Name: assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry
Uploaded: 2017-07-21T13:00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Ich möchte meinen Mitarbeitern bei MilliporeSigma, Philip J. Morrissey und Sherree L. Friend, für ihre Unterstützung und Führung im Laufe der Jahre danken. Ich möchte auch Vidya Venkatachalam und Bryan R. Davidson für ihre Hilfe bei der BDC3-Funktion in der IDEAS-Software , Ryan P. Jessup für die Bearbeitung dieses Manuskripts, Raymond Kong für Hilfe am Tag des Schießens und ein besonderes Dankeschön danken Zum Maskenbildner Cynthia Xamonthiene.

<ol>
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Ich bin bei MilliporeSigma beschäftigt, dem Hersteller der Amnis-Marke ImageStream, die in dieser Studie verwendet wurde.

Bei der Durchführung dieser Analyse gibt es ein paar Dinge zu beachten. Es ist wichtig, entsprechende Kontrollproben zu haben. Für dieses Experiment wurden zwei verschiedene Kontrollen verwendet: Kontrolle und Kontrolle + Chloroquin. Die Kontrollprobe wurde verwendet, um die Schwelle für die Regionen festzulegen. Es stellt die Grundstufe der Autophagie dar, ohne den lysosomalen Abbau zu stoppen und ist die Kontrolle für die verstorbene Probe. Allerdings ist die Kontrollprobe keine geeignete Kontrolle, um mit den Ergebnissen der Starved + Chloroquine Probe zu vergleichen, da Chloroquin selbst die Kontrollprobe beeinflusst. Daher war es notwendig, eine Kontrolle + Chloroquin Probe zu haben. Vor der Durchführung einer Analyse für Autophagie, ist es wichtig, nur analysieren / Gate auf einzelne Zellen, die im Fokus sind ( dh Gradient RMS größer als 60), da die Ergebnisse betroffen sein könnten, wenn es mehr als eine Zelle oder die Bilder sind unscharf. Es ist entscheidend, dass das AutophagosomEs und Lysosomen sind im Fokus für die richtige Punktzählung und BDC3-Analyse. Apoptotische Zellen müssen vor der Autophagie-Analyse entfernt werden, da sie Ergebnisse schneiden können und nicht aufgenommen werden sollten. Es sollte eine angemessene Färbung für alle drei Marker ( dh LC3, p62 und LAMP1) geben. Zum Beispiel sind alle drei Marker intrazellulär und sollten ein punktuelles Signal haben; Wenn das Signal nicht punktiert ist oder ob es sich auf der Oberfläche der Zelle befindet, wäre die Färbung nicht angemessen und das Experiment / Färben sollte erneuert werden. Darüber hinaus, für BDC3 genau zu sein, ist es wichtig, auf Zellen, die hell sind für alle drei fluoreszierenden Marker von Interesse. Gating auf positive Ereignisse ist erforderlich, um die Messung von BDC3 auf unspezifische Bindung, Bildgebung Artefakte und / oder Rauschen zu verhindern. Dies ist entscheidend, da BDC3 potenziell Artefakte verstärken kann, die keine wahren Signale sind. Da BDC3 nur bei hellen positiven Ereignissen durchgeführt werden kann, können viele Zellen nicht in die endgültige Analyse einbezogen werden; Das ist especEcht für Kontrollzellen, die keine Akkumulation von LC3, p62 und / oder LAMP1 haben. Eine Einschränkung dieses Assays besteht also darin, dass BDC3 nur Zellen untersucht, die für alle drei Marker positiv sind, die für alle Autophagieexperimente nicht geeignet sind. Wie BDS, die bereits gemeldet wurde, 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , BDC3 allein, berücksichtigt nicht die Anzahl der autophagischen Organellen, die sich lokalisieren, was zu einem großen Teil führt Der Variabilität in der Anzahl der Autophagosomen. Daher ist der bivariate Ansatz von Rajan et al. war angestellt. Wenn man die bivariate Plots betrachtet, könnte man fragen, obDie Zellen müssen positiv für LC3, p62 und LAMP1 sein; Warum gibt es so viele Zellen, die 0 Spots haben? Dies liegt daran, dass das LC3-Signal für die Co-Lokalisierung hell genug sein könnte, aber es könnte nicht die von der Peak-Maske eingestellte Schwelle (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) erfüllen, die für