Name: assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry
Uploaded: 2017-07-21T13:00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

אני רוצה להודות לעמיתים לעבודה במיליפור סיגמה, פיליפ ג &#39;מוריסי ושרי ל&#39;, על תמיכתם והדרכתם לאורך השנים. אני גם רוצה להודות Vidya Venkatachalam ו בריאן ר דוידסון על עזרתם עם תכונה BDC3 בתוכנה IDEAS , ראיין פ Jessup לעזרה בעריכת כתב היד הזה, ריימונד קונג לעזרה ביום הירי, תודה מיוחדת לך האמן סינתיה Xamonthiene.

<ol>
	<li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+should+autophagic+flux+be+assessed?.">Why should autophagic flux be assessed?.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).</li><li>Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+Autophagy.">LC3 and Autophagy.</a> Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).</li><li>Larsen, K. B., Lamark, T., &#216;vervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bj&#248;rk&#248;y, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reporter+cell+system+to+monitor+autophagy+based+on+p62/SQSTM1.">A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1.</a> Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).</li><li>Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+flow+cytometry+for+measurement+of+autophagy.">Applications of flow cytometry for measurement of autophagy.</a> Methods. 75, 87-95 (2015).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+mammalian+autophagy+research.">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).</li><li>Arsov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC-mediated+transgenic+expression+of+fluorescent+autophagic+protein+Beclin+1+reveals+a+role+for+Beclin+1+in+lymphocyte+development.">BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development.</a> Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).</li><li>Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+death+pathways+in+desmin-related+cardiomyopathy.">Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy.</a> Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).</li><li>Altman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+essential+to+suppress+cell+stress+and+to+allow+BCR-Abl-mediated+leukemogenesis.">Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis.</a> Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).</li><li>Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammaherpesvirus+68+infection+of+endothelial+cells+requires+both+host+autophagy+genes+and+viral+oncogenes+for+optimal+survival+and+persistence.">Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence.</a> J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).</li><li>Tra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+human+embryonic+stem+cells.">Autophagy in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li><li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1+targets+both+autophagy+and+apoptosis+pathways+in+pediatric+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).</li><li>Leveque-El Mouttie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+required+for+stem+cell+mobilization+by+G-CSF.">Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF.</a> Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).</li><li>Watson, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+limits+proliferation+and+glycolytic+metabolism+in+acute+myeloid+leukemia.">Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia.</a> Cell Death Discov. 1, 15008 (2015).</li><li>Stranks, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+Controls+Acquisition+of+Aging+Features+in+Macrophages.">Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages.</a> J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).</li><li>Clarke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+activated+in+systemic+lupus+erythematosus+and+required+for+plasmablast+development.">Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development.</a> Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).</li><li>Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+assays+for+the+study+of+autophagy.">Flow cytometric assays for the study of autophagy.</a> Methods. 82, 21-28 (2015).</li><li>Bj&#248;rk&#248;y, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62/SQSTM1+forms+protein+aggregates+degraded+by+autophagy+and+has+a+protective+effect+on+huntingtin-induced+cell+death.">p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death.</a> J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).</li><li>Phadwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+autophagy+detection+in+primary+cells:+Impaired+levels+of+macroautophagy+in+immunosenescent+T+cells.">A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells.</a> Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).</li><li>Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+autophagosomes+and+autolysosomes+in+cells+using+imaging+flow+cytometry.">Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).</li><li>Kwok, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HspB8+mutation+causing+hereditary+distal+motor+neuropathy+impairs+lysosomal+delivery+of+autophagosomes.">HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes.</a> J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).</li><li>Lopez-Herrera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleterious+Mutations+in+LRBA+Are+Associated+with+a+Syndrome+of+Immune+Deficiency+and+Autoimmunity.">Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity.</a> Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).</li><li>Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATF4+orchestrates+a+program+of+BH3-only+protein+expression+in+severe+hypoxia.">ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia.</a> Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).</li><li>Pike, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+up-regulation+of+ULK1+by+ATF4+contributes+to+cancer+cell+survival.">Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival.</a> Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).</li><li>Pugsley, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+autophagy:+Measuring+LC3+puncta+and+autolysosome+formation+in+cells+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry.</a> Methods. 112, 147-156 (2017).</li><li>IDEAS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2. , (2015).</li></ol>

אני מועסק על ידי MilliporeSigma, יצרנית של ImageStream המותג Amnis, אשר שימש במחקר זה.

