Name: harnessing the dna dye-triggered side population phenotype to detect and purify cancer stem cells from biological samples
Uploaded: 2017-05-10T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples at JoVE.com

Maximilian Boesch stöds av ett Erwin Schrödinger-stipendium från den österrikiska vetenskapsfonden FWF (bidragsnummer J-3807).

Detta protokoll är i full överensstämmelse med standardinstitutionella etiska granskningsrådets riktlinjer. Om mänsklig eller animalisk vävnad undersöks med det protokoll som beskrivs här, är forskare skyldiga att ha godkännande från den berörda granskningskommittén i deras institution eller land. Varning: Standardföreskrifter för säker hantering av biologiska prover gäller för detta protokoll. Detta inkluderar bärande handskar och lab coat, och utför arbetet under ett bi...

<ol>
	<li>Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tackling+the+cancer+stem+cells+-+what+challenges+do+they+pose?.">Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose?.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterogeneity+of+Cancer+Stem+Cells:+Rationale+for+Targeting+the+Stem+Cell+Niche.">Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche.</a> Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).</li><li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+cancer+relapse+and+metastasis+by+inhibiting+cancer+stemness.">Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).</li><li>Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., G&#246;tte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometry+in+cancer+stem+cell+analysis+and+separation.">Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation.</a> Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).</li><li>Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase:+its+role+as+a+cancer+stem+cell+marker+comes+down+to+the+specific+isoform.">Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform.</a> Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).</li><li>Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Critical+appraisal+of+the+side+population+assay+in+stem+cell+and+cancer+stem+cell+research.">Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).</li><li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+distinct+&amp;#34;side+population&amp;#34;+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells.">A distinct &amp;#34;side population&amp;#34; of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li><li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ABC+transporter+Bcrp1/ABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype.">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+side+population+of+ovarian+cancer+cells+defines+a+heterogeneous+compartment+exhibiting+stem+cell+characteristics.">The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics.</a> Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).</li><li>Szotek, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+side+population+defines+cells+with+stem+cell-like+characteristics+and+Mullerian+Inhibiting+Substance+responsiveness.">Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).</li><li>Brown, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+benign+and+malignant+prostate+epithelial+Hoechst+33342+side+populations.">Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations.</a> Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).</li><li>Mathew, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ABCG2-mediated+DyeCycle+Violet+efflux+defined+side+population+in+benign+and+malignant+prostate.">ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate.</a> Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).</li><li>Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MCF7+side+population+cells+with+characteristics+of+cancer+stem/progenitor+cells+express+the+tumor+antigen+MUC1.">MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1.</a> Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).</li><li>Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+human+lung+cancer+cell+lines+and+tumors+is+enriched+with+stem-like+cancer+cells.">Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells.</a> Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).</li><li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endometrial+cancer+side-population+cells+show+prominent+migration+and+have+a+potential+to+differentiate+into+the+mesenchymal+cell+lineage.">Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage.</a> Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).</li><li>Bleau, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PTEN/PI3K/Akt+pathway+regulates+the+side+population+phenotype+and+ABCG2+activity+in+glioma+tumor+stem-like+cells.">PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).</li><li>Harris, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells+are+enriched+in+the+side+population+cells+in+a+mouse+model+of+glioma.">Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma.</a> Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).</li><li>Murase, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+cells+have+the+characteristics+of+cancer+stem-like+cells/cancer-initiating+cells+in+bone+sarcomas.">Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas.</a> Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).</li><li>Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+Stem+Cell+Detection+Using+the+DyeCycle-Triggered+Side+Population+Phenotype.">Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype.</a> Stem Cells Int. 2016, 1652389 (2016).</li><li>Golebiewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+in+human+glioblastoma+is+non-tumorigenic+and+characterizes+brain+endothelial+cells.">Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells.</a> Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drug+transporter-mediated+protection+of+cancer+stem+cells+from+ionophore+antibiotics.">Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics.</a> Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).</li><li>Fukunaga-Kalabis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tenascin-C+promotes+melanoma+progression+by+maintaining+the+ABCB5-positive+side+population.">Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population.</a> Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).</li><li>Dean, M., Fojo, T., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+stem+cells+and+drug+resistance.">Tumour stem cells and drug resistance.</a> Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).</li><li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo.">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li><li>Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+analysis+using+a+violet-excited+cell-permeable+DNA+binding+dye.">Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye.</a> Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+prevalence+of+side+population+in+human+cancer+cell+lines.">High prevalence of side population in human cancer cell lines.</a> Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).</li><li>Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Primary+Human+Colon+Tumor+Cells+from+Surgical+Tissues+and+Culturing+Them+Directly+on+Soft+Elastic+Substrates+for+Traction+Cytometry.">Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry.</a> J Vis Exp. (100), e52532 (2015).</li><li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+expansion+of+human+glioblastoma+multiforme+tumor+cells+using+the+neurosphere+assay.">Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. (56), e3633 (2011).</li><li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry.">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> J Vis Exp. (83), e51088 (2014).</li><li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DyeCycle+Violet+used+for+side+population+detection+is+a+substrate+of+P-glycoprotein.">DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein.</a> Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).</li><li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Side+population+is+enriched+in+tumorigenic,+stem-like+cancer+cells,+whereas+ABCG2++and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic.">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li><li>Guha, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nicotine+promotes+apoptosis+resistance+of+breast+cancer+cells+and+enrichment+of+side+population+cells+with+cancer+stem+cell-like+properties+via+a+signaling+cascade+involving+galectin-3,+alpha9+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+STAT3.">Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3.</a> Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).</li></ol>

