Name: harnessing the dna dye-triggered side population phenotype to detect and purify cancer stem cells from biological samples
Uploaded: 2017-05-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples at JoVE.com

Maximilian Boesch cuenta con el apoyo de una Beca Erwin Schrödinger del Fondo Austríaco de Ciencia FWF (concesión número J-3807).

Este protocolo cumple con las directrices estándar de la Junta de Revisión Institucional de Ética. Si se investiga el tejido humano o animal usando el protocolo descrito aquí, los investigadores están obligados a obtener la aprobación de la junta de revisión de su institución o país. Precaución: Las precauciones estándar para el manejo seguro de muestras biológicas se aplican a este protocolo. Esto incluye usar guantes y una bata de laboratorio, y realizar el trabajo bajo un gabi...

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	<li>Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+the+cancer+stem+cells+-+what+challenges+do+they+pose?.">Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose?.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Cancer+Stem+Cells:+Rationale+for+Targeting+the+Stem+Cell+Niche.">Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche.</a> Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+cancer+relapse+and+metastasis+by+inhibiting+cancer+stemness.">Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).</li><li>Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+appraisal+of+the+side+population+assay+in+stem+cell+and+cancer+stem+cell+research.">Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+&amp;#34;side+population&amp;#34;+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct &amp;#34;side population&amp;#34; of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+side+population+of+ovarian+cancer+cells+defines+a+heterogeneous+compartment+exhibiting+stem+cell+characteristics.">The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics.</a> Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).</li><li>Szotek, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+side+population+defines+cells+with+stem+cell-like+characteristics+and+Mullerian+Inhibiting+Substance+responsiveness.">Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).</li><li>Brown, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+benign+and+malignant+prostate+epithelial+Hoechst+33342+side+populations.">Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations.</a> Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).</li><li>Mathew, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCG2-mediated+DyeCycle+Violet+efflux+defined+side+population+in+benign+and+malignant+prostate.">ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate.</a> Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).</li><li>Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCF7+side+population+cells+with+characteristics+of+cancer+stem/progenitor+cells+express+the+tumor+antigen+MUC1.">MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1.</a> Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).</li><li>Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+human+lung+cancer+cell+lines+and+tumors+is+enriched+with+stem-like+cancer+cells.">Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells.</a> Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).</li><li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometrial+cancer+side-population+cells+show+prominent+migration+and+have+a+potential+to+differentiate+into+the+mesenchymal+cell+lineage.">Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage.</a> Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).</li><li>Bleau, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN/PI3K/Akt+pathway+regulates+the+side+population+phenotype+and+ABCG2+activity+in+glioma+tumor+stem-like+cells.">PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).</li><li>Harris, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+are+enriched+in+the+side+population+cells+in+a+mouse+model+of+glioma.">Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma.</a> Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).</li><li>Murase, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+cells+have+the+characteristics+of+cancer+stem-like+cells/cancer-initiating+cells+in+bone+sarcomas.">Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas.</a> Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).</li><li>Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Stem+Cell+Detection+Using+the+DyeCycle-Triggered+Side+Population+Phenotype.">Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype.</a> Stem Cells Int. 2016, 1652389 (2016).</li><li>Golebiewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+human+glioblastoma+is+non-tumorigenic+and+characterizes+brain+endothelial+cells.">Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells.</a> Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+transporter-mediated+protection+of+cancer+stem+cells+from+ionophore+antibiotics.">Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics.</a> Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).</li><li>Fukunaga-Kalabis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin-C+promotes+melanoma+progression+by+maintaining+the+ABCB5-positive+side+population.">Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population.</a> Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).</li><li>Dean, M., Fojo, T., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+stem+cells+and+drug+resistance.">Tumour stem cells and drug resistance.</a> Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+analysis+using+a+violet-excited+cell-permeable+DNA+binding+dye.">Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye.</a> Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+side+population+in+human+cancer+cell+lines.">High prevalence of side population in human cancer cell lines.</a> Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).</li><li>Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Primary+Human+Colon+Tumor+Cells+from+Surgical+Tissues+and+Culturing+Them+Directly+on+Soft+Elastic+Substrates+for+Traction+Cytometry.">Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry.</a> J Vis Exp. (100), e52532 (2015).</li><li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+human+glioblastoma+multiforme+tumor+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. (56), e3633 (2011).</li><li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry.">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> J Vis Exp. (83), e51088 (2014).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DyeCycle+Violet+used+for+side+population+detection+is+a+substrate+of+P-glycoprotein.">DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein.</a> Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).</li><li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+is+enriched+in+tumorigenic,+stem-like+cancer+cells,+whereas+ABCG2++and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic.">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li><li>Guha, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+promotes+apoptosis+resistance+of+breast+cancer+cells+and+enrichment+of+side+population+cells+with+cancer+stem+cell-like+properties+via+a+signaling+cascade+involving+galectin-3,+alpha9+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+STAT3.">Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3.</a> Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).</li></ol>

El progreso en el manejo clínico del cáncer también depende del desarrollo de modalidades de tratamiento dirigidas a las CSC. Métodos que permiten el aislamiento fiable de CSC de muestras biológicas acelerará la identificación de objetivos adecuados y por lo tanto de importancia crítica en este esfuerzo. SP es una técnica establecida y valiosa para identificar las poblaciones de CSC que expresan los transportadores de fármacos ABC y la implementación del DCV ha extendido su aplicabilidad a los instrumentos es...

