Name: assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry
Uploaded: 2017-07-21T13:00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

أود أن أشكر زملاء العمل في ميليبوريسيغما، فيليب J. موريسي و شيري L. صديق، على دعمهم وتوجيههم على مر السنين. وأود أيضا أن أشكر فيديا فينكاتاشلام وبريان R. دافيدسون لمساعدتهم مع ميزة BDC3 في برنامج إيدياس ، ريان P. جيسوب للمساعدة في تحرير هذه المخطوطة، ريموند كونغ للمساعدة في يوم اطلاق النار، وشكرا خاصا لك لفنان ماكياج سينثيا زامونتين.

<ol>
	<li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+should+autophagic+flux+be+assessed?.">Why should autophagic flux be assessed?.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).</li><li>Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+Autophagy.">LC3 and Autophagy.</a> Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).</li><li>Larsen, K. B., Lamark, T., &#216;vervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bj&#248;rk&#248;y, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reporter+cell+system+to+monitor+autophagy+based+on+p62/SQSTM1.">A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1.</a> Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).</li><li>Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+flow+cytometry+for+measurement+of+autophagy.">Applications of flow cytometry for measurement of autophagy.</a> Methods. 75, 87-95 (2015).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+mammalian+autophagy+research.">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).</li><li>Arsov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC-mediated+transgenic+expression+of+fluorescent+autophagic+protein+Beclin+1+reveals+a+role+for+Beclin+1+in+lymphocyte+development.">BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development.</a> Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).</li><li>Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+death+pathways+in+desmin-related+cardiomyopathy.">Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy.</a> Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).</li><li>Altman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+essential+to+suppress+cell+stress+and+to+allow+BCR-Abl-mediated+leukemogenesis.">Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis.</a> Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).</li><li>Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammaherpesvirus+68+infection+of+endothelial+cells+requires+both+host+autophagy+genes+and+viral+oncogenes+for+optimal+survival+and+persistence.">Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence.</a> J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).</li><li>Tra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+human+embryonic+stem+cells.">Autophagy in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li><li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1+targets+both+autophagy+and+apoptosis+pathways+in+pediatric+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).</li><li>Leveque-El Mouttie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+required+for+stem+cell+mobilization+by+G-CSF.">Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF.</a> Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).</li><li>Watson, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+limits+proliferation+and+glycolytic+metabolism+in+acute+myeloid+leukemia.">Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia.</a> Cell Death Discov. 1, 15008 (2015).</li><li>Stranks, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+Controls+Acquisition+of+Aging+Features+in+Macrophages.">Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages.</a> J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).</li><li>Clarke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+activated+in+systemic+lupus+erythematosus+and+required+for+plasmablast+development.">Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development.</a> Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).</li><li>Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+assays+for+the+study+of+autophagy.">Flow cytometric assays for the study of autophagy.</a> Methods. 82, 21-28 (2015).</li><li>Bj&#248;rk&#248;y, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62/SQSTM1+forms+protein+aggregates+degraded+by+autophagy+and+has+a+protective+effect+on+huntingtin-induced+cell+death.">p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death.</a> J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).</li><li>Phadwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+autophagy+detection+in+primary+cells:+Impaired+levels+of+macroautophagy+in+immunosenescent+T+cells.">A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells.</a> Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).</li><li>Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+autophagosomes+and+autolysosomes+in+cells+using+imaging+flow+cytometry.">Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).</li><li>Kwok, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HspB8+mutation+causing+hereditary+distal+motor+neuropathy+impairs+lysosomal+delivery+of+autophagosomes.">HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes.</a> J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).</li><li>Lopez-Herrera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleterious+Mutations+in+LRBA+Are+Associated+with+a+Syndrome+of+Immune+Deficiency+and+Autoimmunity.">Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity.</a> Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).</li><li>Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATF4+orchestrates+a+program+of+BH3-only+protein+expression+in+severe+hypoxia.">ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia.</a> Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).</li><li>Pike, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+up-regulation+of+ULK1+by+ATF4+contributes+to+cancer+cell+survival.">Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival.</a> Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).</li><li>Pugsley, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+autophagy:+Measuring+LC3+puncta+and+autolysosome+formation+in+cells+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry.</a> Methods. 112, 147-156 (2017).</li><li>IDEAS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2. , (2015).</li></ol>

أنا مستخدم من قبل ميليبوريسيغما، صانع العلامة التجارية أيمنيس إيماجستريم، والذي تم استخدامه في هذه الدراسة.