Framsteg i klinisk hantering av cancer beror också på utvecklingen av behandlingsmodaliteter som riktar sig mot CSC. Metoder som möjliggör tillförlitlig isolering av CSC från biologiska prover kommer att påskynda identifieringen av lämpliga mål och är därför av avgörande betydelse i detta försök. SP-analys är en etablerad och värdefull teknik för att identifiera CSC-populationer som uttrycker ABC-läkemedelstransportörer och implementeringen av DCV har utökat användbarheten till standardflödescytom...

Effekten av primära cancerterapier har förbättrats väsentligt under det senaste decenniet på grund av tvingande framsteg i den genetiska och molekylära förståelsen av sjukdomen och tillkomsten av riktade läkemedel, såsom terapeutiska antikroppar och småmolekylhämmare. Däremot är metastatisk och återkommande sjukdom fortfarande vanligen oåterkalllig, och sjukligheten och dödligheten förblir höga i dessa kliniska inställningar. CSC: er representerar en distinkt subpopulation inom tumörer och är utrustade med kanoniska stamcellsegenskaper, såsom klonogenicitet / tumorigenicitet, resistens mot flera läkemedel och asymmetrisk celldelning 1 , 2 . Sålunda driver CSC inte bara metastatisk progression och tumör heterogenitet, men fortsätter även under behandling för att predisponera patienten att återfalla. Terapeutisk CSC-eliminering är därför ett viktigt medicinskt behov för att förhindra återkommande sjukdom och tillåta långvarig behandling av cancer 3 </sup&gt;. Identifiering av sårbarheter och belysande av strategier för att utplåna CSC: er kraftigt beror på metoder som tillåter deras rening från biologiska prover för efterföljande expressionsprofilering och / eller funktionell undersökning. I sin tur är sådana metoder beroende av yt-, intracellulära eller funktionella markörer som är specifika för dessa celler. CSC-specifika ytmarkörer inkluderar, men är inte begränsade till, CD44, CD133, CD24 och CD90 och har använts för att identifiera CSC-populationer i en mängd olika tumörenheter inklusive bröstcancer och koloncancer 4 . En annan markör, aldehyddehydrogenas (ALDH), visar intracellulär lokalisering och kan detekteras funktionellt, vilket ger ett respektive substrat, vars enzymatiska omvandling ger ljus. Med hjälp av detta test har CSC-populationer också identifierats i olika tumörenheter 5 . En komplementär metod som vanligen kallas SP-analys och porträttad här i m<html> Etodologisk detalj, utnyttjar aktiv färgämneutflöde av ABC-läkemedelstransportörer för att identifiera små populationer av fluorescensdimma stamliknande celler 6 , 7 , 8 . För att uppnå detta inkuberas ett givet prov i närvaro av en lipofil DNA-bindande fluorofor som går in i alla celler genom passiv diffusion och inriktar kärn- och mitokondriellt DNA för bindning. Icke-CSCs som saknar ABC-läkemedelstransportörsuttryck ackumulerar färgämnet som resulterar i stark fluorescens, medan CSC: er aktivt extruderar färgämnet som reducerar fluorescens. Farmakologisk inhibering av läkemedelstransportaktivitet upphäver och funktionellt bekräftar SP-fenotypen och bör användas för kontrolländamål. CSC-populationer som uppvisar SP-egenskaper har blivit beskrivna bland annat i äggstockscancer 9 , 10 , prostatacancer 11 ,&gt; 12, bröstcancer 13 , lungcancer 14 , endometriecancer 15 , gliom 16 , 17 och bensarkom 18 . Viktigt är att SP-analysen är kompatibel med både cancercellinjer och primärtumörvävnad, även om primärmaterialet utgör ytterligare utmaningar, såsom kravet på en specifik strategi för tumörcellsdiskriminering (vissa värdcellspopulationer kan också uppvisa SP-egenskaper) 19 , 20 . De två mest etablerade SP-givande läkemedelstransportörerna är ABCB1 / P-glykoprotein / MDRl / CD243 och ABCG2 / Bcrp1 / CD338 8 , 9 , 21 ; Andra läkemedelstransportörer kan emellertid också vara en molekylär determinant av SP-fenotypen ( t.ex. ABCB5) 22 . ABCB1Kan effektivt blockeras med verapamil medan aktiviteten hos ABCG2 kan upphävas specifikt med fumitremorgin C (FTC) 6 , 19 . En särskild styrka för SP-analys är att den kan kombineras med andra färgämnen ( t.ex. ytmarkörer och ALDH) och att det möjliggör återställning av levande celler, vilket är förenligt med nedströms funktionella undersökningar. Dessutom är SP-detektering i stor utsträckning tillämplig på grund av den höga bevarande av ABC-läkemedelstransportörer bland CSC-populationer 9 , 23 . Ursprungligen har SP-detektering utförts med användning av Hoechst 33342 som en utlösande färgämne 24 . Detta färgämne uppnår utmärkt upplösning men kräver ultraviolett laser excitation; Därför är dess tillämplighet naturligt begränsad till avancerade flödescytometriska instrument. Ankomsten av DyeCycle Violet (DCV) 25 har öppnat ny avenuEs för SP-analys och utvidgade tillämpligheten av denna metod till standardflödescytometriska instrument som saknar en ultraviolett laserkälla (en violett laserkälla är tillräcklig för att lösa DCV-SP-celler). Viktigt är att Hoechst 33342 och DCV delar gemensamma pumpspecifikationer, vilket indikerar att antingen färgämnen ska identifiera samma cellpopulationer. Här tillhandahåller vi ett detaljerat försöksprotokoll med DCV-baserad SP-analys för snabb och enkel reproduktion i oberoende laboratorier. Vi uppfattar sålunda vår artikel som en resurs för CSC-forskare som borde bidra till optimering och standardisering av denna användbara cellbiologiska metod.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Vybrant DyeCycle Violet</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>V35003</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Verapamil hydrochloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>V4629</td>
			<td>Dissolve in ethanol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fumitremorgin C</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F9054</td>
			<td>Dissolve in DMSO</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>7-AAD (or propidium iodide)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>420403</td>
			<td>Ready to use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Standard cell culture reagents (e.g., medium, FBS, L-glutamine, antibiotics, PBS, trypsin-EDTA, etc.)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample/cells of interest (e.g., human or murine cancer cell line, human or murine tumor tissue)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flow cytometric instrument (analyzer or cell sorter)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Violet laser source required</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tubes (round-bottom)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Tubes with cap recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>70 &#181;m cut-off strainers</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Optional but recommended</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Digestion enzyme mix (e.g., collagenase/dispase/Dnase)</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Only relevant for tissue dissociation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Flurochrome-conjugated antibodies against surface markers of interest</td>
			<td>Different suppliers</td>
			<td></td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ALDEFLUOR Kit</td>
			<td>STEMCELL Technologies</td>
			<td>01700</td>
			<td>Optional</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

