Name: assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry
Uploaded: 2017-07-21T13:00:00
Duration: 11 min 39 s
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私はMilliporeSigma、Philip J. Morrissey、Sherree L. Friendの同僚に長年の支持と指導をしてくれたことに感謝したいと思います。私はまた、IDEASソフトウェアのBDC3機能、 Ryan P. Jessup、この原稿の編集を手伝ってくれたVidya VenkatachalamとBryan R Davidsonに感謝します。撮影当日のRaymond Kongと特別感謝します。メイクアップアーティストCynthia Xamonthiene。

<ol>
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私はこの研究で使用されたAmnisブランドImageStreamの製造元であるMilliporeSigmaに雇われています。

この分析を行う際には、考慮すべき点がいくつかあります。適切な対照試料を有することが重要である。この実験のために、2つの異なる対照、すなわち対照および対照+クロロキンを使用した。対照試料を用いて領域の閾値を設定した。それはリソソーム分解を止めることなくオートファジーの基礎レベルを表し、飢餓状態のサンプルのコントロールです。しかし、対照サンプルは、クロロキン自体がコントロールサンプルに影響を及ぼすため、Starved + Chloroquineサンプルの結果と比較するのに適切なコントロールではありません。したがって、Control + Chloroquineサンプルが必要でした。 オートファジーの分析を行う前に、複数のセルが存在する場合、結果が影響を受ける可能性があるため、フォーカスされている単一セル（ つまり、 60以上の勾配RMS）のみを分析/ゲートすることが重要です。焦点が外れている。自食作用が重要であるesおよびリソソームは、適切なスポット計数およびBDC3分析のために焦点を合わせている。アポトーシス細胞は、オートファジー分析に先立って除去されなければならない。なぜなら、それらは結果を歪曲し、含まれてはならないからである。すべての3つのマーカー（ すなわち、LC3、P62、およびLAMP-1）のための適切な染色があるはずです。例えば、3つのマーカーはすべて細胞内であり、点状のシグナルを有するべきである。シグナルが点状でない場合、または細胞の表面上にある場合、染色は適切ではなく、実験/染色は再度行わなければならない。さらに、BDC3が正確であるためには、関心のある3つの蛍光マーカーすべてについて明るい細胞をゲートすることが不可欠である。非特異的結合、画像化アーチファクト、および/またはノイズに対するBDC3の測定を防止するためには、陽性事象に対するゲーティングが必要である。これは、BDC3が真の信号ではないアーチファクトを増幅する可能性があるため、非常に重要です。 BDC3は明るい陽性事象に対してのみ実施することができるので、多くの細胞は最終分析に含まれないことがある。これは特にLC3、p62、および/またはLAMP1の蓄積を全く有さない対照細胞については真実である。したがって、このアッセイの限界は、BDC3が、すべてのオートファジー実験に適切ではない可能性がある3つのマーカー全てに対して陽性である細胞のみを調べることである。 先に単独でBDC3が大きく、その結果、アカウントに共局在オートファジー細胞小器官の数を取らない15、16、17、20、21、22、23、24、25、26、報告されているBDS、等オートファゴソームの数の変動の可能性がある。したがって、Rajan らによって提示された二変量のアプローチは、を採用した。二変量プロットを見ると、細胞はLC3、p62およびLAMP1に対して陽性でなければならない。どうしてそんなにたくさんの細胞があり、0のスポットがあるのですか？これは、LC3信号が共局在化に十分明るい可能性があるため、ピークマスク（ピーク（M11、Ch11-LC3-AF647、Bright、4））によって設定されたしきい値を満たさない可能性があるスポット。 ここに提示されたプロトコールは、LC3涙点数をカウントするためにMIFCを用い、自食流束を測定するために3つのオートファジーマーカーの共局在化を用いた。基底状態（対照試料）では、自己好塩基球の数は少なく、「ハイスポット」ではほとんど検出されなかった。オートファゴソーム/リソソーム融合を阻害するクロロキンの添加により、LC3スポットの数が増加した。リソソームは、オートファゴソームおよびオートファゴソームに存在するp62を分解することができないので、LC3、p62およびLAMP1自己リゾソーム蓄積の共局在が増加する。この効果は、栄養のあるスターバットイオン、これはオートファジーを誘発する。しかし、クロロキンの添加がなければ、自己食作用の回転数の増加による可能性が最も高い、自己食作用の数の有意な増加はなかった。細胞がクロロキンの存在下で飢餓状態になると、共局在化および自己貪食細胞数が増加し、飢餓が自食性流動を増加させるという結論を支持する。 EBSSは強力なオートファジーの誘導物質として知られています。したがって、その増加は大きくなると予想される。薬物誘導のような別の方法を用いてオートファジーを誘導する場合、コントロールサンプルと処理サンプルとの差異は微妙である可能性がある。 この特定のプロトコールは、ヒト細胞株におけるオートファジーを測定するために設計されたが、アッセイは、その特定の種の抗体に切り替えることによって、他の種に適合させることができる。さらに、分析方法は、共局在化を必要とする任意の細胞内適用3つのプローブ/マーカーからなる。