La eficacia de las terapias de cáncer primarias ha mejorado sustancialmente durante la última década debido a los avances en la comprensión genética y molecular de la enfermedad y el advenimiento de fármacos dirigidos como anticuerpos terapéuticos e inhibidores de moléculas pequeñas. En contraste, la enfermedad metastásica y recurrente sigue siendo típicamente incurable, y la morbilidad y la mortalidad siguen siendo altos en estos ajustes clínicos. Las CSCs representan una subpoblación distinta dentro de los tumores y están dotadas de propiedades de células madre canónicas tales como clonogenicidad / tumorigenicidad, resistencia a múltiples fármacos y división celular asimétrica 1 , 2 . Por lo tanto, CSCs no sólo impulsan la progresión metastásica y la heterogeneidad tumoral, sino que también persisten durante el tratamiento para predisponer al paciente a la recaída. Por lo tanto, la eliminación terapéutica del CSC es una necesidad médica importante para prevenir la recurrencia de la enfermedad y permitir la curación a largo plazo del cáncer 3 La identificación de las vulnerabilidades y la elucidación de las estrategias para erradicar las CSC depende en gran medida de métodos que permitan su purificación a partir de muestras biológicas para su posterior perfilación y / o investigación funcional. A su vez, tales métodos se basan en marcadores superficiales, intracelulares o funcionales que son específicos para estas células. Los marcadores de superficie específicos de CSC incluyen, pero no se limitan a, CD44, CD133, CD24 y CD90, y se han usado para identificar poblaciones de CSC en una variedad de entidades tumorales incluyendo cáncer de mama y cáncer de colon 4 . Otro marcador, aldehido deshidrogenasa (ALDH), muestra localización intracelular y puede ser detectado funcionalmente proporcionando un sustrato respectivo cuya conversión enzimática produce luz. Usando esta prueba, las poblaciones CSC se han identificado en diversas entidades tumorales, así 5 . Un método complementario, comúnmente denominado análisis SP y retratado aquí en m<html> Ethodological, aprovecha el eflujo de colorante activo por los transportadores de fármacos ABC para identificar pequeñas poblaciones de células de tallo fluorescente-dim-like 6 , 7 , 8 . Para conseguir esto, se incuba una muestra dada en presencia de un fluoróforo de unión al ADN lipófilo que entra en todas las células a través de la difusión pasiva y se dirige al ADN nuclear y mitocondrial para la unión. Los no CSCs que carecen de expresión del transportador de fármacos ABC acumulan el colorante dando como resultado una fluorescencia brillante, mientras que CSCs extruyen activamente el colorante que reduce la fluorescencia. La inhibición farmacológica de la actividad transportadora de fármacos abroga y confirma funcionalmente el fenotipo SP y debe usarse para fines de control. Las poblaciones de CSC que presentan características de SP se han descrito, entre otros, en cáncer de ovario 9 , 10 , cáncer de próstata 11 ,&gt; 12, cáncer de mama 13 , cáncer de pulmón 14 , cáncer endometrial 15 , glioma 16 , 17 y sarcoma óseo 18 . Es importante destacar que el ensayo SP es compatible con ambas líneas celulares de cáncer y tejido tumoral primario, aunque el material primario plantea retos adicionales tales como el requisito de una estrategia específica de discriminación de células tumorales (ciertas poblaciones de células huésped también pueden presentar características de SP) 19 , 20 . Los dos transportadores de fármacos que confieren SP más establecidos son ABCB1 / P-glicoproteína / MDR1 / CD243 y ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Sin embargo, otros transportadores de drogas puede ser un determinante molecular del fenotipo SP también ( por ejemplo , ABCB5) [ 22] . ABCB1Puede bloquearse eficazmente con verapamilo, mientras que la actividad de ABCG2 puede ser derogada específicamente con fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 . Una fuerza particular del análisis de SP es que puede combinarse con otras tinciones ( por ejemplo , marcadores de superficie y ALDH) y que permite la recuperación de células vivas siendo así compatible con investigaciones funcionales posteriores. Por otra parte, la detección de SP es ampliamente aplicable debido a la alta conservación de los transportadores de drogas ABC entre las poblaciones de CSC [ 9 , 23] . Originalmente, la detección de SP se ha realizado utilizando Hoechst 33342 como un colorante desencadenante 24 . Este colorante consigue una excelente resolución pero requiere excitación con láser ultravioleta; Por lo tanto su aplicabilidad se limita naturalmente a los instrumentos de citometría de flujo de gama alta. La llegada de DyeCycle Violet (DCV) 25 ha abierto nuevas avenidasEs para el análisis SP y amplió la aplicabilidad de este método a los instrumentos de citometría de flujo estándar que carecen de una fuente láser ultravioleta (una fuente láser violeta es suficiente para resolver las células DCV-SP). Es importante destacar que Hoechst 33342 y DCV comparten especificidades comunes de la bomba, lo que indica que cualquier colorante debe identificar las mismas poblaciones de células. Aquí, proporcionamos un protocolo experimental detallado del análisis de SP basado en DCV para una reproducción rápida y fácil en laboratorios independientes. Por lo tanto, percibimos nuestro artículo como un recurso para los investigadores de CSC que debería contribuir a la optimización y estandarización de este útil método biológico-celular.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vybrant DyeCycle Violet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V35003</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td>Dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumitremorgin C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9054</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD (or propidium iodide)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420403</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Violet laser source required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes (round-bottom)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Tubes with cap recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cut-off strainers</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Optional but recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Only relevant for tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>01700</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harnessing the dna dye-triggered side population phenotype to detect and purify cancer stem cells from biological samples