harnessing the dna dye-triggered side population phenotype to detect and purify cancer stem cells from biological samples

Cancer är en stamcellsdriven sjukdom och utrotning av dessa celler har blivit ett viktigt terapeutiskt mål. Dekryptera sårbarheter hos cancerstamceller (CSC) och identifiera lämpliga molekylära mål är beroende av metoder som tillåter deras specifika diskriminering i heterogena prover såsom cellinjer och ex vivo tumörvävnad. Flödescytometri / FACS är en kraftfull teknik för att multi-parametriskt dissekera biologiska prover på encellsnivå och är hittills den metod som valts för att återställa levande celler för nedströmsanalyser. Ytmarkörer såsom CD44 och CD133 samt detektion av aldehyddehydrogenasens enzymatisk aktivitet har ofta använts för att definiera och sortera ut CSC från tumörprover av FACS. Ett komplementärt tillvägagångssätt, som beskrivs här i metodologisk detalj, utnyttjar funktionell färgämnekrossning av ABC-läkemedelstransportörer, som identifierar en distinkt population av fluorescensdimma celler som vanligtvis kallas sidopopulation (SP). SPCancerceller uppvisar kanoniska stamcellskarakteristika och kan upphävas och funktionellt bekräftas med användning av medel som hämmar färgämnextruderande läkemedelstransportören (oftast ABCB1 / P-glykoprotein / MDRl / CD243 och ABCG2 / Bcrp1 / CD338). Vidare är SP-analysen kompatibel med andra flödescytometriska utvärderingar såsom färgning av ytantigener, aldehyddehydrogenasdetektering och dödcellsdiskriminering ( t.ex. med 7-AAD eller propidiumjodid (PI)). Således beskriver vi en värdefull och allmänt tillämplig metod för CSC-identifiering, isolering och delkarakterisering mekaniskt baserat på en funktionell, snarare än en fenotypisk parameter. Även om det ursprungligen utfördes med Hoechst 33342 som utlösande färgämne fokuserar vi här på den senaste Violet-färgbaserade SP-fenotypen som är lösbar på vilken flödescytometer som är utrustad med en violett laserkälla.