die Verwendung als a erforderlich ist Stelle. Das hier vorgestellte Protokoll verwendete MIFC, um LC3 puncta zu zählen und die Co-Lokalisierung von drei Autophagie-Markern zur Messung des autophagischen Flusses. Unter basalen Bedingungen (Kontrollprobe) war die Anzahl der Autophagosomen niedrig, und wenige Zellen wurden mit &quot;High Spots&quot; gefunden. Mit der Zugabe von Chloroquin, das die Autophagosom / Lysosomen-Fusion hemmt, kam es zu einer Erhöhung der Anzahl der LC3-Spots. Da das Lysosom nicht in der Lage ist, das Autophagosom zu brechen und das p62, das im Autophagosom liegt, führt dies zu einer Erhöhung der Co-Lokalisation der LC3-, p62- und LAMP1-Autolysosomen-Akkumulation. Dieser Effekt wurde unter Nährstoff-Starvat verstärktIonen, die Autophagie induziert. Allerdings, ohne die Zugabe von Chloroquin, gab es keine signifikante Erhöhung der Anzahl der Autophagosomen, wahrscheinlich aufgrund einer Erhöhung der Rate der autophagischen Umsatz. Als die Zellen in Gegenwart von Chloroquin verhungert wurden, gab es eine Zunahme der Co-Lokalisierung und Anzahl der Autophagosomen, die die Schlussfolgerung unterstützt, dass der Hunger den autophagischen Fluss erhöht. EBSS ist bekannt als ein leistungsfähiger Induktor der Autophagie. Daher ist zu erwarten, dass die Zunahme groß wäre. Wenn ein anderes Verfahren, wie z. B. Arzneimittelinduktion, verwendet wird, um Autophagie zu induzieren, kann der Unterschied zwischen der Kontrolle und den behandelten Proben subtiler sein. Dieses spezielle Protokoll wurde entwickelt, um Autophagie in menschlichen Zelllinien zu messen, aber der Assay könnte an andere Spezies angepasst werden, indem er auf Antikörper für diese spezielle Spezies umschaltet. Darüber hinaus könnte die Analyse-Methode für jede intrazelluläre Anwendung, die die Co-Lokalisierung erfordert verwendet werdenVon drei Sonden / Markern.

Makroautophagie, im Folgenden Autophagie genannt, ist ein katabolischer Weg, in dem beschädigte oder dysfunktionelle Komponenten, langlebige Proteine ​​und Organellen über das Lysosom abgebaut und recycelt werden 1 . Autophagie ist ein dynamischer, mehrstufiger Prozess, der die Bildung eines Autophagosoms beinhaltet; Die Verschmelzung des Autophagosoms mit dem Lysosom, die das Autolysosom bildet; Und der Abbau des Inhalts des Autolysosoms 2 . Der entscheidende biologische Marker, der zur Identifizierung von Autophagie in Säugetiersystemen verwendet wird, ist das Mikrotubuli-assoziierte Protein 1A / 1B-leichte Kette 3 (LC3), das die autophagosomale Membran bildet. Während der Autophagie wird zytosolisches LC3-1 an Phosphatidylethanolamin konjugiert, um LC3-II zu bilden; LC3-II wird dann in die autophagosomale Membran 3 eingearbeitet. Ein weiterer weit verbreiteter Marker für autophagischen Fluss ist das Autophagie-Rezeptor-Sequestosom 1 (SQSTM1, p62), das physisch liNaut autophagische Ladung an die autophagische Membran 4 , 5 . Methoden, die traditionell verwendet wurden, um Autophagie zu messen, sind Western Blots und Fluoreszenzmikroskopie 7 . Jedoch werden keine dieser Methoden als der &quot;Goldstandard&quot; betrachtet 2 , 6, da es Herausforderungen gibt, die mit diesen beiden Techniken verbunden sind. Western Blots geben nur einen Durchschnitt, weil sie eine homogenate Probe verwenden, so dass Beobachter nicht sehen können, was in einzelnen Zellen passiert. Auf der anderen Seite gibt die Fluoreszenzmikroskopie eine Beobachterinformation auf der einzelligen Ebene, aber es fehlt die Durchsatzfähigkeit, so dass es schwierig ist, objektive und statistisch rigorose Einschätzungen zu erhalten. In den letzten Jahren hat die Messung von LC3 und p62 durch multispektrale Bildgebungsdurchflusszytometrie (MIFC, siehe Tabelle der Materialien ) popu gewonnenGröße durch seine quantitative Leistung, hohe Durchsatzfähigkeiten, Multiplex-Potential und die Fähigkeit, jede Zelle abzubilden. Eine der am