عند تنفيذ هذا التحليل، هناك عدد قليل من الأشياء التي يجب مراعاتها. من المهم أن يكون لديك عينات التحكم المناسبة. لهذه التجربة، تم استخدام اثنين من الضوابط المختلفة: السيطرة والسيطرة + الكلوروكين. واستخدمت عينة التحكم لتحديد عتبة المناطق. وهو يمثل المستوى القاعدي من البلعمة الذاتية دون وقف تدهور الليزوزومية وهو السيطرة على عينة ستارفيد. ومع ذلك، فإن عينة التحكم ليست السيطرة المناسبة للمقارنة مع النتائج من ستارفيد + الكلوروكين عينة لأن الكلوروكين نفسه يؤثر على عينة السيطرة. لذلك، كان من الضروري أن يكون لديك عنصر تحكم + الكلوروكين. قبل إجراء أي تحليل للبلعمة الذاتية، من المهم فقط تحليل / بوابة على الخلايا الفردية التي هي في التركيز ( أي رمز التدرج أكثر من 60)، حيث يمكن أن تتأثر النتائج إذا كان هناك أكثر من خلية واحدة أو الصور هي خارج تركيزي. ومن الأهمية بمكان أن الأوتوفاغوسومإس و ليسوسوميس في التركيز على عد السليم الصحيح وتحليل BDC3. يجب إزالة الخلايا الأبوطوزية قبل تحليل البلعمة الذاتية، لأنها قد تحرف النتائج ويجب عدم تضمينها. يجب أن يكون هناك تلطيخ المناسب لجميع علامات الثلاثة ( أي LC3، p62، و LAMP1). على سبيل المثال، جميع العلامات الثلاثة هي داخل الخلايا وينبغي أن يكون إشارة منقط. إذا كانت الإشارة لا منقط، أو إذا كان على سطح الخلية، فإن تلطيخ لا يكون مناسبا، وينبغي أن تجدد التجربة / تلطيخ. وبالإضافة إلى ذلك، ل BDC3 لتكون دقيقة، فمن الضروري أن بوابة على الخلايا التي هي مشرقة لجميع علامات الفلورسنت الثلاثة من الفائدة. مطلوب الانطلاق على الأحداث الإيجابية لمنع قياس BDC3 على غير محددة ملزمة، والتحف التصوير، و / أو الضوضاء. هذا أمر بالغ الأهمية، كما يمكن BDC3 تضخيم التحف التي ليست إشارات حقيقية. منذ BDC3 لا يمكن أن يؤديها إلا على أحداث إيجابية مشرقة، قد لا يتم تضمين العديد من الخلايا في التحليل النهائي. هذا هو إسبكإيلي صحيح لخلايا السيطرة التي ليس لديها أي تراكم LC3، p62، و / أو LAMP1. وبالتالي، فإن الحد من هذا الفحص هو أن BDC3 يدرس فقط الخلايا التي هي إيجابية لجميع العلامات الثلاثة، والتي قد لا تكون مناسبة لجميع التجارب التلقائية. مثل بدس، والتي تم الإبلاغ عنها سابقا 15 ، 16 ، 17 ، 20 ، 21 ، 22 ، 23 ، 24 ، 25 ، 26 ، BDC3 وحدها لا تأخذ في الاعتبار عدد عضيات البلعمة الذاتية التي تشارك في توطين، مما أدى إلى درجة كبيرة من التباين في عدد الأوتوفاغوسومات. ولذلك، فإن النهج ثنائي المتغيرات التي قدمها راجان وآخرون. كان موظف. وبالنظر إلى المؤامرات ثنائي المتغير، يمكن للمرء أن يسأل عما إذا كانيجب أن تكون الخلايا إيجابية ل LC3، p62، و LAMP1. لماذا هناك الكثير من الخلايا التي لديها 0 البقع؟ وذلك لأن إشارة LC3 قد تكون مشرقة بما فيه الكفاية للتوطين المشترك، ولكنها قد لا تفي بالعتبة المحددة بواسطة قناع الذروة (الذروة (M11، CH11-LC3-AF647، برايت، 4)) اللازمة لكي تعتبر بقعة. بروتوكول المقدمة هنا تستخدم ميفك لحساب LC3 بونكتا والمشاركة في توطين ثلاث علامات التلقيح الذاتي لقياس التدفق الذاتي. في ظل الظروف القاعدية (عينة التحكم)، كان عدد من أوتوفاغوسوميس منخفضة، وتم العثور على عدد قليل من الخلايا مع &quot;البقع العالية&quot;. مع إضافة الكلوروكين، الذي يثبط الانصهار الذاتي / الانصهار ليسوسوم، كان هناك زيادة في عدد البقع LC3. منذ ليسوسوم غير قادر على كسر أوتوفاغوسوم و p62، الذي يقيم في أوتوفاغوسوم، وهذا يؤدي إلى زيادة في المشاركة في توطين ل LC3، p62، و LAMP1 تراكم أوتوليسوسوم. تم تضخيم هذا التأثير تحت ستارف المغذياتأيون، الذي يدفع إلى البلعمة الذاتية. ومع ذلك، من دون إضافة الكلوروكين، لم يكن هناك زيادة كبيرة في عدد من الأوتوفاغوسومات، على الأرجح بسبب زيادة في معدل دوران البلعمة الذاتية. عندما جوعت الخلايا في وجود الكلوروكين، كان هناك زيادة في التوطين المشترك وعدد من أوتوفاغوسوميس، وهو ما يدعم الاستنتاج بأن المجاعة تزيد من التدفق الذاتي. ومن المعروف إبس أن يكون محفز قوي من البلعمة الذاتية. ولذلك، من المتوقع أن تكون الزيادة كبيرة. إذا تم استخدام طريقة أخرى، مثل تحريض المخدرات، للحث على البلعمة الذاتية، قد يكون الفرق بين عنصر التحكم والعينات المعالجة أقل سطوعا. وقد تم تصميم هذا البروتوكول خاصة لقياس البلعمة الذاتية في خطوط الخلايا البشرية، ولكن يمكن تكييف الفحص إلى الأنواع الأخرى عن طريق التحول إلى الأجسام المضادة لهذا النوع معين. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام طريقة التحليل لأي تطبيق داخل الخلايا التي تتطلب المشاركة في التعريبمن ثلاثة تحقيقات / علامات.