Tillhandahålles en representativ SP-analys av A2780-celler, en human ovariecancercellslinje som tidigare visat sig ha en SP-redovisning för mindre än 1% av cellerna 9 . Celler odlades vid 37 ° C i RPMI 1640 kompletterad med 10% ( volym / volym ) FBS, 2 mM L-glutamin och 1x penicillin / streptomycin och skördades vid 85% konfluens med användning av behandling med 0,05% trypsin-EDTA. Cellerna tvättades i PBS och filtrerades genom 70 | im avskurna sim...

Watch this Scientific Journal Video about Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples at JoVE.com

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Metoder som möjliggör karakterisering och isolering av stamcellspopulationer från biologiska prover är avgörande för förskott av stamceller-riktade behandlingar i cancer och bortom. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för isolering av cancerstamcellceller med användning av färgämneutlösad sidopopulation fenotyp.

Användning av DNA-färgutlösad sidob populationsfenotyp för att detektera och rena cancer stamceller från biologiska prov

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Cell-Free DNA Integrity Analysis in Urine Samples

Cellfritt DNA Integrity analys i urinprov

Although the presence of circulating cell-free DNA in plasma or serum has been widely shown to be a suitable source of biomarkers for many types of ...

Simple and Rapid Method to Obtain High-quality Tumor DNA from Clinical-pathological Specimens Using Touch Imprint Cytology

Enkel och snabb metod att få hög kvalitet tumör DNA från klinisk-patologiska exemplar med Touch avtryck cytologi

It is critical to determine the mutational status in cancer before administration and treatment of specific molecular targeted drugs for cancer patients. ...

Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Modeling osteosarkom med Li-Fraumeni syndrom patientderiverade inducerade pluripotenta stamceller

Li-Fraumeni syndrome (LFS) is an autosomal dominant hereditary cancer disorder. Patients with LFS are predisposed to a various type of tumors, including ...

Mesenchymal Stem Cell Isolation from Pulp Tissue and Co-Culture with Cancer Cells to Study Their Interactions

Mesenkymala stamceller isolering från massa vävnad och samtidig kultur med cancerceller för att studera deras interaktioner

Cancer as a multistep process and complicated disease is not only regulated by individual cell proliferation and growth but also controlled by tumor ...

Obtaining Cancer Stem Cell Spheres from Gynecological and Breast Cancer Tumors

Erhålla Cancer Stem Cell Spheres från gynekologiska och bröstcancertumörer

Cancer stem cells (CSC) are a small population with self-renewal and plasticity which are responsible for tumorigenesis, resistance to treatment and ...

Analysis of Side Population in Solid Tumor Cell Lines

Analys av sidopopulation i solida tumör cellinjer

Cancer stem cells (CSCs) are an important cause of tumor growth, metastasis, and recurrence. Isolation and identification of CSCs are of great ...

Detection of Cell-Free DNA in Blood Plasma Samples of Cancer Patients

Påvisande av cellfritt DNA i blodplasmaprover från cancerpatienter

Identifying mutations in tumors of cancer patients is a very important step in disease management. These mutations serve as biomarkers for tumor diagnosis ...

Isolation and Functional Assessment of Human Breast Cancer Stem Cells from Cell and Tissue Samples

Isolering och funktionell bedömning av mänskliga bröstcancerstamceller från cell- och vävnadsprover

Breast cancer stem cells (BCSCs) are cancer cells with inherited or acquired stem cell-like characteristics. Despite their low frequency, they are major ...

Pooled shRNA Library Screening to Identify Factors that Modulate a Drug Resistance Phenotype

Poolad shRNA-biblioteksscreening för att identifiera faktorer som modulerar en läkemedelsresistensfenotyp

Understanding clinically relevant driver mechanisms of acquired chemo-resistance is crucial for elucidating ways to circumvent resistance and improve ...

Simple and Fast Rolling Circle Amplification-Based Detection of Topoisomerase 1 Activity in Crude Biological Samples

Enkel och snabb rullande cirkelförstärkningsbaserad detektion av topoisomeras 1-aktivitet i råbiologiska prover

Isothermal amplification-based techniques such as the rolling circle amplification have been successfully employed for the detection of nucleic acids, ...