בעת ביצוע ניתוח זה, יש כמה דברים לשקול. חשוב שיהיה דגימות בקרה מתאימות. עבור ניסוי זה, שני בקרות שונות שימשו: שליטה ובקרה + Chloroquine. מדגם הבקרה שימש לקביעת הסף עבור האזורים. הוא מייצג את רמת הבסיס של autophagy מבלי לעצור השפלה ליזוזומלית היא שליטה על המדגם מורעב. עם זאת, מדגם בקרה אינו שליטה נאותה להשוות עם התוצאות מדגם מורעב + כלורוקווין כי chloroquine עצמה משפיעה על מדגם שליטה. לכן, היה צורך להיות מדגם + כלורוקואין בקרה. לפני ביצוע כל ניתוח עבור autophagy, חשוב לנתח רק / שער על תאים בודדים ממוקדים ( כלומר, RMS שיפוע גדול מ -60), כמו התוצאות יכול להיות מושפע אם יש יותר מתא אחד או התמונות לא ממוקד. זה חיוני כי autophagosomEs ו lysosomes ממוקדים ספירת ספוט הנכון ניתוח BDC3. תאים אפופטוטיים יש להסיר לפני ניתוח autophagy, כפי שהם עשויים להטות תוצאות ולא צריך להיכלל. לא צריך להיות מכתים המתאים לכל שלושת הסמנים ( כלומר, LC3, p62, LAMP1). לדוגמה, כל שלושת הסמנים הם תאיים, ויש להם אות נקודתי; אם האות לא לדקלם, או אם הוא על פני השטח של התא, מכתים לא יהיה מתאים את הניסוי / מכתים צריך להיות משוחזר. בנוסף, עבור BDC3 להיות מדויק, זה חיוני השער על תאים בהירים עבור כל שלושה סמנים ניאון של עניין. Gating על אירועים חיוביים יש צורך למנוע את המדידה של BDC3 על שאינם ספציפיים מחייב, הדמיה artifacts, ו / או רעש. זה חיוני, כמו BDC3 יכול פוטנציאל להגביר artifacts שאינם אותות אמיתי. מאז BDC3 יכול להתבצע רק על אירועים חיוביים בהירים, תאים רבים עשויים שלא להיכלל בניתוח הסופי; זה especEly נכון לתאי בקרה שאין להם הצטברות של LC3, p62 ו / או LAMP1. לפיכך, הגבלה של assay זה הוא BDC3 רק בוחן תאים חיוביים עבור כל שלושת הסמנים, אשר עשוי שלא להיות מתאים לכל הניסויים autophagy. כמו BDS, אשר כבר דווחו בעבר 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , BDC3 לבדו אינו לוקח בחשבון את מספר האורגנים autophagy שיתוף מקומי, וכתוצאה מכך במידה רבה של השתנות במספר האוטופגוזומים. לכן, הגישה הדו-כיוונית שהציג ראג&#39;אן ואח &#39; היה מועסק. בהסתכלות על המגרשים הדו-פעמיים, אפשר לשאול אםהתאים חייבים להיות חיוביים עבור LC3, p62 ו- LAMP1; למה יש כל כך הרבה תאים שיש להם 0 נקודות? הסיבה לכך היא כי האות LC3 עשוי להיות בהיר מספיק עבור שיתוף לוקליזציה, אבל זה לא יכול לענות על סף שנקבע על ידי מסיכת שיא (שיא (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) זה נחוץ כדי להיחשב לְזַהוֹת. הפרוטוקול שהוצג כאן השתמשו MIFC לספור LC3 puncta ואת שיתוף לוקליזציה של שלושה סמנים autophagy למדוד שטף autophagic. בתנאים הבסיסיים (מדגם בקרה), מספר האוטופגוזומים היה נמוך, ומעטים נמצאו תאים עם &quot;נקודות גבוהות&quot;. עם תוספת של chloroquine, אשר מעכב היתוך אוטופאגוזום / lysosome, חלה עלייה במספר כתמים LC3. מאז lysosome אינו מסוגל לשבור את autophagosome ואת p62, אשר מתגורר autophagosome, זה מוביל לעלייה של לוקליזציה של LC3, p62, ו LAMP1 autolysosome הצטברות. השפעה זו היתה מוגברת תחת starvat מזיןיון, אשר גורם autophagy. עם זאת, ללא תוספת של chloroquine, לא היה גידול משמעותי במספר autophagosomes, ככל הנראה בשל עלייה בשיעור של autophagic מחזור. כאשר התאים רעבו בנוכחות כלורוקין, חלה עלייה בלוקליזציה המשותפת ובמספר האוטופגוזומים, התומכת במסקנה שהרעבה מגבירה את השטף האוטופאגי. EBSS ידוע כגורם חזק של autophagy. לכן, צפוי כי הגידול יהיה גדול. אם שיטה אחרת, כגון אינדוקציה של סמים, משמשת להפקת אוטופאגי, ההבדל בין הדגימה לשליטה והדגימה עשוי להיות מתוחכם יותר. פרוטוקול מסוים זה נועד למדוד autophagy שורות תאים אנושיים, אבל assay יכול להיות מותאם למינים אחרים על ידי מעבר נוגדנים עבור מינים מסוימים. בנוסף, שיטת הניתוח יכול לשמש עבור כל יישום תאיים הדורש שיתוף לוקליזציהשל שלושה בדיקות / סמנים.