weitesten verbreiteten Methoden zur Messung der Autophagie mit MIFC, zusammen mit ihrer Begleitanalyse-Software (siehe Tabelle der Materialien ), ist durch die Punktzählung von LC3 puncta oder autophagosomen 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Allerdings bedeutet eine Erhöhung der Autophagosomen nicht zwangsläufig, dass es eine Erhöhung der Autophagie gibt, da sie auch eine Blockade im Prozess darstellen könnte 2 . LC3-II Umsatz ist ein nützlicher Parameter, um autophagischen Fluss zu messen durch die Analyse von Zellen in der Gegenwart undAbwesenheit eines lysosomalen Abbauinhibitors, wie Chloroquin. Chloroquin inhibiert die Fusion des Autophagosom zum Lysosom, wodurch die Quantifizierung der Autophagosom Bildung als Maß für den Grad der durch autophagy autophagischen Flußmittel vor dem lysosomalen Abbau Arretieren kann 18 auftreten. Darüber hinaus wird p62 primär durch Autophagie abgebaut, und wenn der lysosomale Abbau des Autophagosoms und seines Inhalts blockiert wird, wird eine Anreicherung von p62 erwartet, 17 , 19 . Autophagy ist ein mehrstufiger Prozess, und die Messung von LC3 oder p62 allein liefert kein vollständiges Bild dessen, was in den Zellen passiert. Die jüngsten Veröffentlichungen haben die Notwendigkeit betont, die gleichzeitige Bildung des Autolysosoms 2 , 17 , 20 , 21 zu untersuchen . MIFC istDie die Bildung des Autolysosoms durch die Abbildung der Co-Lokalisierung des Autophagosoms an das Lysosom 15 - 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 eindeutig messen kann. Darüber hinaus wurde auch die Co-Lokalisierung von p62 und LC3 unter Verwendung von MIFC untersucht, um den autophagischen Fluss 5 zu messen. In der referenzierten Analysesoftware heißt das &quot;Merkmal&quot;, das die Co-Lokalisierung misst, &quot;Bright Detail Similarity R3&quot; (BDS) und wurde speziell entworfen, um die kleinen, hellen Bilddetails von zwei Bildern zu vergleichen. BDS ist der logarithmierte Pearson-Korrelationskoeffizient der lokalisierten hellen Flecken mit einem Radius von 3 Pixeln oder weniger; Mit anderen Worten, BDS berechnet den Grad von oVerkürzte Pixel aus zwei verschiedenen Fluoreszenzkanälen. Die hellen Flecken sind entweder korreliert ( dh gleiche räumliche Lage) oder unkorrelierte ( dh unterschiedliche räumliche Orte). Daher variiert der Korrelationskoeffizient zwischen 0 (unkorreliert) und 1 (perfekte Korrelation). Der Koeffizient wird log-transformiert, um den Bereich zwischen null und unendlich 26 , 27 zu erhöhen. BDS allein darf nicht ausreichen; Rajan et al. Dass mit nur BDS zu falsch-positiven oder falsch-negativen Ergebnissen führen könnte 21 . BDS bewertet die Co-Lokalisierung von zwei Marker der Autophagie, aber nicht die Anzahl der Autophagosomen. Um die Anzahl der Autophagosomen zu berücksichtigen, haben Rajan et al. Inklusive Punktzählung der LC3 puncta 21 . Rajan et al. Vorgeschlagen, mit einem bivariate Scatter-Plot von LC3-Spot-Zählung gegenüber BDS. Mit dieser bivariate Handlung, zwei Populationen werE zuerst identifiziert: eine mit Zellen, die ein hohes Maß an LC3 Spots und eine mit Zellen, die ein niedriges Niveau von LC3 Spots haben. Die Hoch-LC3-Punkt-Population wurde weiter in zwei Populationen unterteilt: Zellen mit geringer Co-Lokalisierung ( dh Akkumulation von Autophagosomen) und Zellen mit hoher Co-Lokalisierung ( dh Akkumulation von Autolysosomen). Diese bivariate Handlung erlaubt es, zwischen Zellen mit sehr wenigen Autophagosomen und Zellen mit einer Anhäufung von Autophagosomen und / oder Autolysosomen zu unterscheiden 21 . Bisher war die gleichzeitige Ko-Lokalisierung von LC3, p62 und LAMP1 (lysosomaler Marker) nicht möglich mit einem einzigen &quot;Feature Type&quot; in der MIFC Companion Analysesoftware (siehe Tabelle der Materialien ). Ein neues Feature, das kürzlich in Version 6.1 eingeführt wurde, heißt Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 