Name: assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry
Uploaded: 2017-07-21T13:00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Jag vill tacka mina medarbetare på MilliporeSigma, Philip J. Morrissey och Sherree L. Friend, för deras stöd och vägledning under åren. Jag vill också tacka Vidya Venkatachalam och Bryan R. Davidson för deras hjälp med BDC3 funktion i IDÉER programvara, Ryan P. Jessup för att få hjälp att redigera detta manuskript, Raymond Kong för att få hjälp på dagen för skytte, och ett särskilt tack Till makeup artist Cynthia Xamonthiene.

<ol>
	<li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+should+autophagic+flux+be+assessed?.">Why should autophagic flux be assessed?.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).</li><li>Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+Autophagy.">LC3 and Autophagy.</a> Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).</li><li>Larsen, K. B., Lamark, T., &#216;vervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bj&#248;rk&#248;y, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reporter+cell+system+to+monitor+autophagy+based+on+p62/SQSTM1.">A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1.</a> Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).</li><li>Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+flow+cytometry+for+measurement+of+autophagy.">Applications of flow cytometry for measurement of autophagy.</a> Methods. 75, 87-95 (2015).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+mammalian+autophagy+research.">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).</li><li>Arsov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC-mediated+transgenic+expression+of+fluorescent+autophagic+protein+Beclin+1+reveals+a+role+for+Beclin+1+in+lymphocyte+development.">BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development.</a> Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).</li><li>Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+death+pathways+in+desmin-related+cardiomyopathy.">Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy.</a> Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).</li><li>Altman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+essential+to+suppress+cell+stress+and+to+allow+BCR-Abl-mediated+leukemogenesis.">Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis.</a> Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).</li><li>Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammaherpesvirus+68+infection+of+endothelial+cells+requires+both+host+autophagy+genes+and+viral+oncogenes+for+optimal+survival+and+persistence.">Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence.</a> J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).</li><li>Tra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+human+embryonic+stem+cells.">Autophagy in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li><li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1+targets+both+autophagy+and+apoptosis+pathways+in+pediatric+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).</li><li>Leveque-El Mouttie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+required+for+stem+cell+mobilization+by+G-CSF.">Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF.</a> Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).</li><li>Watson, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+limits+proliferation+and+glycolytic+metabolism+in+acute+myeloid+leukemia.">Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia.</a> Cell Death Discov. 1, 15008 (2015).</li><li>Stranks, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+Controls+Acquisition+of+Aging+Features+in+Macrophages.">Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages.</a> J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).</li><li>Clarke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+activated+in+systemic+lupus+erythematosus+and+required+for+plasmablast+development.">Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development.</a> Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).</li><li>Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+assays+for+the+study+of+autophagy.">Flow cytometric assays for the study of autophagy.</a> Methods. 82, 21-28 (2015).</li><li>Bj&#248;rk&#248;y, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62/SQSTM1+forms+protein+aggregates+degraded+by+autophagy+and+has+a+protective+effect+on+huntingtin-induced+cell+death.">p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death.</a> J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).</li><li>Phadwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+autophagy+detection+in+primary+cells:+Impaired+levels+of+macroautophagy+in+immunosenescent+T+cells.">A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells.</a> Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).</li><li>Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+autophagosomes+and+autolysosomes+in+cells+using+imaging+flow+cytometry.">Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).</li><li>Kwok, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HspB8+mutation+causing+hereditary+distal+motor+neuropathy+impairs+lysosomal+delivery+of+autophagosomes.">HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes.</a> J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).</li><li>Lopez-Herrera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleterious+Mutations+in+LRBA+Are+Associated+with+a+Syndrome+of+Immune+Deficiency+and+Autoimmunity.">Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity.</a> Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).</li><li>Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATF4+orchestrates+a+program+of+BH3-only+protein+expression+in+severe+hypoxia.">ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia.</a> Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).</li><li>Pike, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+up-regulation+of+ULK1+by+ATF4+contributes+to+cancer+cell+survival.">Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival.</a> Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).</li><li>Pugsley, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+autophagy:+Measuring+LC3+puncta+and+autolysosome+formation+in+cells+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry.</a> Methods. 112, 147-156 (2017).</li><li>IDEAS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2. , (2015).</li></ol>

Jag är anställd av MilliporeSigma, tillverkaren av Amnis-märket ImageStream, som användes i denna studie.