ماكرووتوفاجي، ويشار إليها فيما بعد باسم أوتوفاجي، هو مسار تقويضي حيث المكونات المتضررة أو مختلة، والبروتينات طويلة العمر، وعضيات يتم تدهور عن طريق الليزوزوم ويتم إعادة تدويرها 1 . أوتوفاجي هو عملية ديناميكية ومتعددة الخطوات التي تنطوي على تشكيل أوتوفاغوسوم. والانصهار من أوتوفاغوسوم مع ليسوسوم، وتشكيل أوتوليسوسوم. وتدهور محتويات أوتوليسوسوم 2 . علامة بيولوجية حاسمة تستخدم لتحديد التلقيح الذاتي في نظم الثدييات هو البروتين ذات الصلة انيبيب المرتبطة 1A / 1B- سلسلة الخفيفة 3 (LC3)، الذي يشكل غشاء ذاتي تلقائي. أثناء البلعمة الذاتية، مترافق LC3-1 عصاري خلوي إلى فوسفهاتيديليثانولامين لتشكيل LC3-إي. ثم يتم دمج LC3-إي في غشاء ذاتي تلقائي 3 . علامة أخرى تستخدم على نطاق واسع للتدفق الذاتي هو المستقبلة التلقائية سيكستوسوم 1 (SQSTM1، p62) الذي جسديا لينكس الشحنات التلقائية إلى غشاء ذاتي المنشأ 4 ، 5 . الطرق التي استخدمت تقليديا لقياس البلعمة الذاتية هي البقع الغربية والمضان المجهري 7 . ومع ذلك، فإن أيا من هذه الأساليب تعتبر &quot;المعيار الذهبي&quot; ، 2 ، 6 كما أن هناك تحديات المرتبطة بكل من هذه التقنيات. لا تعطي البقع الغربية إلا متوسطا لأنها تستخدم عينة متجانسة، لذا لا يستطيع المراقبون رؤية ما يحدث في الخلايا الفردية. من ناحية أخرى، المجهر مضان يعطي معلومات مراقب على مستوى خلية واحدة، لكنه يفتقر إلى قدرات الإنتاجية، مما يجعل من الصعب الحصول على تقييمات موضوعية ودقيقة إحصائيا. في السنوات الأخيرة، وقياس LC3 و p62 بواسطة التصوير الخلوي المتعدد التدفق الخلوي (ميفك، انظر جدول المواد ) وقد اكتسب بوبووناريتي بسبب قدرتها الكمية، وقدرات الإنتاجية العالية، وإمكانية تعدد الإرسال، والقدرة على صورة كل خلية. واحدة من الطرق الأكثر استخداما لقياس التلقيح الذاتي باستخدام ميفك، جنبا إلى جنب مع برنامجها تحليل رفيق (انظر جدول المواد )، من خلال العد بقعة من العقدة LC3 أو أوتوفاغوسوميس 8 ، 9 ، 10 ، 11 ، 12 ، 13 ، 14 ، 15 ، 16 ، 17 . ومع ذلك، فإن زيادة في أوتوفاغوسوميس لا يعني بالضرورة أن هناك زيادة في البلعمة الذاتية، كما يمكن أن تمثل أيضا حصارا في هذه العملية 2 . LC3-إي دوران هو معلمة مفيدة لقياس التدفق الذاتي من خلال تحليل الخلايا في وجود وغياب مثبط تدهور الليزوزومية، مثل الكلوروكين. الكلوروكوين يمنع انصهار أوتوفاغوسوم إلى ليسوسوم، مما يسمح الكمي لتشكيل أوتوفاغوسوم كمقياس لدرجة البلعمة الذاتية عن طريق القبض على تدفق الذات الذاتي قبل أن يحدث تدهور الليزوزومية 18 . وبالإضافة إلى ذلك، يتم تدهور p62 في المقام الأول عن طريق البلعمة الذاتية، وإذا تم حظر تدهور الليزوزومية من أوتوفاغوسوم ومحتوياته، ومن المتوقع تراكم p62 17 ، 19 . أوتوفاجي هو عملية متعددة المراحل، وقياس LC3 أو p62 وحدها لا توفر صورة كاملة لما يحدث في الخلايا. وقد أكدت المنشورات الحديثة على الحاجة إلى دراسة التشكيل المتزامن لل أوتيليسوسوم 2 ، 17 ، 20 ، 21 . ميفك هوقادرة بشكل فريد لقياس تشكيل جسيم حال ذاتي من تصوير المشارك توطين جسيم بلعمي ذاتي إلى يحلول 15-17، 20، 21، 22، 23، 24، 25، 26. وبالإضافة إلى ذلك، تم أيضا استكشاف التوطين المشترك ل p62 و LC3 باستخدام ميفك لقياس التدفق الذاتي الذاتي 5 . في برنامج التحليل المشار إليه، تسمى &quot;الميزة&quot; التي تقيس التعريب المشترك &quot;تشابه التفاصيل المشرقة R3&quot; (بدس) وتم تصميمها خصيصا لمقارنة تفاصيل الصورة الصغيرة والمشرقة لصورتين. بدس هو معامل ارتباط بيرسون الذي تم تحويله من السجل إلى النقاط المضيئة المترجمة مع نصف قطرها 3 بكسل أو أقل؛ وبعبارة أخرى، بدس بحساب درجة سفرلابينغ بكسل من اثنين من قنوات الفلورسنت مختلفة. أما النقاط المضيئة فهي إما مترابطة ( أي نفس المكان المكاني) أو غير مترابطة ( أي مواقع مكانية مختلفة). لذلك، فإن معامل الارتباط يتراوح بين 0 (غير مترابطة) و 1 (ارتباط كامل). معامل تحويل السجل لزيادة المدى إلى ما بين صفر و إنفينيتي 26 ، 27 . وقد لا تكون خدمات تنمية الأعمال التجارية وحدها كافية؛ راجان وآخرون. وجدت أن استخدام بدس فقط يمكن أن يؤدي إلى نتائج إيجابية كاذبة أو سلبية كاذبة 21 . يقيم بدس التوطين المشترك لعلامتين من البلعمة الذاتية ولكن لا يعتبر عدد الأوتوفاغوسومات. لحساب عدد الأوتوفاغوسومات، راجان وآخرون. وشملت فرز بقعة من L3 بونكتي 21 . راجان وآخرون. اقترح استخدام مؤامرة مبعثر ثنائي المتغير من عدد بقعة LC3 مقابل بدس. باستخدام هذه المؤامرة ثنائية المتغير، واثنين من السكان ورe التي تم تحديدها أولا: واحدة مع الخلايا التي لديها مستوى عال من البقع LC3 واحد مع الخلايا التي لديها مستوى منخفض من البقع LC3. تم تصنيف السكان البقعة العالية ل LC3 إلى مجموعتين: الخلايا ذات التوطين المشترك المنخفض ( أي تراكم الأوتوفاغوسومات) والخلايا ذات التوطين المشترك العالي ( أي تراكم الأوتوليسوسومات). هذه المؤامرة المتغيرين يسمح واحد للتمييز بين الخلايا مع عدد قليل جدا من أوتوفاغوسوميس والخلايا مع تراكم أوتوفاغوسوميس و / أو أوتوليسوسوميس 21 . حتى الآن، لم يكن ممكنا التوطين المشترك في وقت واحد من LC3، p62، و LAMP1 (علامة الليزوزومية) باستخدام واحد &quot;نوع الميزة&quot; في برنامج تحليل رفيق ميفك (انظر جدول المواد ). ومع ذلك، فإن ميزة جديدة، أدخلت مؤخرا في الإصدار 6.1، ويسمى مشرق التفاصيل كولوكاليزاتيون 3 (BDC3). BDC3 يقارن الصور مشرق التفاصيل من كل من الصور الثلاث (في هذه الحالة، لك3، p62، و LAMP1) ويقيس التوطين المشترك من تحقيقات الثلاثة ( أي LC3، p62، و LAMP1). وتحسب