vergleicht die hellen Detailbilder von jedem der drei Bilder (in diesem Fall LC3, p62 und LAMP1) und quantifiziert die Co-Lokalisierung der drei Sonden ( dh LC3, p62 und LAMP1). Die BDC3-Funktion berechnet den Korrekturkoeffizienten des Pearson, der modifiziert wurde, um auf drei Bilder zu erweitern. Da die hellen Flecken in den drei Bildern entweder korreliert oder unkorreliert sind, variiert der Korrelationskoeffizient zwischen 0 (unkorreliert) und 1 (perfekte Korrelation). Der Koeffizient wird log-transformiert, um den Dynamikbereich zwischen 0 und unendlich zu erhöhen. Durch das Ausschalten der BDS-Funktion mit der BDC3-Funktion, die Analyse-Methode von Rajan et al. Kann nun die drei am häufigsten verwendeten Marker zur Messung der Autophagie in einem System zur gleichen Zeit einbinden. Die Fähigkeit, diese drei Marker von Autophagie in einem einzigen Assay zu lokalisieren, könnte zu neuartigen Einsichten in die Induktion und Regulierung der Autophagie führen. Das folgende Protokoll skizziert die Schritte, um Autophagie in Jurkat-Zellen zu induzieren; Markieren Sie die Zellen mit LC3-, p62- und LAMP1-Antikörpern; Erwerben von Daten auf einem MultispEctral Bildgebungsdurchflusszytometer; Und analysieren die Daten, um autophagischen Fluss zu beurteilen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1012">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:244px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">352096</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;">AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31571</td>
			<td style="width:299px;">Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:308px;">anti-human CD107a-PE (LAMP1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328607</td>
			<td style="width:299px;">Clone H4A3. Concentration 400 &#181;g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;">anti-human CD45- AF488</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304017</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">anti-human CD45- PE&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304008</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30.&#160; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;">anti-human CD45-AF647&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304018</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30.&#160; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12</td>
			<td>MBL International Corporation</td>
			<td>M152-3</td>
			<td style="width:299px;">Clone 4E+12.&#160; Concentration 2 mg/mL.&#160; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab185015</td>
			<td style="width:299px;">Clone EPR4844.&#160; Concentration 0.5 mg/mL.&#160; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Chloroquine diphosphate Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6628-25G</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">DAPI Stain 5mg/mL</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>508741</td>
			<td style="width:299px;">http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:308px;">Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1.3704</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10X</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-2010-B</td>
			<td style="width:299px;">&#160;Ca++Mg++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">PBS Ca++Mg++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Earle&#39;s Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14155</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="241">
			<td height="241" style="height:241px;width:308px;">Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td style="width:299px;">This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td style="width:299px;">https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="201">