Vid analysen finns det några saker att tänka på. Det är viktigt att ha lämpliga kontrollprover. För detta experiment användes två olika kontroller: Kontroll och kontroll + klokokin. Kontrollprovet användes för att ställa in tröskeln för regionerna. Det representerar den basala nivån av autophagy utan att stoppa lysosomal nedbrytning och är kontrollen för det Starved-provet. Kontrollprovet är dock inte en lämplig kontroll för att jämföras med resultaten från Starved + Chloroquine-provet eftersom klorokin själv påverkar kontrollprovet. Därför var det nödvändigt att ha ett kontroll + kloroquinprov. Före analysen av autofagi är det viktigt att endast analysera / grinda på enskilda celler som ligger i fokus ( dvs gradient RMS större än 60), eftersom resultaten kan påverkas om det finns mer än en cell eller bilderna är ur fokus. Det är avgörande att autofagosomEs och lysosomer är i fokus för korrekt spoträkning och BDC3-analys. Apoptotiska celler måste avlägsnas före autofaganalys, eftersom de kan skryta resultat och inte inkluderas. Det bör finnas lämplig färgning för alla tre markörerna ( dvs. LC3, P62 och LAMP1). Till exempel är alla tre markörer intracellulära och bör ha en punktsignal; Om signalen inte punkteras eller om den befinner sig på cellens yta, skulle färgningen inte vara lämplig och experimentet / färgningen bör omformas. Dessutom, för att BDC3 ska vara korrekt, är det viktigt att grinda på celler som är ljusa för alla tre fluorescerande markörer av intresse. Gating på positiva händelser behövs för att förhindra mätning av BDC3 på icke-specifik bindning, bildartefakter och / eller ljud. Detta är avgörande, eftersom BDC3 potentiellt kan förstärka artefakter som inte är sanna signaler. Eftersom BDC3 endast kan utföras på ljusa positiva händelser, kan många celler inte inkluderas i den slutliga analysen; Det här är specielltJag är verkligen sant för kontrollceller som inte har någon ackumulering av LC3, P62 och / eller LAMP1. Således är en begränsning av denna analys att BDC3 endast undersöker celler som är positiva för alla tre markörer, vilket kanske inte är lämpliga för alla autofagiska experiment. Liksom BDS, som tidigare rapporterats 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , tar BDC3 inte ens hänsyn till antalet autofagorganeller som samlokaliserar, vilket resulterar i en stor grad Av variationen i antalet autofagosomer. Därför är det bivariatiska tillvägagångssättet som presenteras av Rajan et al. Användes. Titta på de bivariata tomterna kan man fråga omCellerna måste vara positiva för LC3, p62 och LAMP1; Varför finns det så många celler som har 0 fläckar? Detta beror på att LC3-signalen kan vara tillräckligt ljus för samlokalisering, men det kanske inte uppfyller tröskeln som fastställts av toppmasken (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4)) som krävs för att den ska betraktas som en fläck. Protokollet som presenteras här använde MIFC för att räkna LC3 puncta och samlokalisering av tre autofagmarkörer för att mäta autofagiskt flöde. Under basala förhållanden (kontrollprov) var antalet autofagosomer låga och få celler hittades med &quot;High Spots&quot;. Med tillsatsen av klorokin, som hämmar autofagosom / lysosomfusion, var det en ökning av antalet LC3-fläckar. Eftersom lysosomen inte kan bryta ner autofagosomen och p62, som ligger i autofagosomen, leder detta till en ökning av samlokaliseringen av ackumuleringen av LC3, p62 och LAMP1 autolysosom. Denna effekt förstärktes under näringsstärkelseJon, vilket inducerar autofagi. Men utan tillsats av klorokin var det inte en signifikant ökning av antalet autofagosomer, troligen på grund av en ökning av autofagisk omsättningshastighet. När cellerna svälte i närvaro av klorokin var det en ökning av samlokalisering och antal autofagosomer, vilket stöder slutsatsen att svält ökar autofagiskt flöde. EBSS är känt för att vara en kraftfull inducer av autofagi. Därför förväntas ökningen vara stor. Om en annan metod, såsom läkemedelsinduktion, används för att inducera autofagi, kan skillnaden mellan kontroll och behandlade prover vara subtilare. Detta speciella protokoll utformades för att mäta autofagi i humana cellinjer, men analysen kunde anpassas till andra arter genom att växla till antikroppar för den specifika arten. Dessutom kan analysmetoden användas för vilken intracellulär applikation som helst som kräver samlokaliseringAv tre sonder / markörer.