Macroautophagy, המכונה להלן autophagy, הוא מסלול קטבולית שבה רכיבים פגומים או מתפקדת, חלבונים ארוכי טווח, ואת האברונים מושפלים באמצעות lysosome ו ממוחזרים 1 . Autophagy הוא תהליך דינמי, רב-כיווני הכולל את היווצרותו של אוטופגוזום; את ההיתוך של האוטופגוזום עם הליזוזום, שיצר את האוטוליזוסום; ואת השפלה של התוכן של autolysosome 2 . סמן ביולוגי חיוני המשמש לזיהוי autophagy במערכות יונקים הוא חלבון המשויך microtubule 1A / 1B-Light שרשרת 3 (LC3), המהווה את הממברנה האוטופאגוסומלית. במהלך autophagy, cytosolic LC3-1 הוא מצומדות כדי phosphatidylethanolamine כדי ליצור LC3-II; LC3-II משולב אז לתוך קרום autophagosal 3 . סמן נוסף בשימוש נרחב עבור השטף autophagic הוא autophagy receptor sequestosome 1 (SQSTM1, p62) אשר פיזית liמטען אוטופאגית אל הממברנה האוטופאטית 4 , 5 . שיטות אשר שימשו באופן מסורתי למדוד autophagy הם כתמים המערבי מיקרוסקופ פלואורסצנטי 7 . עם זאת, אף אחת משיטות אלה נחשבים &quot;תקן הזהב&quot; , 2 , 6 כמו ישנם אתגרים הקשורים בשתי הטכניקות הללו. כתמים מערביים נותנים רק בממוצע משום שהם משתמשים במדגם הומוגני, כך שצופים לא יכולים לראות מה קורה בתאים בודדים. מצד שני, מיקרוסקופ פלואורסצנטי נותן מידע צופה ברמה אחת התא, אבל זה חסר יכולות התפוקה, מה שהופך אותו קשה להשיג אובייקטיבי הערכות סטטיסטית קפדנית. בשנים האחרונות, את המדידה של LC3 ו p62 על ידי cytometry זרימת multispectral הדמיה (MIFC, ראה טבלה של חומרים ) כבר צובר popuLarity בשל כוח כמותי, יכולות תפוקה גבוהה, פוטנציאל ריבוב, ואת היכולת התמונה כל תא. אחת השיטות הנפוצות ביותר למדידת autophagy באמצעות MIFC, יחד עם תוכנת ניתוח לוויה שלה (ראה טבלה של חומרים ), היא באמצעות ספירת ספוט של LC3 puncta או autophagosomes 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . עם זאת, עלייה autophagosomes לא בהכרח אומר כי קיימת עלייה autophagy, כפי שהוא יכול גם לייצג המצור בתהליך 2 . מחזור LC3-II הוא פרמטר שימושי למדוד שטף autophagic על ידי ניתוח תאים בנוכחות והיעדר מעכב השפלה ליזוזומלית, כגון כלורוקין. Chloroquine מעכב את היתוך של autophagosome כדי lysosome, ובכך לאפשר את quantitation של היווצרות autophagosome כמדד של מידת autophagy על ידי עצירת השטף autophagic לפני השפלה lysosomal יכול להתרחש 18 . בנוסף, p62 הוא מושפל בעיקר על ידי autophagy, ואם השפלה ליזוזומלית של autophagosome ותכולתו חסומה, הצטברות של p62 צפוי 17 , 19 . Autophagy הוא תהליך multistep, ואת המדידה של LC3 או p62 לבד אינו מספק תמונה מלאה של מה שקורה בתאים. פרסומים אחרונים הדגישו את הצורך לבחון את התהוות בו זמנית של autolysosome 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC הואבאופן ייחודי מסוגלים למדוד את ההיווצרות של autolysosome ידי הדמית שיתוף הלוקליזציה של autophagosome אל 15 הליזוזום - 17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. בנוסף, שיתוף לוקליזציה של p62 ו LC3 באמצעות MIFC יש גם נחקרו למדוד שטף autophagic 5 . בתוכנה ניתוח הפניה, &quot;תכונה&quot; זה מודד שיתוף לוקליזציה נקרא &quot;פרט מפורטת הדמיון R3&quot; (BDS) ו תוכנן במיוחד כדי להשוות את הפרטים הקטנים, התמונה בהירים של שתי תמונות. BDS הוא מקדם המתאם של Pearson המתאם ביומן של נקודות האור המצויות עם רדיוס של 3 פיקסלים או פחות; במילים אחרות, BDS מחשבת את מידת oוריקלינג פיקסלים משני ערוצי ניאון שונים. נקודות האור הן מתואמות ( כלומר, מיקום מרחבי זהה) או בלתי מתואמות ( כלומר, מיקומים מרחביים שונים). לכן, מקדם המתאם משתנה בין 0 (לא מתואם) לבין 1 (קורלציה מושלמת). מקדם הוא יומן- transformed כדי להגדיל את טווח בין אפס לאינסוף 26 , 27 . BDS לבדה לא יכול להיות מספיק; Rajan et al. נמצא כי שימוש רק BDS יכול להוביל לתוצאות חיוביות שגויות או שגויות שלילי 21 . BDS מעריך את שיתוף לוקליזציה של שני סמנים של autophagy אבל לא מחשיב את מספר autophagosomes. כדי להסביר את מספר autophagosomes, Rajan et al. כללה ספירת ספוט של LC3 puncta 21 . Rajan et al. המוצע באמצעות פיזור bivariate העלילה של ספירה LC3 ספוט לעומת BDS. באמצעות העלילה דו-שנתית זו, שתי אוכלוסיותE מזוהה הראשון: אחד עם תאים בעלי רמה גבוהה של כתמים LC3 ואחד עם תאים בעלי רמה נמוכה של כתמים LC3. אוכלוסיית הנקודה הגבוהה של LC3 סווגה לשתי אוכלוסיות: תאים עם לוקליזציה משותפת נמוכה ( כלומר, הצטברות של אוטופגוזומים) ותאים בעלי לוקליזציה גבוהה ( כלומר, הצטברות של אוטוליזוזומים). זו העלילה bivariate מאפשר להבחין בין תאים עם מעט מאוד autophagosoms ותאים עם הצטברות של autophagosomes ו / או autolysosomes 21 . עד כה, לוקליזציה משותפת של LC3, p62, LAMP1 (סמן lysosomal) לא היה אפשרי באמצעות &quot;סוג תכונה&quot; יחיד בתוכנת ניתוח לוויה MIFC (ראה טבלה של חומרים ). עם זאת, תכונה חדשה, הציג לאחרונה בגירסה 6.1, נקרא Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 משווה את התמונות פירוט בהיר מכל אחת משלוש התמונות (במקרה זה, LC3, p62, ו LAMP1) וכימות co-localization של שלושה בדיקות ( כלומר, LC3, p62, LAMP1). תכונה BDC3 מחשב את מקדם המתאם של פירסון שונה כדי להאריך עד שלוש תמונות. מאחר והנקודות הבהירות בשלוש התמונות הן מתואמות או בלתי מתואמות, מקדם המתאם משתנה בין 0 (לא מתואם) לבין 1 (קורלציה מושלמת). מקדם הוא יומן- transformed כדי להגדיל את טווח דינמי בין 0 ו אינסוף. על ידי החלפת תכונה BDS עם תכונה BDC3, שיטת הניתוח שהוצגו על ידי Rajan et al. יכול כעת לשלב את שלושת הסמנים המשמשים ביותר למדוד autophagy במערכת אחת בעת ובעונה אחת. היכולת co-localize אלה שלושה סמנים של autophagy ב assay אחד יכול להוביל תובנות הרומן לתוך אינדוקציה ו הרגולציה של autophagy. הפרוטוקול הבא מתאר את השלבים כדי לגרום autophagy בתאי Jurkat; תווית התאים עם LC3, p62, ו LAMP1 נוגדנים; לרכוש נתונים על multispEctral זרימת הדמיה cytometer; ולנתח את הנתונים כדי להעריך שטף autophagic.