicas Brutas

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, ...