Makroautofagi, nedan kallad autofagi, är en katabolisk väg där skadade eller dysfunktionella komponenter, långlivade proteiner och organeller nedbryts via lysosomen och återvinns 1 . Autophagy är en dynamisk process med flera steg som innebär bildandet av en autofagosom; Fusionen av autophagosomen med lysosomen, bildande autolysosomen; Och nedbrytningen av innehållet i autolysosomen 2 . Den avgörande biologiska markören som används för att identifiera autofagi i däggdjursystem är den mikrotubulära associerade proteinet 1A / 1B-lätta kedjan 3 (LC3), som utgör autofagosomalmembranet. Under autofag konjugeras cytosoliskt LC3-1 till fosfatidyletanolamin för att bilda LC3-II; LC3-II införlivas därefter i autophagosomalmembranet 3 . En annan allmänt använd markör för autofagiskt flöde är autophagy receptor-sekvestosom 1 (SQSTM1, p62) som fysiskt liNks autofagisk last till det autophagiska membranet 4 , 5 . Metoder som traditionellt har använts för att mäta autofagi är Western blots och fluorescensmikroskopi 7 . Men ingen av dessa metoder anses vara &quot;guldstandarden&quot; 2 , 6 eftersom det finns utmaningar förknippade med båda dessa tekniker. Western blottar ger bara ett medel eftersom de använder ett homogenatprov, så observatörer kan inte se vad som händer i enskilda celler. Å andra sidan ger fluorescensmikroskopi en observatörsinformation på encellsnivå men saknar genomströmningsförmåga, vilket gör det svårt att erhålla objektiva och statistiskt noggranna bedömningar. Under de senaste åren har mätningen av LC3 och p62 genom multispectral imaging flow cytometry (MIFC, se Materialet ) ökat popuLärdhet på grund av sin kvantitativa kraft, hög kapacitet, multiplexeringspotential och förmåga att bilda varje cell. En av de mest använda metoderna för att mäta autofagi med hjälp av MIFC, tillsammans med dess följeslagsanalysprogramvara (se Materialetabellen ), är genom spoträkning av LC3 puncta eller autofagosomer 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . En ökning av autofagosomer betyder emellertid inte nödvändigtvis att det finns en ökning av autofagi, eftersom det också kan utgöra en blockad i processen 2 . LC3-II omsättning är en användbar parameter för att mäta autofagiskt flöde genom att analysera celler i närvaro ochFrånvaro av en lysosomal nedbrytningsinhibitor, såsom klorokin. Klokokin inhiberar fusionen av autofagosomen till lysosomen, vilket möjliggör kvantifiering av autofagosombildningen som ett mått på graden av autofag genom att stoppa autofagiskt flöde innan lysosomal nedbrytning kan inträffa 18 . Dessutom försämras p62 huvudsakligen av autofagi, och om den lysosomala nedbrytningen av autofagosomen och dess innehåll blockeras, förväntas en ackumulering av p62 17 , 19 . Autophagy är en multistep-process, och mätningen av LC3 eller P62 ensam ger inte en komplett bild av vad som händer i cellerna. Tidigare publikationer har betonat behovet av att undersöka den samtidiga bildningen av autolysosom 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC ären unik möjlighet att mäta bildningen av autolysosome genom avbildning av samlokalisering av den autophagosome till lysosomen 15-17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26. Dessutom har samlokaliseringen av p62 och LC3 med användning av MIFC också undersökts för att mäta autofagiskt flöde 5 . I den refererade analysprogramvaran kallas &quot;funktionen&quot; som mäter samlokalisering &quot;Bright Detail Similarity R3&quot; (BDS) och var specifikt utformad för att jämföra de små, ljusa bilduppgifterna för två bilder. BDS är den logtransformerade Pearsons korrelationskoefficient för de lokaliserade ljuspunkterna med en radie av 3 pixlar eller mindre; Med andra ord beräknar BDS graden av oFörskjutning av pixlar från två olika fluorescerande kanaler. De ljusa fläckarna är antingen korrelerade ( dvs samma rumsliga plats) eller okorrelerade ( dvs olika rumsliga platser). Därför varierar korrelationskoefficienten mellan 0 (okorrelerad) och 1 (perfekt korrelation). Koefficienten är log-transformerad för att öka intervallet mellan noll och oändlighet 26 , 27 . BDS ensam kan inte vara tillräckligt. Rajan et al. Fann att användandet av enbart BDS kan leda till falskt positiva eller falskt negativa resultat 21 . BDS utvärderar samlokaliseringen av två markörer av autofagi men beaktar inte antalet autofagosomer. För att redogöra för antalet autofagosomer, beskriver Rajan et al. Inkluderade spoträkning av LC3 puncta 21 . Rajan et al. Föreslagna med användning av ett bivariat scatterplot av LC3 spot count jämfört med BDS. Med hjälp av denna bivariate plot, två populationer werE identifierades först: ett med celler som har en hög nivå av LC3-fläckar och en med celler som har en låg nivå av LC3-fläckar. High-LC3-spotpopulationen klassificerades vidare i två populationer: celler med låg samlokalisering ( dvs. ackumulering av autofagosomer) och celler med hög samlokalisering ( dvs. ackumulering av autolysosomer). Denna bivariate plot gör det möjligt att skilja mellan celler med väldigt få autophagosomer och celler med ackumulering av autofagosomer och / eller autolysosomer 21 . Hittills var den samtidiga samlokaliseringen av LC3, p62 och LAMP1 (lysosomal markör) inte möjlig med en enda &quot;Feature Type&quot; i