以下ではオートファジーと呼ばれるマクロオートファジーは、損傷または機能不全の成分、長命のタンパク質、およびオルガネラがリソソームを介して分解され 、リサイクルされる異化経路である1 。オートファジーは、オートファゴソームの形成を伴うダイナミックな多段階プロセスである。オートファゴソームとリソソームとの融合、オートリゾソームの形成、および自己オリゴソーム2の内容物の分解が含まれる。哺乳類の系でオートファジーを同定するために使用される重要な生物学的マーカーは、オートファゴソーム膜を構成する微小管関連タンパク質1A / 1B-軽鎖3（LC3）である。オートファジーの間、サイトゾルLC3-1はホスファチジルエタノールアミンにコンジュゲートしてLC3-IIを形成する;次いで、LC3-IIは、自己貪食膜3に取り込まれる。自食性フラックスのためのもう1つの広く使用されるマーカーは、物理的にliであるオ​​ートファジー受容体配列sequestome 1（SQSTM1、p62）オートファジー膜4、5 NKSオートファジー貨物。 伝統的にオートファジーを測定するために使用されてきた方法は、ウェスタンブロットと蛍光顕微鏡です7 。しかし、これらの方法のいずれもがこれらの技術の両方に関連する課題があるとして「ゴールドスタンダード」、2、6であると考えられています。ウエスタンブロットはホモジネートサンプルを使用しているため平均値しか得られないため、観察者は個々の細胞で何が起こっているかを見ることができません。一方、蛍光顕微鏡法は、単一細胞レベルで観察者に情報を与えるが、スループット能力に欠け、客観的かつ統計的に厳密な評価を得ることが困難である。近年、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリー（MIFC、 Table of Materialsを参照）によるLC3およびp62の測定は、定量能力、ハイスループット能力、多重化可能性、すべての細胞を画像化する能力による稀少性があります。 （ 材料の表を参照）、そのコンパニオン解析ソフトウェアと共に、MIFCを使用してオートファジーを測定するために最も広く用いられる方法の一つは、LC3の涙点またはオートファゴソーム8、9、10、11、12、13、14のスポットカウントを介するものです、15、16、17。しかし、オートファゴソームの増加は、オートファジーの増加が必ずしも起こるわけではありません。これは、プロセス2の封鎖にもなる可能性があるためです。 LC3-IIの代謝回転は、細胞の存在下および非存在下で細胞を分析することによって自食流を測定するための有用なパラメーターであり、クロロキンのようなリソソーム分解阻害剤が存在しない。クロロキンは、それによって18を発生する可能性がリソソーム分解の前にオートファジーフラックスを阻止することにより、オートファジーの程度の尺度としてオートファゴソーム形成の定量化を可能にする、リソソームにオートファゴソームの融合を阻害します。また、P62は、主にオートファジーによって分解され、オートファゴソームとその内容のリソソーム分解がブロックされている場合、P62の蓄積は、17、19を期待されています。 オートファジーは多段階のプロセスであり、LC3またはp62の測定だけでは、細胞内で何が起きているのかを完全に把握することはできません。最近の刊行物はautolysosome 2、17、20、21の同時形成を検討する必要性を強調してきました。 MIFCは17、20、21、22、23、24、25、26 - 15リソソームにオートファゴソームの共局在を撮像しautolysosomeの形成を測定する一意できます。さらに、MIFCを用いたp62とLC3の共局在化もまた、自食流束5を測定するために検討されている。参照される分析ソフトウェアでは、共配置を測定する「特徴」は「明細部類似性​​R3」（BDS）と呼ばれ、2つの画像の小さくて明るい画像の詳細を比較するように特別に設計されている。 BDSは、3ピクセル以下の半径を有する局所化された輝点の対数変換されたピアソンの相関係数である。言い換えると、BDSは、2つの異なる蛍光チャネルからのピクセルのバーリング。輝点は、相関している（ すなわち、同じ空間的位置）か、相関していない（ すなわち、異なる空間的位置）かのいずれかである。したがって、相関係数は0（無相関）と1（完全相関）との間で変化する。係数がゼロと無限大26、27との間の範囲を増加させるために対数変換です。 BDSだけでは十分ではないかもしれません。 Rajan et al。 BDSのみを使用すると、偽陽性または偽陰性の結果につながる可能性があることが判明した21 。 BDSは、オートファジーの2つのマーカーの共局在を評価するが、オートファゴソームの数は考慮しない。オートファゴソームの数を説明するために、Rajan et al。 LC3穿刺21のスポットカウントを含む。 Rajan et al。 BDSに対するLC3スポットカウントの二変量散布プロットを使用して提案された。この二変量プロットを使用して、2つの集団最初に同定されたもの：高レベルのLC3スポットを有する細胞を有するもの、および低レベルのLC3スポットを有する細胞を有するもの。高LC3スポット集団は、低い共局在（ すなわち、自己好中球の蓄積）細胞および高い共局在（ すなわち、自己リソソームの蓄積）を有する細胞という2つの集団にさらに分類された。この二変量プロットは、ごく少数のオートファゴソームを有する細胞と、オートファゴソームおよび/または自己リソソームを蓄積する細胞を区別することを可能にする21 。 今まで、MIFCコンパニオン解析ソフトウェア（ 表の表を参照）の単一の「フィーチャタイプ」を使用して、LC3、p62、およびLAMP1（リソソームマーカー）の同時共局在化は不可能でした。しかし、バージョン6.1で最近導入された新機能は、Bright Detail Colocalization 3（BDC3）と呼ばれています。 