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1012">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:244px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">352096</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;">AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31571</td>
			<td style="width:299px;">Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:308px;">anti-human CD107a-PE (LAMP1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328607</td>
			<td style="width:299px;">Clone H4A3. Concentration 400 &#181;g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;">anti-human CD45- AF488</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304017</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">anti-human CD45- PE&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304008</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30.&#160; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;">anti-human CD45-AF647&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304018</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30.&#160; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12</td>
			<td>MBL International Corporation</td>
			<td>M152-3</td>
			<td style="width:299px;">Clone 4E+12.&#160; Concentration 2 mg/mL.&#160; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab185015</td>
			<td style="width:299px;">Clone EPR4844.&#160; Concentration 0.5 mg/mL.&#160; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Chloroquine diphosphate Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6628-25G</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">DAPI Stain 5mg/mL</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>508741</td>
			<td style="width:299px;">http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:308px;">Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1.3704</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10X</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-2010-B</td>
			<td style="width:299px;">&#160;Ca++Mg++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">PBS Ca++Mg++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Earle&#39;s Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14155</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="241">
			<td height="241" style="height:241px;width:308px;">Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td style="width:299px;">This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td style="width:299px;">https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="201">
			<td height="201" style="height:201px;width:308px;">MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">MIFC analysis software - IDEAS 6.2</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).&#160; IDEAS version 6.2</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328608</td>
			<td style="width:299px;">http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30082.1</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:299px;">You can use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RPMI-1640 Medium 1X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Sheath - PBS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td style="width:299px;">Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Sodium Pyruvate solution (100mM)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30239.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td style="width:299px;">This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:308px;">System Calibration Reagent - SpeedBead</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>400041</td>
			<td style="width:299px;">Each tube holds ~10 mL.&#160; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>648463-50ML</td>
			<td style="width:299px;">http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Water, Cell Culture Grade&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry

Autophagy הוא מסלול קטבולית שבה רכיבים סלולריים נורמלי או מתפקדת כי לצבור במהלך הצמיחה והבחנה מושפלות באמצעות lysosome ו ממוחזרים. במהלך autophagy, חלבון LC3 cytoplasmic הוא lipidated וגויסו את הממברנות האוטופאגוסומליות. האוטופאגוזום מתמזג עם הליזוזום כדי ליצור את האוטוליזוזום, שם מתרחש התמוטטות שלפוחית ​​האוטופגוזום ותכולתו. חלבון ה- p62 הקשור ל- Ubiquitin, אשר נקשר ל- LC3, משמש גם לניטור השטף האוטופאגי. תאים שעוברים autophagy צריך להדגים את שיתוף לוקליזציה של p62, LC3, ו lysosomal סמנים. מיקרוסקופיה Immunofluorescence נעשה שימוש כדי לזהות חזותית LC3 puncta, p62, ו / או lysosomes על בסיס לכל תא. עם זאת, הערכה אובייקטיבית וסטטיסטית קפדנית יכול להיות קשה להשיג. כדי להתגבר על בעיות אלה, cytometry זרימת multispectral הדמיה שימש יחד עם תכונה אנליטית שמשווה את דה בהירהזנב תמונות של שלושה סמנים autophagy (LC3, p62 ו lysosomal LAMP1) ו לכמת שלהם שיתוף לוקליזציה, בשילוב עם ספירה LC3 ספירת למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית.