MIFC Companion Analysis Software (se Materialetabellen ). En ny funktion, som nyligen introducerades i version 6.1, kallas dock Bright Detail Colocalization 3 (BDC3). BDC3 jämför de ljusa detaljbilderna från var och en av de tre bilderna (i det här fallet LC3, p62 och LAMP1) och kvantifierar samlokaliseringen av de tre sonderna ( dvs LC3, p62 och LAMP1). BDC3-funktionen beräknar Pearsons korrelationskoefficient som är modifierad för att sträcka sig till tre bilder. Eftersom de ljusa fläckarna i de tre bilderna antingen är korrelerade eller okorrelerade varierar korrelationskoefficienten mellan 0 (okorrelerad) och 1 (perfekt korrelation). Koefficienten är log-transformerad för att öka det dynamiska intervallet mellan 0 och oändligheten. Genom att byta ut BDS-funktionen med BDC3-funktionen, presenterades analysmetoden som presenterades av Rajan et al. Kan nu införliva de tre mest använda markörerna för att mäta autophagy i ett system samtidigt. Möjligheten att co-lokalisera dessa tre markörer av autofagi i en enda analys kan leda till nya insikter i induktion och reglering av autofagi. Följande protokoll beskriver stegen för att inducera autofagi i Jurkat-celler; Märka cellerna med LC3-, p62- och LAMPl-antikroppar; Skaffa data på en multispEktral imaging flödescytometer; Och analysera data för att bedöma autofagiskt flöde.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1012">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:244px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">352096</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;">AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31571</td>
			<td style="width:299px;">Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:308px;">anti-human CD107a-PE (LAMP1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328607</td>
			<td style="width:299px;">Clone H4A3. Concentration 400 &#181;g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;">anti-human CD45- AF488</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304017</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">anti-human CD45- PE&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304008</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30.&#160; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;">anti-human CD45-AF647&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304018</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30.&#160; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12</td>
			<td>MBL International Corporation</td>
			<td>M152-3</td>
			<td style="width:299px;">Clone 4E+12.&#160; Concentration 2 mg/mL.&#160; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab185015</td>
			<td style="width:299px;">Clone EPR4844.&#160; Concentration 0.5 mg/mL.&#160; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Chloroquine diphosphate Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6628-25G</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">DAPI Stain 5mg/mL</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>508741</td>
			<td style="width:299px;">http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:308px;">Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1.3704</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10X</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-2010-B</td>
			<td style="width:299px;">&#160;Ca++Mg++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">PBS Ca++Mg++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Earle&#39;s Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14155</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="241">
			<td height="241" style="height:241px;width:308px;">Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td style="width:299px;">This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td style="width:299px;">https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="201">
			<td height="201" style="height:201px;width:308px;">MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">MIFC analysis software - IDEAS 6.2</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).&#160; IDEAS version 6.2</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328608</td>
			<td style="width:299px;">http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30082.1</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:299px;">You can use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RPMI-1640 Medium 1X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Sheath - PBS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td style="width:299px;">Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Sodium Pyruvate solution (100mM)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30239.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td style="width:299px;">This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:308px;">System Calibration Reagent - SpeedBead</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>400041</td>
			<td style="width:299px;">Each tube holds ~10 mL.&#160; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>648463-50ML</td>
			<td style="width:299px;">http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Water, Cell Culture Grade&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry

Autophagy är en katabolisk väg där normala eller dysfunktionella cellulära komponenter som ackumuleras under tillväxt och differentiering bryts ned via lysosomen och återvinns. Under autofag lipideras cytoplasmatiskt LC3-protein och rekryteras till de autofagosomala membranen. Autofagosomen smälter sedan med lysosomen för att bilda autolysosomen, där nedbrytningen av autofagosomvesikeln och dess innehåll inträffar. Det ubiquitin-associerade proteinet p62, som binder till LC3, används också för att övervaka autofagiskt flöde. Celler som genomgår autofagi bör visa samlokalisering av p62-, LC3- och lysosomala markörer. Immunofluorescensmikroskopi har använts för att visuellt identifiera LC3 puncta, p62 och / eller lysosomer per cell-basis. En objektiv och statistiskt noggrann bedömning kan emellertid vara svår att erhålla. För att övervinna dessa problem användes multispectral bildbehandling flödescytometri tillsammans med en analytisk egenskap som jämför de ljusaSvansbilder från tre autofagmarkörer (LC3, p62 och lysosomal LAMP1) och kvantifierar deras samlokalisering i kombination med LC3-spoträkning för att mäta autofag på ett objektivt, kvantitativt och statistiskt robust sätt.

Denna analysmetod använder flera funktioner för att bedöma autofagiskt flöde. För att fullständigt förstå det slutliga bivariatritet måste de enskilda analysegenskaperna först undersökas. Räkningen av autophagosomer är ett logiskt sätt att mäta autofagi; LC3 punctas storlek / form / ljushet kan emellertid variera drastiskt mellan cellerna. Variation kan göra det svårt att räkna autofagosomer manuellt eller använda en spot-count-funktion i analysprogrammet. Därför kommer ingen spot-count-funktion att vara perfekt på grund av denna stora variation i autofagosomer. En bra spot-count-funktion kommer dock att fungera på de flesta celler 26 . Figur 3 visar exempel på punktmaskering av LC3 puncta i Jurkat-celler med användning av olika fläckmaskar. Spot-count-funktionen vald för denna dataset är Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4, vilket betyder att spot count-funktionen räknade de punkter som peAK-mask identifierad i standardkanal 11-masken (M11) på kanal 11 (Ch11-LC3-AF647) med ett bakgrundsförhållande mellan 4 och 4 (Bright, 4). Figur 4 visar spot-count-histogram och representativa bilder för medelvärdet för kontroll, kontroll + kloroquin, starved och Starved + Chloroquine Jurkat-celler märkta med anti-LC3-AF647. Kontrollen och Starved mean spot counten är inte signifikant olika; Med tillsats av klorokin, är det en stor skillnad i medelvärdet av kontroll + klokokinet jämfört med Starved + klokokin. Nästa funktion att undersöka är BDC3. BDC3 är en mätning av samlokalisering av tre markörer / sonder, i detta fall LC3, p62 och LAMP1. Figur 5A- 5D visar BDC3-histogram för kontroll-, kontroll + klorookin-, starved- och starved + kloroquin Jurkat-celler märkta med anti-p62-AF488, Anti-LAMP1-PE och anti-LC3-AF647. Det finns ett skifte mellan kontrollmedelvärdet för det Starved-medelvärdet, såväl som kontrollen + kloroquininet för Starved + Chloroquine-medelvärdet. Men när man tittar på bilderna från celler från de genomsnittliga BDC3-poängen i Figur 5E- 5H , är det en större skillnad mellan proven än histogrammen kan leda till att man tror. Detta beror på att BDC3 inte beaktar antalet autofagiska organeller som samlokaliserar, vilket resulterar i stor variation i antalet autofagosomer för samma BDC3-poäng. I de flesta fall finns överlapp mellan alla tre sonder, eftersom även vid basala nivåer, p62, LAMP1 och LC3, i viss utsträckning ska lokaliseras eller uppehålla sig i liknande områden i cellerna. Som en kontrast är ett exempel på tre prober som inte bör lokaliseras anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 och DAPI-kärnfärg för Starved + Chloroquine-provet, som visas i figur 6. &lt;/ P&gt; När spot count-funktionen och BDC3-funktionen kombineras, är närvaron av olika subpopulationer som förbättrar förmågan att särskilja mellan de olika proverna / tillstånden uppenbara. Figur 7 visar det bivariära diagrammet av spotantalet av LC3 mot BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 för de fyra proven: Kontroll, Kontroll + Klokokin, Starved och Starved + Chlorokin. Kontrollprovet användes för att ställa in gatingstrategin för tre populationer: Låga punkter, High Spots / Low BDC3 och High Spots / High BDC3. Kontrollproverna visade att mer än 98% av cellerna hade 1 eller färre fläckar. Gränsen mellan High Spots / Low BDC3 och High Spots / High BDC3 sattes till ett BDC3-poäng på 1 eftersom mer än 91% av kontrollprovet hade ett BDC3-poäng på mindre än 1. En sammanfattning av resultaten för de bivariata tomterna Visas i tabell 1 . ålder = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> Figur 1: MIFC Instrument Setting. En skärmdump av MIFC-instrumentinställningarna som används för detta experiment, som skisseras i steg 8 i protokollet. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> Figur 2: Analys programvara Gating strategi. En skärmdump av analysprogramvarugivningssystemet, som skisseras i steg 9 i protokollet. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> Fig3.jpg &quot;/&gt; Figur 3: LC3 Spot Masking. Jurkat cellbilder och masker brukade skapa spot-count-funktionen. Visas är BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 2), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4), Peak (M11, Ch11-LC3-AF647 , Bright, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 5,3,1) och Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 6,2,1). Den mask som fungerade bäst för alla celler som visades var Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> Figur 4: LC3 Spot-Count Histograms. Med hjälp av spot count-funktionen Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4) _4 och LC3-AF647 spot-count-histogrammen för Control ( A , ljusblå), Control + ChloroquinE ( B , blå), Starved ( C , rosa) och Starved + Chlorokin ( D , röd). Medelpunkten för kontroll, kontroll + klokokin, starved och starved + klokokin är 0,07, 1,13, 0,10 respektive 2,77. BF, LC3-AF647 (röd), DAPI-kärnfärg (blå) och en komposit av LC3-AF647- och DAPI-bilderna av representativa celler för medelvärdesräkningstalet visas för kontroll ( E , 0 fläckar), kontroll + klokokin F , 1 fläck), Starved ( G , 0 fläckar) och Starved + Chlorokin ( H , 3 fläckar). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> Figur 5: BDC3-histogram av p62 / LAMP1 / LC3. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 histogram foR Kontroll ( A , ljusblå), Kontroll + Klokokin ( B , Blå), Starved ( C , Rosa) och Starved + Klokokin ( D , röd). Den genomsnittliga BDC3-poängen för Control, Control + Chlorokin, Starved och Starved + Chlorokin är 0,57, 0,82, 0,74 och 0,98. BF; P62-AF488 (grön); LAMP1-PE (gul); LC3-AF647 (röd); Och en sammansättning av p62-AF488-, LAMP1-PE- och LC3-AF647-bilderna av representativa celler för den genomsnittliga BDC3 visas för kontroll ( E ), kontroll + kloroquin ( F ), starved ( G ) och starved + klokokin ( H ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> Figur 6: BDC3-histogram av p62 / LC3 / DAPI för Starved + Chloroquine-provet. ( A ) BDC3 p62 / LC3 / DAPI histogram för Starved + Chloroquine-provet visas. Den genomsnittliga BDC3-poängen är 0,07. ( B ) BF; P62-AF488 (grön); LC3-AF647 (röd); DAPI (blå); Och en sammansättning av p62-AF488-, LC3-AF647- och DAPI-bilderna av representativa celler för den genomsnittliga BDC3 visas för Starved + Chloroquine-provet. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <img alt="Figur 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> Figur 7: Bivariate Plots av LC3 Spot Count jämfört med BDC3 p62 / LAMP1 / LC3. ( A ) Bivariatgrader av LC3-spotantal jämfört med BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 för kontroll, kontroll + kloroquin, starved och starved + kloroquine Jurkat-celler. ( B ) BF; P62-AF488 (grön); LAMP1-PE (gul); LC3-AF647 (röd); Och en sammansättning av bilderna p62-AF488, LAMP1-PE och LC3-AF647 från tre regioner ( dvs låga punkter, höga punkter / låga BDC3 och High Spots / High BDC3) visas för Starved + Chloroquine-provet. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Cellräkning </td><td> Bright Detail Colocalization 3 Mean </td><td> Spotantal LC3 Medelvärde </td><td> % Lågpunkt </td><td> % High Spot / Low BDC3 </td><td> % High Spot / High BDC3 </td></tr><tr><td> Kontrollera </td><td> 439 </td><td> 0,57 </td><td> 0,07 </td><td> 98,2 </td><td> 1,8 </td><td> 0,0 </td></tr><tr><td> Kontroll + klokokin </td><td> 1432 </td><td> 0,82 </td><td> 1,13 </td><td> 68,9 </td&gt; <td> 19,5 </td><td> 11,7 </td></tr><tr><td> Utsvulten </td><td> 1204 </td><td> 0,74 </td><td> 0,10 </td><td> 98,4 </td><td> 0,6 </td><td> 1,0 </td></tr><tr><td> Starved + klokokin </td><td> 1811 </td><td> 0,98 </td><td> 2,77 </td><td> 32,1 </td><td> 36,9 </td><td> 31,0 </td></tr></tbody></table> Tabell 1: Sammanfattning av Jurkat LC3 Spot Count jämfört med BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 Bivariate Plot