			<td height="201" style="height:201px;width:308px;">MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">MIFC analysis software - IDEAS 6.2</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).&#160; IDEAS version 6.2</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328608</td>
			<td style="width:299px;">http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30082.1</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:299px;">You can use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RPMI-1640 Medium 1X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Sheath - PBS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td style="width:299px;">Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Sodium Pyruvate solution (100mM)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30239.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td style="width:299px;">This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:308px;">System Calibration Reagent - SpeedBead</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>400041</td>
			<td style="width:299px;">Each tube holds ~10 mL.&#160; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>648463-50ML</td>
			<td style="width:299px;">http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Water, Cell Culture Grade&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry

Autophagie ist ein katabolischer Weg, in dem normale oder dysfunktionelle zelluläre Komponenten, die sich während des Wachstums und der Differenzierung ansammeln, über das Lysosom abgebaut und recycelt werden. Während der Autophagie wird das zytoplasmatische LC3-Protein lipidiert und an die autophagosomalen Membranen rekrutiert. Das Autophagosom verschmilzt dann mit dem Lysosom, um das Autolysosom zu bilden, wo der Abbau der Autophagosomen-Vesikel und deren Inhalt auftritt. Das ubiquitin-assoziierte Protein p62, das an LC3 bindet, wird auch zur Überwachung des autophagischen Flusses verwendet. Zellen, die sich einer Autophagie unterziehen, sollten die Co-Lokalisierung von p62, LC3 und lysosomalen Markern nachweisen. Immunfluoreszenzmikroskopie wurde verwendet, um LC3 puncta, p62 und / oder Lysosomen auf einer per-Zell-Basis visuell zu identifizieren. Eine objektive und statistisch rigorose Bewertung kann jedoch schwierig sein. Um diese Probleme zu überwinden, wurde die multispektrale Bildgebungsdurchflusszytometrie zusammen mit einem analytischen Merkmal verwendet, das die helle de vergleicht(LC3, p62 und lysosomale LAMP1) und quantifiziert ihre Co-Lokalisierung in Kombination mit LC3-Punktzählung, um Autophagie in einer objektiven, quantitativen und statistisch robusten Weise zu messen.

Diese Analysemethode verwendet mehrere Merkmale, um den autophagischen Fluss zu bekämpfen. Um die endgültige bivariate Handlung vollständig zu verstehen, müssen zunächst die einzelnen Analysemerkmale untersucht werden. Das Zählen von Autophagosomen ist ein logischer Weg, um Autophagie zu messen; Allerdings kann die Größe / Form / Helligkeit von LC3 puncta drastisch zwischen den Zellen variieren. Variation kann es schwierig machen, Autophagosomen manuell zu zählen oder eine Spot-Zählfunktion in der Analysesoftware zu verwenden. Daher ist kein Punktzähler-Feature perfekt aufgrund dieser großen Variabilität in Autophagosomen. Jedoch wird ein gutes Punktzählungsmerkmal an den meisten Zellen arbeiten 26 . Abbildung 3 zeigt Beispiele für die Punktmaskierung von LC3-Puncta in Jurkat-Zellen mit verschiedenen Spotmasken. Die für diesen Datensatz ausgewählte Spot-Count-Funktion ist Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, was bedeutet, dass die Spot-Zähl-Funktion die Spots gezählt hatAk-Maske (M11) auf Kanal 11 (Ch11-LC3-AF647) mit einem Punkt-zu-Zellen-Hintergrundverhältnis von 4 (Bright, 4) identifiziert. Fig. 4 zeigt Spot-Zähl-Histogramme und repräsentative Bilder für die mittlere Spotzahl für die mit Anti-LC3-AF647 markierten Kontroll-, Kontroll- + Chloroquin-, verhungerten