BDC3は、3つの画像のそれぞれからの明るいディテール画像（この場合、LC3つのプローブ（ すなわち、 LC3、p62、およびLAMP1）の共局在を定量する。 BDC3機能は、3つの画像に拡張されるように修正されたピアソンの相関係数を計算します。 3つの画像の輝点は相関しているか相関していないので、相関係数は0（無相関）と1（完全相関）の間で変化する。係数は、0と無限大の間のダイナミックレンジを増加させるために対数変換されます。 BDC3フィーチャを使用してBDSフィーチャを切り替えることにより、Rajan らが提示した解析方法1つのシステムで同時にオートファジーを測定するために3つの最も使用されるマーカーを組み込むことができます。オートファジーのこれらの3つのマーカーを単一アッセイで共局在させる能力は、オートファジーの誘導および調節に対する新規な洞察につながる可能性がある。以下のプロトコールは、Jurkat細胞においてオートファジーを誘導するステップを概説する。細胞をLC3、p62、およびLAMP1抗体で標識する;マルチスピスでデータを取得する外部イメージングフローサイトメーター;自食流束を評価するためにデータを分析する。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1012">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:244px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">352096</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;">AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31571</td>
			<td style="width:299px;">Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:308px;">anti-human CD107a-PE (LAMP1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328607</td>
			<td style="width:299px;">Clone H4A3. Concentration 400 &#181;g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;">anti-human CD45- AF488</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304017</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">anti-human CD45- PE&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304008</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30.&#160; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;">anti-human CD45-AF647&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304018</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30.&#160; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12</td>
			<td>MBL International Corporation</td>
			<td>M152-3</td>
			<td style="width:299px;">Clone 4E+12.&#160; Concentration 2 mg/mL.&#160; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab185015</td>
			<td style="width:299px;">Clone EPR4844.&#160; Concentration 0.5 mg/mL.&#160; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Chloroquine diphosphate Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6628-25G</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">DAPI Stain 5mg/mL</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>508741</td>
			<td style="width:299px;">http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:308px;">Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1.3704</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10X</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-2010-B</td>