שיטה זו ניתוח משתמשת תכונות מרובות כדי התחת השטף autophagic. על מנת להבין את המגרש הדו-שנתי הסופי, יש לבחון תחילה את מאפייני הניתוח האינדיבידואליים. ספירת האוטופגוזומים היא דרך הגיונית למדידת אוטופאגי; עם זאת, גודל / צורה / בהירות של LC3 puncta יכול להשתנות באופן דרסטי בין תאים. וריאציה יכולה להקשות על ספירת האוטופגוזומים באופן ידני או באמצעות תכונה ספירת ספוט בתוכנת הניתוח. לכן, לא תכונה ספירת ספוט יהיה מושלם בשל השתנות זו גדולה autophagosomes. עם זאת, תכונה טובה ספירת נקודה יעבוד על רוב התאים 26 . איור 3 מציג דוגמאות של מסיכה ספוט של LC3 puncta בתאי Jurkat באמצעות מסכות ספוט שונים. התכונה ספירת ספוט שנבחרה עבור ערכת נתונים זו היא ספוט ספירת_מספר (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, כלומר התכונה ספירת ספירה ספרה את הנקודות שבהןAk מסומנת במסך ברירת המחדל של ערוץ 11 (M11) בערוץ 11 (Ch11-LC3-AF647) עם יחס רקע ל-תא של 4 (Bright, 4). איור 4 מציג ספירה ספירת היסטוגרמות ותמונות נציג עבור ספוט נקודה ממוצע של שליטה, שליטה + כלורוקווין, מורעב, מורעב + תאים כלורוקין Jurkat שכותרתו אנטי LC3-AF647. שליטה ומורעבת ספירת ספירת ממוצע אינם שונים באופן משמעותי; עם תוספת של chloroquine, יש הבדל גדול בממוצע של כלורוקין + שליטה לעומת כלורוקין מורעב +. התכונה הבאה לחקור היא BDC3. BDC3 הוא מדידה של שיתוף לוקליזציה של שלושה סמנים / בדיקות, במקרה זה, LC3, p62, ו LAMP1. איור 5A - 5D מציג היסטוגרמות BDC3 עבור שליטה, שליטה + כלורוקווין, מורעב, מורעב + תאים כלורוקווין Jurkat שכותרתו עם אנטי p62-AF488, אנטי LAMP1-PE, ו אנטי LC3-AF647. יש מעבר בין ממוצע שליטה לממוצע מורעב, כמו גם את השליטה + Chloroquine מתכוון למוות מורעב Chloroquine. עם זאת, מסתכל על התמונות של תאים מן הציונים BDC3 ממוצע בתרשים 5E - 5H , יש הבדל גדול יותר בין דגימות מאשר היסטוגרמות עשוי להוביל אחד להאמין. הסיבה לכך היא כי BDC3 אינו מחשיב את מספר האורגנים autophagy שיתוף מקומי, וכתוצאה מכך מידה רבה של השתנות במספר autophagosomes עבור ציון BDC3 אותו. ברוב המקרים, יש חפיפה בין כל שלושת הבדיקות, כי גם ברמות הבסיסיות, p62, LAMP1 ו- LC3 צריכים, במידה מסוימת, לשתף-מקום או להתגורר באזורים דומים בתאים. בניגוד לכך, דוגמה של שלושה בדיקות כי לא צריך שיתוף לוקליזציה הם אנטי p62-AF488, אנטי LC3-AF647, צבע DAPI גרעיני עבור מדגם מורעב + Chloroquine, שמוצג באיור 6. &lt;<html> / P&gt; כאשר תכונה ספירת ספוט התכונה BDC3 משולבים, נוכחות של subpopulations שונים המשפרים את היכולת להבחין בין הדוגמאות / התנאים השונים ניכרים. איור 7 מציג את חלקה דו-ספרתית של ספירת ספוט של LC3 לעומת BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 עבור ארבעת הדגימות: בקרה, בקרה + כלורוקין, מורעבים, מורעבים + כלורוקין. מדגם הבקרה שימש כדי לקבוע את אסטרטגיית gating עבור שלוש אוכלוסיות: נקודות נמוכה, נקודות גבוהות / נמוך BDC3, ו גבוה כתמים / גבוהה BDC3. הדגימות בקרה הראו כי יותר מ 98% של תאים היו 1 או פחות כתמים. הגבול בין הנקודות הגבוהות / נמוך BDC3 ו גבוה כתמים / גבוה BDC3 נקבעה ציון BDC3 של 1 כי יותר מ 91% של מדגם בקרה היה ציון BDC3 פחות מ 1. סיכום של התוצאות עבור bivariate מגרשים מוצג בטבלה 1 . <html> גיל = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> איור 1: MIFC הגדרת מכשיר. צילום מסך של הגדרות מכשיר MIFC המשמש לניסוי זה, המתואר בשלב 8 של הפרוטוקול. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> איור 2: ניתוח תוכנה Gating אסטרטגיה. צילום מסך של תוכנת ניתוח gating התוכנית, המתואר בשלב 9 של הפרוטוקול. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> 10&quot;ג them/ /&gt; איור 3: LC3 מסכת ספוט. Jurkat תא תמונות ומסיכות השתמשו כדי ליצור את ספירת ספירת תכונה. מודגשים (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), שיא (M11, Ch11-LC3-AF647) , מוארת, 5), ספוט (M11, Ch11-LC3-AF647, מוארת, 5,3,1), ספוט (M11, Ch11-LC3-AF647, מוארת, 6,2,1). המסכה שעבדה הכי טוב עבור כל התאים המוצגים היה שיא (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> איור 4: LC3 ספירת ספירת היסטוגרמות. באמצעות ספירת ספוט תכונה ספוט Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 ו LC3-AF647 ספוט ספירת היסטוגרמות עבור בקרה ( A , כחול בהיר), שליטה + ChloroquinE ( B , כחול), מורעב ( C , ורוד), מורעב + Chloroquine ( D , אדום). ספירת הנקודות הממוצעת עבור בקרה, בקרה + כלורוקין, מורעב, מורעב + כלורוקואין הם 0.07, 1.13, 0.10, 2.77, בהתאמה. BF, LC3-AF647 (אדום), צבע DAPI גרעיני (כחול), וכן מורכב של LC3-AF647 ו תמונות DAPI של תאים נציג עבור ספוט נקודה ממוצע מוצגים עבור בקרה ( E , 0 כתמים), שליטה + Chloroquine ( F , 1 נקודה), מורעב ( G , 0 כתמים), מורעב + Chloroquine ( H , 3 כתמים). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> איור 5: היסטוגרמות BDC3 של p62 / LAMP1 / LC3. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 היסטוגרמות עבורR שליטה ( A , כחול בהיר), שליטה + Chloroquine ( B , כחול), מורעב ( C , ורוד), מורעב + Chloroquine ( D , אדום). ציון BDC3 הממוצע עבור בקרה, בקרה + כלורוקין, מורעב, מורעב + כלורוקווין הם 0.57, 0.82, 0.74, ו 0.98, בהתאמה. BF; P62-AF488 (ירוק); LAMP1-PE (צהוב); LC3-AF647 (אדום); ו - Composite של P62-AF488, LAMP1-PE, ו LC3-AF647 תמונות של תאים נציג של BDC3 הממוצע מוצגים שליטה ( E ), שליטה + כלורוקווין ( F ), מורעב ( G ), מורעב + כלורוקווין H). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> איור 6: היסטוגרמות BDC3 של p62 / LC3 / DAPI עבור מדגם מורעב + Chloroquine. ( A ) BDC3 p62 / LC3 / DAPI היסטוגרמה עבור מדגם מורעב + Chloroquine מוצג. הציון הממוצע של BDC3 הוא 0.07. ( B ) BF; P62-AF488 (ירוק); LC3-AF647 (אדום); DAPI (כחול); ואת מורכב של P62-AF488, LC3-AF647, ותמונות DAPI של תאים נציג עבור BDC3 הממוצע מוצג עבור מדגם מורעב + Chloroquine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> איור 7: מגרשים דו-ספריים של LC3 ספוט לעומת BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( א ) חלקות Bivariate של ספירה LC3 ספוט לעומת BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 לבקרה, שליטה + כלורוקווין, מורעבים, מורעבים + כלורוקווין תאים Jurkat. ( B ) BF; P62-AF488 (ירוק); LAMP1-PE (צהוב); LC3-AF647 (אדום); ואת מרוכבים של p62-AF488, LAMP1-PE, ו LC3-AF647 תמונות משלושה אזורים ( כלומר, נמוך כתמים, כתמים גבוהים / נמוכה BDC3, גבוה כתמים / גבוה BDC3) מוצגים עבור מדגם מורעב + Chloroquine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> ספירת תאים </td><td> מוארת פירוט קולוקליזציה 3 ממוצע </td><td> ספירת ספוט LC3 ממוצע </td><td> נמוך נקודה </td><td> נקודה גבוהה / נמוכה BDC3 </td><td> נקודה גבוהה / גבוהה BDC3 </td></tr><tr><td> לִשְׁלוֹט </td><td> 439 </td><td> 0.57 </td><td> 0.07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0.0 </td></tr><tr><td> שליטה + כלורוקין </td><td> 1432 </td><td> 0.82 </td><td> 1.13 </td><td> 68.9 </Td&gt; <td> 19.5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> מוּרעָב </td><td> 1204 </td><td> 0.74 </td><td> 0.10 </td><td> 98.4 </td><td> 0.6 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> מורעבים + כלורוקין </td><td> 1811 </td><td> 0.98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36.9 </td><td> 31.0 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: סיכום Jorkat LC3 ספוט ספוט לעומת BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 חלקת Bivariate