ميزة BDC3 معامل ارتباط بيرسون المعدل ليشمل ثلاث صور. وبما أن النقاط المضيئة في الصور الثلاث إما مترابطة أو غير مترابطة، فإن معامل الارتباط يتراوح بين 0 (غير مترابطة) و 1 (ارتباط كامل). يتم تحويل معامل لتحويل السجل إلى زيادة النطاق الديناميكي بين 0 و اللانهاية. من خلال تحويل ميزة بدس مع ميزة BDC3، وطريقة التحليل التي قدمها راجان وآخرون. يمكن الآن دمج ثلاث علامات الأكثر استخداما لقياس البلعمة الذاتية في نظام واحد في نفس الوقت. القدرة على المشاركة في توطين هذه العلامات الثلاثة من البلعمة الذاتية في فحص واحد يمكن أن يؤدي إلى رؤى جديدة في تحريض وتنظيم البلعمة الذاتية. بروتوكول التالية الخطوط العريضة الخطوات للحث على البلعمة الذاتية في خلايا جوركات. تسمية الخلايا مع LC3، p62، و LAMP1 الأجسام المضادة. الحصول على البيانات على متعددةإترال التصوير تدفق مقياس الكريات. وتحليل البيانات لتقييم التدفق الذاتي.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1012">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:244px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">352096</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;">AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31571</td>
			<td style="width:299px;">Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:308px;">anti-human CD107a-PE (LAMP1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328607</td>
			<td style="width:299px;">Clone H4A3. Concentration 400 &#181;g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;">anti-human CD45- AF488</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304017</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">anti-human CD45- PE&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304008</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30.&#160; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;">anti-human CD45-AF647&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304018</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30.&#160; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12</td>
			<td>MBL International Corporation</td>
			<td>M152-3</td>
			<td style="width:299px;">Clone 4E+12.&#160; Concentration 2 mg/mL.&#160; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab185015</td>
			<td style="width:299px;">Clone EPR4844.&#160; Concentration 0.5 mg/mL.&#160; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Chloroquine diphosphate Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6628-25G</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">DAPI Stain 5mg/mL</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>508741</td>
			<td style="width:299px;">http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:308px;">Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1.3704</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10X</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-2010-B</td>
			<td style="width:299px;">&#160;Ca++Mg++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">PBS Ca++Mg++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Earle&#39;s Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14155</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="241">
			<td height="241" style="height:241px;width:308px;">Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td style="width:299px;">This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td style="width:299px;">https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="201">
			<td height="201" style="height:201px;width:308px;">MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">MIFC analysis software - IDEAS 6.2</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).&#160; IDEAS version 6.2</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328608</td>
			<td style="width:299px;">http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30082.1</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:299px;">You can use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RPMI-1640 Medium 1X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Sheath - PBS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td style="width:299px;">Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Sodium Pyruvate solution (100mM)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30239.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td style="width:299px;">This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:308px;">System Calibration Reagent - SpeedBead</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>400041</td>
			<td style="width:299px;">Each tube holds ~10 mL.&#160; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>648463-50ML</td>
			<td style="width:299px;">http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Water, Cell Culture Grade&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry

أوتوفاجي هو مسار تقويضي في المكونات الطبيعية أو خلل التي تتراكم أثناء النمو والتمايز يتم تدهور عن طريق الليزوزوم وإعادة تدويرها. أثناء البلعمة الذاتية، يتم ترطيب البروتين السيتوپلازمي LC3 وتجنيده إلى الأغشية الذاتية. ثم يندمج الأوتوفاجوسوم مع الليزوسوم لتشكيل ال أوتوليسوسوم، حيث يحدث انهيار الحويصلة الذاتية و محتوياته. ويستخدم البروتين المرتبط ب أوبيكيتين p62، الذي يربط LC3، أيضا لمراقبة التدفق الذاتي. يجب أن الخلايا التي تمر البلعمة الذاتية تثبت التوطين المشترك لل p62، LC3، وعلامات الليزوزومية. وقد استخدم المجهر المناعي لتحديد بصريا LC3 بونكتا، p62، و / أو الليزوزومات على أساس كل خلية. ومع ذلك، قد يكون من الصعب الحصول على تقييم موضوعي ودقيق إحصائيا. للتغلب على هذه المشاكل، تم استخدام قياس التدفق الخلوي المتعدد الأطياف جنبا إلى جنب مع ميزة تحليلية يقارن دي مشرق ديالذيل، من ثلاث علامات ذاتية (LC3، p62 و LAMP1 الليزوزومية) ويحدد توطين المشارك، جنبا إلى جنب مع العد بقعة LC3 لقياس البلعمة الذاتية بطريقة موضوعية وكمية، وإحصائيا قوية.