			<td style="width:299px;">&#160;Ca++Mg++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">PBS Ca++Mg++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Earle&#39;s Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14155</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="241">
			<td height="241" style="height:241px;width:308px;">Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td style="width:299px;">This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td style="width:299px;">https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="201">
			<td height="201" style="height:201px;width:308px;">MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">MIFC analysis software - IDEAS 6.2</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).&#160; IDEAS version 6.2</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328608</td>
			<td style="width:299px;">http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30082.1</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:299px;">You can use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RPMI-1640 Medium 1X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Sheath - PBS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td style="width:299px;">Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Sodium Pyruvate solution (100mM)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30239.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td style="width:299px;">This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:308px;">System Calibration Reagent - SpeedBead</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>400041</td>
			<td style="width:299px;">Each tube holds ~10 mL.&#160; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>648463-50ML</td>
			<td style="width:299px;">http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Water, Cell Culture Grade&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry

オートファジーは、成長および分化中に蓄積する正常または機能不全の細胞成分がリソソームを介して分解され、リサイクルされる異化経路である。オートファジーの間、細胞質LC3タンパク質は脂質化され、オートファゴソーム膜に補充される。次いで、オートファゴソームはリソソームと融合してオートリゾソームを形成し、オートファゴソームベシクルおよびその内容物の分解が起こる。 LC3に結合するユビキチン関連タンパク質p62もまた、自食性の流れをモニターするために使用される。オートファジーを受けている細胞は、p62、LC3、およびリソソームマーカーの共局在を示すはずである。免疫蛍光顕微鏡法は、細胞ごとにLC3涙点、p62および/またはリソソームを視覚的に同定するために用いられてきた。しかし、客観的かつ統計的に厳格な評価を得ることは困難である。これらの問題を克服するために、マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーと、3つのオートファジーマーカー（LC3、p62およびリソソームLAMP1）からの尾部画像を検出し、それらの共局在を定量化し、LC3スポット計数と組み合わせて、客観的、定量的および統計的に堅牢な方法でオートファジーを測定する。