El cáncer es una enfermedad conducida por células madre y la erradicación de estas células se ha convertido en un objetivo terapéutico importante. La desciframización de las vulnerabilidades de las células madre de cáncer (CSC) y la identificación de objetivos moleculares adecuados se basa en métodos que permiten su discriminación específica en muestras heterogéneas tales como líneas celulares y tejido tumoral ex vivo . La citometría de flujo / FACS es una poderosa tecnología para diseccionar de forma multiparamétrica muestras biológicas a nivel de célula única y es hasta la fecha el método de elección para recuperar células vivas para análisis de aguas abajo. Los marcadores de superficie tales como CD44 y CD133, así como la detección de actividad enzimática de aldehído deshidrogenasa, se han utilizado a menudo para definir y clasificar CSCs de muestras tumorales mediante FACS. Un enfoque complementario, descrito aquí en detalle metodológico, hace uso de la extrusión de colorante funcional por transportadores de fármacos ABC, que identifica una población distinta de células fluorescentes-dim comúnmente denominadas población lateral (SP). SP, Las células cancerosas exhiben características de células madre canónicas y pueden ser anuladas y confirmadas funcionalmente utilizando agentes que inhiben el transportador de fármacos extruyendo el colorante (más frecuentemente ABCB1 / P-glicoproteína / MDR1 / CD243 y ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Además, el ensayo de SP es compatible con otras evaluaciones de citometría de flujo tales como tinción de antígenos de superficie, detección de aldehído deshidrogenasa y discriminación de células muertas ( por ejemplo , con 7-AAD o yoduro de propidio (PI)). Por lo tanto, describimos un valioso y ampliamente aplicable método de CSC de identificación, aislamiento y sub-caracterización mecánica basada en un funcional, en lugar de un parámetro fenotípico. Aunque originalmente se realizó con Hoechst 33342 como colorante desencadenante, aquí nos centramos en el fenotipo más reciente basado en colorante Violeta SP que se puede resolver en cualquier citómetro de flujo equipado con una fuente de láser violeta.

Se proporciona un análisis SP representativo de células A2780, una línea celular de cáncer de ovario humano previamente mostrada para albergar un SP que representa menos del 1% de células 9 . Las células se cultivaron a 37ºC en RPMI 1640 suplementado con FBS al 10% ( v / v ), L-glutamina 2 mM y 1 x penicilina / estreptomicina y se cosecharon al 85% de confluencia usando tratamiento con tripsina-EDTA al 0,05%. Las células se lavaron en PBS y se fil...

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Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Métodos que permiten la caracterización y el aislamiento de las poblaciones de células madre de muestras biológicas son fundamentales para el avance de los tratamientos dirigidos a células madre en el cáncer y más allá. Aquí, proporcionamos un protocolo detallado para el aislamiento de células madre de cáncer utilizando el fenotipo de población lateral desencadenada por tinte.

Aprovechamiento del fenotipo de población lateral desencadenado por tinte de ADN para detectar y purificar células madre de cáncer a partir de muestras biológicas

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Libre de células análisis de la integridad del ADN en muestras de orina

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Método simple y rápido para obtener alta calidad Tumor ADN de especímenes clínicos patológicos mediante citología de impresión táctil

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modelado de Osteosarcoma usando las células de vástago de Pluripotent inducido derivados del paciente el síndrome de Li-Fraumeni

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Aislamiento de células madre mesenquimales del tejido de la pulpa y cocultivo con células de cáncer para estudiar sus interacciones

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Obtención de esferas de células madre de cáncer de cáncer de tumores ginecológicos y de cáncer de mama

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Análisis De La Población Lateral En Líneas Celulares De Tumores Sólidos

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Detección de ADN libre de células en muestras de plasma sanguíneo de pacientes con cáncer

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Aislamiento y evaluación funcional de células madre de cáncer de mama humano a partir de muestras de células y tejidos

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Cribado agrupado de la biblioteca de shRNA para identificar los factores que modulan un fenotipo de resistencia a los medicamentos

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Simple and Fast Rolling Circle Amplification-Based Detection of Topoisomerase 1 Activity in Crude Biological Samples

Detección simple y rápida basada en la amplificación del círculo rodante de la actividad de la topoisomerasa 1 en muestras biológicas crudas

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, ...