يستخدم هذا الأسلوب تحليل ميزات متعددة لتقويم التدفق الذاتي. من أجل فهم كامل المؤامرة ثنائية المتغير النهائي، يجب أولا التحقيق في ميزات التحليل الفردية. يعد عد الأوتوفاغوسومات طريقة منطقية لقياس البلعمة الذاتية. ومع ذلك، فإن حجم / شكل / سطوع من LC3 بونكتا يمكن أن تختلف بشكل كبير بين الخلايا. الاختلاف يمكن أن يجعل من الصعب حساب أوتوفاغوسوميس يدويا أو باستخدام ميزة العد بقعة في برنامج التحليل. ولذلك، فإن أي ميزة العد بقعة يكون مثاليا بسبب هذا التباين الكبير في أوتوفاغوسوميس. ومع ذلك، فإن ميزة العد بقعة جيدة تعمل على معظم الخلايا 26 . ويبين الشكل 3 أمثلة على اخفاء بقعة من العقدة LC3 في خلايا جوركات باستخدام أقنعة بقعة مختلفة. إن ميزة العد الفوري المحددة لمجموعة البيانات هذه هي سبوت Count_Peak (M11، CH11-LC3-AF647، برايت، 4) _4، بمعنى أن ميزة العد الموضعي تحسب البقع التي يقوم بها بي(M11) على القناة 11 (CH11-LC3-AF647) مع نسبة خلفية من بقعة إلى خلية من 4 (مشرق، 4). ويبين الشكل 4 الرسم البياني العد العد التنازلي وصور تمثيلية لمتوسط ​​عدد بقعة للسيطرة، السيطرة + الكلوروكوين، جوعا، و ستارفيد + كلوروكين جوركات الخلايا المسمى مع مكافحة LC3-AF647. السيطرة و ستارفد متوسط ​​التهم بقعة لا تختلف اختلافا كبيرا؛ مع إضافة الكلوروكين، هناك فرق كبير في متوسط ​​السيطرة + الكلوروكين مقارنة مع ستارفيد + الكلوروكين. الميزة التالية للتحقيق هي BDC3. BDC3 هو قياس التوطين المشترك لثلاثة علامات / تحقيقات، في هذه الحالة، LC3، p62، و LAMP1. الشكل 5A - 5D يظهر الرسوم البيانية BDC3 للسيطرة، السيطرة + الكلوروكين، جوعا، و ستارفيد + الكلوروكوين جوركات الخلايا المسمى مع مكافحة p62-AF488، ومكافحة LAMP1-بي، ومكافحة LC3-AF647. هناك تحول بين متوسط ​​كونترول إلى المتوسط ​​الجارف، فضلا عن كونترول + كلوروكين يعني إلى ستارفيد + كلوروكين يعني. ومع ذلك، وبالنظر إلى صور الخلايا من متوسط ​​عشرات BDC3 في الشكل 5E - 5H ، وهناك فرق أكبر بين العينات من الرسوم البيانية قد يؤدي واحد إلى الاعتقاد. وذلك لأن BDC3 لا تنظر في عدد من العضيات البلعمة الذاتية التي تشارك في توطين، مما أدى إلى درجة كبيرة من التباين في عدد من الأوتوفاغوسومات لنفس درجة BDC3. في معظم الحالات، هناك تداخل بين تحقيقات الثلاثة لأنه، حتى في المستويات القاعدية، p62، LAMP1، و LC3 ينبغي، إلى حد ما، المشاركة في توطين أو يقيمون في مناطق مماثلة في الخلايا. على النقيض من ذلك، مثال على ثلاثة تحقيقات لا ينبغي أن تشارك في محلية هي المضادة لل p62-AF488، ومكافحة LC3-AF647، و دابي الصبغة النووية لعينة ستارفيد + الكلوروكوين، كما هو مبين في الشكل 6. &lt;<html> / P&gt; عندما يتم الجمع بين ميزة بقعة العد وميزة BDC3، وجود مجموعات سكانية فرعية مختلفة من شأنها أن تحسن القدرة على التمييز بين مختلف عينات / شروط واضحة. ويبين الشكل 7 مؤامرة ثنائي المتغير من بقعة بقعة من LC3 مقابل BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 للعينات الأربعة: السيطرة، السيطرة + الكلوروكين، جوعا، ونارفد + الكلوروكين. تم استخدام عينة التحكم لتعيين استراتيجية النابضة لثلاث مجموعات: البقع المنخفضة، البقع العالية / منخفضة BDC3، والبقع العالية / عالية BDC3. وأظهرت عينات السيطرة أن أكثر من 98٪ من الخلايا كان 1 أو أقل البقع. تم تعيين الحدود بين البقع العالية / منخفضة BDC3 والبقع العالية / BDC3 عالية إلى درجة BDC3 من 1 لأن أكثر من 91٪ من العينة السيطرة على درجة BDC3 أقل من 1. ملخص لنتائج المؤامرات ثنائي المتغير في الجدول 1 . <html> العمر = &quot;1&quot;&gt; <img alt="شكل 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> الشكل 1: إعداد أداة ميفك. لقطة شاشة لإعدادات أداة ميفك المستخدمة لهذه التجربة، المبينة في الخطوة 8 من البروتوكول. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> الشکل 2: إستراتیجیة مباعدة برامج التحلیل. لقطة شاشة من مخطط تحليل البرامج المباعدة، المبينة في الخطوة 9 من البروتوكول. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> fig3.jpg &quot;/&gt; الشكل 3: LC3 بقعة اخفاء. جوركات صور الخلايا والأقنعة المستخدمة لإنشاء ميزة العد بقعة. (M11، CH11-LC3-AF647، برايت، 2)، الذروة (M11، CH11-LC3-AF647، برايت، 4)، الذروة (M11، CH11-LC3-AF647 ، مشرق، 5)، بقعة (M11، CH11-LC3-AF647، مشرق، 5،3،1)، بقعة (M11، CH11-LC3-AF647، مشرق، 6،2،1). القناع الذي يعمل بشكل أفضل لجميع الخلايا أظهرت هو الذروة (M11، CH11-LC3-AF647، مشرق، 4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> الشكل 4: رسم بياني لعد التنازلي LC3. باستخدام ميزة العد الفوري سبوت Count_Peak (M11، CH11-LC3-AF647، برايت، 4) _4 و الرسم البياني العددي LC3-AF647 العد التنازلي للتحكم ( A ، أزرق فاتح)، كونترول + كلوروكينe ( b ، الأزرق)، ستارفيد ( c ، الوردي)، و ستارفيد + الكلوروكين ( d ، الأحمر). متوسط ​​التعداد الموضعي ل كونترول، كونترول + كلوروكين، ستارفيد، أند ستارفيد + كلوروكين 0.07، 1.13، 0.10، 2.77، على التوالي. LC3-AF647 (الأحمر)، صبغ النووي دابي (الأزرق)، ومركب من الصور LC3-AF647 و دابي للخلايا التمثيلية للعد متوسط ​​البقعة للرقابة ( E ، 0 البقع)، ​​التحكم + الكلوروكين F ، 1 بقعة)، ستارفيد ( G ، 0 البقع)، ​​و ستارفيد + الكلوروكين ( H ، 3 البقع). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> الشكل 5: الرسم البياني BDC3 من p62 / LAMP1 / LC3. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 رسوم بيانية فوr التحكم ( A ، الضوء الأزرق)، تحكم + الكلوروكين ( B ، الأزرق)، ستارفيد ( C ، الوردي)، و ستارفيد + الكلوروكين ( D ، الأحمر). متوسط ​​درجة BDC3 للتحكم، التحكم + الكلوروكوين، الجوع، و النجم + الكلوروكين هي 0.57، 0.82، 0.74، و 0.98، على التوالي. BF. p62-AF488 (أخضر)؛ LAMP1-بي (الأصفر)؛ LC3-AF647 (أحمر)؛ ويظهر مركب من الصور p62-AF488، LAMP1-بي، و LC3-AF647 للخلايا التمثيلية لمتوسط ​​BDC3 للتحكم ( E )، التحكم + الكلوروكين ( F )، ستارفيد ( G )، و ستارفيد + كلوروكين H ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> الشكل 6: الرسم البياني BDC3 من p62 / LC3 / دابي ل ستارفيد + الكلوروكين عينة. ( A ) BDC3 p62 / LC3 / دابي الرسم البياني ل ستارفيد + الكلوروكين عينة. متوسط ​​درجة BDC3 هو 0.07. ( ب ) بف؛ p62-AF488 (أخضر)؛ LC3-AF647 (أحمر)؛ دابي (الأزرق)؛ ويظهر مركب من الصور P62-AF488، LC3-AF647، و دابي للخلايا التمثيلية لمتوسط ​​BDC3 لعينة + جذور الكلوروكين. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> الشكل 7: قطعتين متغيرتين من عدد البقع LC3 مقابل BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) المؤامرات ثنائي المتغير من العد بقعة LC3 مقابل BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 للسيطرة، السيطرة + الكلوروكين، جوعا، وخزف + الكلوروكوين جوركات الخلايا. ( ب ) بف؛ p62-AF488 (أخضر)؛ LAMP1-بي (الأصفر)؛ LC3-AF647 (أحمر)؛ ويظهر مركب من الصور p62-AF488، LAMP1-بي، و LC3-AF647 من ثلاث مناطق ( أي البقع المنخفضة، والبقع العالية / منخفضة BDC3، والبقع العالية / BDC3 عالية) لعينة الكلوركين. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> تعداد الخلايا </td><td> تفاصيل مشرقة كولوكاليزاتيون 3 يعني </td><td> سبوت كونت LC3 مين </td><td> ٪ بقعة منخفضة </td><td> ٪ ارتفاع بقعة / منخفضة BDC3 </td><td> ٪ عالية بقعة / عالية BDC3 </td></tr><tr><td> مراقبة </td><td> 439 </td><td> 0.57 </td><td> 0.07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0.0 </td></tr><tr><td> السيطرة + الكلوروكين </td><td> 1432 </td><td> 0.82 </td><td> 1.13 </td><td> 68.9 </td&gt; <td> 19.5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> ميت من الجوع </td><td> 1204 </td><td> 0.74 </td><td> 0.10 </td><td> 98.4 </td><td> 0.6 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> جارف + الكلوروكين </td><td> 1811 </td><td> 0.98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36.9 </td><td> 31.0 </td></tr></tbody></table> الجدول 1: ملخص جوركات LC3 بقعة العد مقابل BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 المتغير ثنائي القطعة