この分析方法は、複数の特徴を用いて自食流束を測定する。最終二変量プロットを完全に理解するためには、まず個々の分析特徴を調査しなければならない。オートファゴソームの計数は、オートファジーを測定する論理的な方法です。しかし、LC3涙のサイズ/形状/輝度は、細胞間で大幅に変化し得る。変異により、自動染色体を手動で数えることが困難になるか、分析ソフトウェアでスポットカウント機能を使用することが困難になります。したがって、オートファゴソームのこの大きな変動のためにスポットカウント機能は完璧ではない。しかし、良いスポットカウント機能は、ほとんどの細胞26上で動作します。 図3は、異なるスポットマスクを用いたJurkat細胞におけるLC3穿刺のスポットマスキングの例を示す。このデータセットで選択されたスポットカウント機能は、Spot Count_Peak（M11、Ch11-LC3-AF647、Bright、4）_4です。スポットカウント機能は、スポット対セル背景比率4（Bright、4）でチャンネル11（Ch11-LC3-AF647）のデフォルトチャンネル11マスク（M11）内で識別されたakマスクを生成する。 図4は、抗LC3-AF647で標識した対照、対照+クロロキン、飢餓および飢餓+クロロキンJurkat細胞についてのスポットカウントヒストグラムおよび平均スポットカウントの代表的な画像を示す。コントロールスポットと飢えた平均スポット数は大きく異なるわけではありません。クロロキンの添加により、飢餓+クロロキンと比較して、対照+クロロキンの平均に大きな差がある。 調査する次の機能はBDC3です。 BDC3は、3つのマーカー/プローブ（この場合、LC3、p62、およびLAMP1）の共局在化の測定値である。 図 5A〜5Dは、抗p62-AF488で標識された対照、対照+クロロキン、飢餓および飢餓+クロロキンJurkat細胞についてのBDC3ヒストグラムを示す、抗LAMP1-PE、および抗LC3-AF647が挙げられる。 Control + MeaningとControl + ChloroquineはStarved + Chloroquineの平均値に差があります。しかし、 図5Eにおける平均BDC3スコアからの細胞の画像を見- 5H、信じるために1つをもたらし得るヒストグラムよりもサンプル間の大きな違いがあります。これは、BDC3は、同じBDC3スコアについて、自己貪食細胞の数の大きな程度の変動をもたらす、共局在する自己貪食細胞小器官の数を考慮しないためである。ほとんどの場合、基底レベルでさえ、p62、LAMP1、およびLC3はある程度、細胞内の同様の領域に共局在または存在すべきであるため、3つのプローブの間に重複が存在する。対照的に、共局在すべきではない3つのプローブの例は、 図6に示すStarved + Chloroquineサンプルの抗p62-AF488、抗LC3-AF647、およびDAPI核色素である。/ p&gt; スポットカウント機能とBDC3機能を組み合わせると、様々なサンプル/条件を区別する能力を向上させる異なるサブポピュレーションの存在が明らかです。 図7は、対照、対照+クロロキン、飢餓、および飢餓+クロロキンの4つのサンプルについて、LC3対BDC3p62 / LAMP1 / LC3のスポットカウントの二変量プロットを示す。 Controlサンプルを使用して、低点、高点/低BDC3、高点/高BDC3の3つの集団のゲーティング戦略を設定しました。対照試料は、細胞の98％より多くが1つ以下のスポットを有することを実証した。 High Spots / Low BDC3とHigh Spots / High BDC3の境界は、対照サンプルの91％以上が1未満のBDC3スコアを有するため、BDC3スコアが1に設定された。二変量プロットの結果の要約表1に示す。 age = &quot;1&quot;&gt; <img alt="図1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> 図1：MIFC計測器の設定この実験で使用されたMIFC計測器設定のスクリーンショット（プロトコルのステップ8で概説）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> 図2：分析ソフトウェアゲーティング戦略。プロトコルのステップ9で概説された分析ソフトウェアゲーティングスキームのスクリーンショット。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> fig3.jpg &quot;/&gt; 図3：LC3スポットマスキングスポットカウント機能を作成するために使用されるJurkatセル画像とマスク。 BrightField（BF）、LC3-AF647、ピーク（M11、Ch11-LC3-AF647、ブライト、2）、ピーク（M11、Ch11-LC3-AF647、ブライト、4）、ピーク（M11、Ch11-LC3-AF647 、Bright（5）、Spot（M11、Ch11-LC3-AF647、Bright、5,3,1）、およびSpot（M11、Ch11-LC3-AF647、Bright、6,2,1）である。表示されたすべてのセルで最も効果的なマスクはPeak（M11、Ch11-LC3-AF647、Bright、4）でした。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> 図4：LC3スポットカウントヒストグラム対照（ A 、薄青色）のスポットカウント機能Spot Count_Peak（M11、Ch11-LC3-AF647、Bright、4）_4およびLC3-AF647スポットカウントヒストグラムを使用して、Control + Chloroquine（ B 、青）、飢えている（ C 、ピンク）、飢えた+クロロキン（ D 、赤）。 Control、Control + Chloroquine、Starved、およびStarved + Chloroquineの平均スポット数は、それぞれ0.07,1.33,0.10および2.77である。