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Här används multispectral bildflödescytometri med en analysfunktion som jämför ljusa detaljbilder av 3 autofagmarkörer och kvantifierar deras samlokalisering, tillsammans med LC3-spoträkning, användes för att mäta autofagi på ett objektivt, kvantitativt och statistiskt robust sätt.

Bedömning av autophagic Flux genom mätning av LC3-, p62- och LAMP1-co-lokalisering med användning av multispektral bildflödescytometri

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Research

JoVE Journal

Biology

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

IP-FCM: Immunoprecipitation upptäckt med flödescytometri

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Kvantitativ mätning av GLUT4 Translokation till plasmamembranet med flödescytometri

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Flödescytometri Rening av Mouse meiotiska celler

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Mätning Cell Kinetics cellcykelreglering med metabolisk märkning och flödescytometri

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Optimerade färgning och spridning modelleringsmetoder för celldelning övervakning med hjälp Färgämnen Cell Tracking

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Mätning intracellulär Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Förändringar i mänskliga spermier med fyra tekniker: Konventionell fluorometri Stoppad Flow fluorometri, flödescytometri och Single Cell Imaging

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Identifiering av en Murina erytroblast subpopulation Berikad i Enucleating Händelser av Multispektral Imaging flödescytometri

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Spårning av Hematopoietic Stem och stamceller i vuxen mus calvarial Benmärg

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Cytosoliska Kalcium Mätningar i Renal epitelceller med flödescytometri

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...