und verhungerten + Chloroquin-Jurkat-Zellen. Die Kontrolle und die verhungerten Mittelpunkte sind nicht signifikant unterschiedlich; Bei der Zugabe von Chloroquin gibt es einen großen Unterschied im Mittel der Kontrolle + Chloroquin im Vergleich zu dem Starved + Chloroquin. Die nächste zu untersuchende Funktion ist BDC3. BDC3 ist ein Maß für die Co-Lokalisierung von drei Markern / Sonden, in diesem Fall LC3, p62 und LAMP1. Abbildung 5A - 5D zeigt BDC3-Histogramme für die mit Anti-p62-AF488 markierten Kontroll-, Kontroll- + Chloroquin-, verhungerten und verhungerten + Chloroquin-Jurkat-Zellen, Anti-LAMP1-PE und Anti-LC3-AF647. Es gibt eine Verschiebung zwischen dem Kontrollmittel zum verhungerten Mittelwert, sowie die Kontrolle + Chloroquin bedeutet für das Starved + Chloroquin-Mittel. Wenn man jedoch die Bilder von Zellen aus den mittleren BDC3-Scores in Abbildung 5E- 5H betrachtet , gibt es einen größeren Unterschied zwischen den Proben, als die Histogramme einen zu glauben führen können. Dies ist, weil BDC3 nicht die Anzahl der Autophagie Organellen, die co-lokalisieren, was zu einem großen Maß an Variabilität in der Anzahl der Autophagosomen für die gleiche BDC3-Score. In den meisten Fällen gibt es eine Überlappung zwischen allen drei Sonden, da auch in Basalstufen p62, LAMP1 und LC3 bis zu einem gewissen Grad in ähnlichen Bereichen in den Zellen co-lokalisieren oder sich befinden sollen. Als Kontrast kann ein Beispiel für drei Sonden, die nicht ko-lokalisieren sollten, anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 und DAPI-Kernfarbstoff für die Starved + Chloroquine-Probe, wie in Abbildung 6 gezeigt/ P&gt; Wenn das Spot-Zählmerkmal und die BDC3-Funktion kombiniert werden, ist das Vorhandensein unterschiedlicher Subpopulationen, die die Fähigkeit zur Unterscheidung zwischen den verschiedenen Proben / Bedingungen verbessern, offensichtlich. Abbildung 7 zeigt die bivariate Darstellung der Spotzahl von LC3 gegenüber BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 für die vier Proben: Kontrolle, Kontrolle + Chloroquin, verhungert und verhungert + Chloroquin. Die Kontrollprobe wurde verwendet, um die Gating-Strategie für drei Populationen festzulegen: Low Spots, High Spots / Low BDC3 und High Spots / High BDC3. Die Kontrollproben zeigten, dass mehr als 98% der Zellen 1 oder weniger Flecken hatten. Die Grenze zwischen den High Spots / Low BDC3 und High Spots / High BDC3 wurde auf einen BDC3 Score von 1 gesetzt, da mehr als 91% der Control Probe einen BDC3 Score von weniger als 1 hatten. Eine Zusammenfassung der Ergebnisse für die bivariate Plots Ist in Tabelle 1 dargestellt . Alter = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Abbildung 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> Abbildung 1: Einstellung des MIFC-Geräts. Ein Screenshot der MIFC-Instrumenteneinstellungen, die für dieses Experiment verwendet wurden, in Schritt 8 des Protokolls skizziert. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> Abbildung 2: Analyse-Software-Gating-Strategie. Ein Screenshot der Analyse-Software-Gating-Schema, skizziert in Schritt 9 des Protokolls. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Fig3.jpg &quot;/&gt; Abbildung 3: LC3-Spot-Maskierung. Jurkat Zelle Bilder und Masken verwendet, um die Spot-Zähl-Feature zu erstellen. Gezeigt sind BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 2), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647) , Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5,3,1) und Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6,2,1). Die Maske, die am besten für alle gezeigten Zellen funktionierte, war Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> Abbildung 4: LC3-Spot-Count-Histogramme. Verwenden Sie die Spot-Count-Funktion Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 und die LC3-AF647 Spot-Zähler-Histogramme für Control ( A , hellblau), Control + ChloroquinE ( B , blau), verhungert ( C , rosa) und verhungert + Chloroquin ( D , rot). Der mittlere Punkt zählt für Kontrolle, Kontrolle + Chloroquin, verhungert und verhungert + Chloroquin sind 0,07, 1,13, 0,10 bzw. 2,77. BF, LC3-AF647 (rot), DAPI-Kernfarbstoff (blau) und ein Komposit der LC3-AF647- und DAPI-Bilder von repräsentativen Zellen für die mittlere Punktzahl sind für die Kontrolle ( E , 0-Punkte), Control + Chloroquin ( F , 1 Stelle), Starved ( G , 0 Spots) und Starved + Chloroquine ( H , 3 Spots). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> Abbildung 5: BDC3 Histogramme von p62 / LAMP1 / LC3. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Histogramme fürR Kontrolle ( A , hellblau), Kontrolle + Chloroquin ( B , Blau), Verhungert ( C , Rosa) und Starved + Chloroquin ( D , Rot). Die mittlere BDC3-Punktzahl für Kontrolle, Kontrolle + Chloroquin, Starved und Starved + Chloroquin beträgt 0,57, 0,82, 0,74 bzw. 0,98. BF; P62-AF488 (grün); LAMP1-PE (gelb); LC3-AF647 (rot); Und ein Composite der p62-AF488-, LAMP1-PE- und LC3-AF647-Bilder von repräsentativen Zellen für den mittleren BDC3 sind für die Kontrolle ( E ), Control + Chloroquin ( F ), Starved ( G ) und Starved + Chloroquin ( H ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> Abbildung 6: BDC3 Histogramme von p62 / LC3 / DAPI für die Starved + Chloroquine Probe. ( A ) BDC3 p62 / LC3 / DAPI-Histogramm für die Starved + Chloroquin-Probe wird gezeigt. Die mittlere BDC3-Punktzahl beträgt 0,07. ( B ) BF; P62-AF488 (grün); LC3-AF647 (rot); DAPI (blau); Und ein Komposit der p62-AF488-, LC3-AF647- und DAPI-Bilder von repräsentativen Zellen für den mittleren BDC3 ist für die Starved + Chloroquin-Probe gezeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> Abbildung 7: Bivariate Plots von LC3 Spot Count gegen BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Bivariate Plots der LC3-Spotzahl gegenüber BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 für Control, Control + Chloroquine, Starved und Starved + Chloroquine Jurkat-Zellen. ( B ) BF; P62-AF488 (Grün); LAMP1-PE (gelb); LC3-AF647 (rot); Und ein Verbund der p62-AF488-, LAMP1-PE- und LC3-AF647-Bilder aus drei Regionen ( dh Low Spots, High Spots / Low BDC3 und High Spots / High BDC3) sind für die Starved + Chloroquine-Probe gezeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Anzahl der Zellen </td><td> Helles Detail Kolokalisierung 3 Mittelwert </td><td> Spot Count LC3 Mittler </td><td> % Niedriger Punkt </td><td> % High Spot / Low BDC3 </td><td> % High Spot / High BDC3 </td></tr><tr><td> Steuern </td><td> 439 </td><td> 0,57 </td><td> 0,07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0,0 </td></tr><tr><td> Kontrolle + Chloroquin </td><td> 1432 </td><td> 0,82 </td><td> 1.13 </td><td> 68,9 </Td&gt; <td> 19.5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> Verhungert </td><td> 1204 </td><td> 0,74 </td><td> 0.10 </td><td> 98.4 </td><td> 0,6 </td><td> 1,0 </td></tr><tr><td> Verhungert + Chloroquin </td><td> 1811 </td><td> 0,98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36,9 </td><td> 31.0 </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Zusammenfassung der Jurkat LC3 Spotzählung gegenüber BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Bivariate Plot

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Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Hier wurde die multispektrale bildgebende Durchflusszytometrie mit einem analytischen Merkmal, das helle Detailbilder von 3 Autophagie-Markern vergleicht und deren Co-Lokalisierung zusammen mit der LC3-Spotzählung quantifiziert, verwendet, um Autophagie objektiv, quantitativ und statistisch robust zu messen.

Assessing Autophagic Flux durch Messung von LC3, p62 und LAMP1 Co-Lokalisierung mittels Multispektral Imaging Flow Cytometry

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