コントロールスポット（ Eスポット、0スポット）、コントロール+クロロキン（ Bスポット）、 Bスポット、LC3-AF647（赤色）、DAPI核染料（青色）、および平均スポットカウントの代表的な細胞のLC3-AF647およびDAPI画像F 、1スポット）、飢餓状態（ G 、0スポット）、および飢餓+クロロキン（ H 、3スポット）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> 図5：p62 / LAMP1 / LC3のBDC3ヒストグラム。 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3のヒストグラムRコントロール（A、ライトブルー）、コントロール+クロロキン（B、青）、スターブド（ピンクC）、及び飢餓+クロロキン（D、赤）。 Control、Control + Chloroquine、Starved、およびStarved + Chloroquineの平均BDC3スコアは、それぞれ0.57,0.82,0.74および0.98である。 BF; p62-AF488（緑色）。 LAMP1-PE（黄色）。 LC3-AF647（赤色）; Control（ E ）、Control + Chloroquine（ F ）、Starved（ G ）、およびStarved + Chloroquineについての代表的な細胞のp62-AF488、LAMP1-PE、およびLC3-AF647画像の複合体が示されているH ）。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> 図6：p62 / LのBDC3ヒストグラム餓死+クロロキンサンプルのC3 / DAPI。 （ A ）Starved + ChloroquineサンプルのBDC3 p62 / LC3 / DAPIヒストグラムが示されている。平均BDC3スコアは0.07である。 （ B ）BF; p62-AF488（緑色）。 LC3-AF647（赤色）; DAPI（青色）; Starved + Chloroquineサンプルについては、平均BDC3についての代表的な細胞のp62-AF488、LC3-AF647、およびDAPI画像の複合体が示されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <img alt="図7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> 図7：BDC3 p62 / LAMP1 / LC3に対するLC3スポット数の二変量プロット。 （ A ）Control、Control + Chloroquine、Starved、およびStarved + Chloroquine Jurkat細胞に対するLC3スポット数対BDC3 p62 / LAMP1 / LC3の二変量プロット。 （ B ）BF; p62-AF488（緑）; LAMP1-PE（黄色）。 LC3-AF647（赤色）; Starved + Chloroquineサンプルについては、3つの領域（ すなわち、低スポット、高スポット/低BDC3、高スポット/高BDC3）からのp62-AF488、LAMP1-PEおよびLC3-AF647画像の複合体が示されている。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td>細胞数</td><td>明るい詳細Colocalization 3平均</td><td>スポットカウントLC3 Mean </td><td>低スポット％ </td><td>ハイスポット/ローBDC3％ </td><td>ハイスポット/ハイBDC3％ </td></tr><tr><td>コントロール</td><td> 439 </td><td> 0.57 </td><td> 0.07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0.0 </td></tr><tr><td>対照+クロロキン</td><td> 1432年</td><td> 0.82 </td><td> 1.13 </td><td> 68.9 </td&gt; <td> 19.5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td>飢えた</td><td> 1204 </td><td> 0.74 </td><td> 0.10 </td><td> 98.4 </td><td> 0.6 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td>飢えた+クロロキン</td><td> 1811 </td><td> 0.98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36.9 </td><td> 31.0 </td></tr></tbody></table> 表1：Jurkat LC3スポット数対 BDC3 p62 / LAMP1 / LC3二変量プロットのまとめ

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Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

ここでは、LC3スポット計数とともに、3つのオートファジーマーカーの明るい詳細画像を比較し、それらの共局在化を定量化する分析的特徴を有するマルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いて、客観的、定量的および統計的に堅牢な方法でオートファジーを測定した。

マルチスペクトルイメージングフローサイトメトリーを用いたLC3、p62、およびLAMP1共局在の測定によるオートファジーフラックスの評価

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