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

هنا، يستخدم قياس التدفق الخلوي المتعدد الأطياف مع ميزة تحليلية يقارن الصور التفصيلية المشرقة لثلاثة علامات للبلعمة الذاتية ويحدد مدى مشاركتها في التعريب، جنبا إلى جنب مع عد بقعة LC3، لقياس التلقيح الذاتي بطريقة موضوعية وكمية وإحصائية قوية.

تقييم التمويه الذاتي عن طريق قياس LC3، p62، و LAMP1 المشاركة في التعريب باستخدام قياس التدفق المتعدد الأطياف الخلوي

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Research

JoVE Journal

Biology

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

IP - FCM : مناعي التي كشفتها التدفق الخلوي

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

قياس الكمي GLUT4 إزفاء إلى غشاء البلازما التي التدفق الخلوي

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

تدفق تنقية الخلوي للخلايا الفأر الانتصافي

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

قياس حركية تقدم دورة الخلية مع وصفها الأيض والتدفق الخلوي

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

الأمثل أساليب النمذجة وتلوين لرصد انتشار استخدام الأصباغ انقسام الخلية خلية تتبع

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

قياس الكالسيوم داخل الخلايا<sup&gt; 2 +</sup&gt; التغييرات في الحيوانات المنوية البشرية باستخدام تقنيات أربعة: قياس التألق التقليدية، وتوقفت قياس التألق التدفق، التدفق الخلوي والتصوير خلية واحدة

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

التعرف على الفئران أرومة الحمراء حيوانية المخصب في Enucleating الأحداث بواسطة متعدد الأطياف التصوير التدفق الخلوي

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

في فيفو تتبع 4 الأبعاد للالجذعية المكونة للدم والسلف الكبار في خلايا الفأر قبي نخاع العظم

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

قياس الكالسيوم عصاري خلوي في الخلايا الظهارية الكلوية بواسطة التدفق الخلوي

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...