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

הנה, cytometry זרימת multispectral הדמיה עם תכונה אנליטית שמשווה תמונות פירוט בהיר של 3 סמנים autophagy ו quantifies שיתוף שלהם לוקליזציה, יחד עם ספירת LC3 ספוט, שימש למדוד autophagy באופן אובייקטיבי, כמותי, סטטיסטית וחסכונית.

הערכת השטף autofagic ידי מדידת LC3, p62, ו LAMP1 Co-localization באמצעות multispectral הדמיה cytometry

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Research

JoVE Journal

Biology

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

IP-FCM: immunoprecipitation זוהה על ידי זרימת cytometry

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

מדידה כמותית של טרנסלוקציה GLUT4 על קרום התא על ידי זרימת cytometry

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Cytometry זרימה טיהור תאים עכבר meiotic

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

מדידת מחזור התא קינטיקס התקדמות עם סימון מטבוליות cytometry זרימה

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

אופטימיזציה שיטות דוגמנות מכתימה והפצת נשק לניטור חלוקת תא באמצעות צבעי מעקב סלולרי

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

מדידת תאיים Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; שינויים בזרע אנושי באמצעות ארבע טכניקות: fluorometry הקונבנציונלי, הפסיק fluorometry זרימה, cytometry זרימה והדמיה תא יחיד

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

זיהוי של subpopulation מועשר Murine Erythroblast באירועי Enucleating ידי Multi-רפאים הדמיה תזרים cytometry

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

במעקב 4 ממדי Vivo של תאי גזע ואבות היווצרות דם במבוגרי עכבר calvarial מח עצם

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

מדידות סידן cytosolic בתאי האפיתל כליות על ידי cytometry הזרימה

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...