Name: assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry
Uploaded: 2017-07-21T13:00:00
Duration: 11 min 39 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

MilliporeSigma, Philip J. Morrissey ve Sherree L. Friend&#39;deki meslektaşlarımıza yıllar boyunca destek ve rehberlik yaptıkları için teşekkür etmek istiyorum. Vidya Venkatachalam&#39;a ve Bryan R. Davidson&#39;a, IDEAS yazılımındaki BDC3 özelliği ile ilgili yardımlarından ötürü teşekkür ediyorum , bu el yazması için Raymond Kong&#39;a yardımcı olmak için Ryan P. Jessup çekim gününde yardım ve özel teşekkürler Makyaj sanatçısı Cynthia Xamonthiene&#39;e.

<ol>
	<li>Levine, B., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+by+self-digestion:+molecular+mechanisms+and+biological+functions+of+autophagy.">Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy.</a> Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).</li><li>Zhang, X. J., Chen, S., Huang, K. X., Le, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+should+autophagic+flux+be+assessed?.">Why should autophagic flux be assessed?.</a> Acta Pharmacologica Sinica. 34, 595-599 (2013).</li><li>Tanida, I., Takashi, U., Kominami, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=LC3+and+Autophagy.">LC3 and Autophagy.</a> Methods Mol Biol. 445, 77-88 (2008).</li><li>Larsen, K. B., Lamark, T., &#216;vervatn, A., Harneshaug, I., Johansen, T., Bj&#248;rk&#248;y, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+reporter+cell+system+to+monitor+autophagy+based+on+p62/SQSTM1.">A reporter cell system to monitor autophagy based on p62/SQSTM1.</a> Autophagy. 6 (6), 784-793 (2010).</li><li>Demishtein, A., Porat, Z., Elazar, Z., Shvets, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Applications+of+flow+cytometry+for+measurement+of+autophagy.">Applications of flow cytometry for measurement of autophagy.</a> Methods. 75, 87-95 (2015).</li><li>Mizushima, N., Yoshimori, T., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+in+mammalian+autophagy+research.">Methods in mammalian autophagy research.</a> Cell. 140 (3), 313-326 (2010).</li><li>Klionsky, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+the+use+and+interpretation+of+assays+for+monitoring+autophagy.">Guidelines for the use and interpretation of assays for monitoring autophagy.</a> Autophagy. 8 (4), 445-544 (2012).</li><li>Arsov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BAC-mediated+transgenic+expression+of+fluorescent+autophagic+protein+Beclin+1+reveals+a+role+for+Beclin+1+in+lymphocyte+development.">BAC-mediated transgenic expression of fluorescent autophagic protein Beclin 1 reveals a role for Beclin 1 in lymphocyte development.</a> Cell Death Differ. 15 (9), 1385-1395 (2008).</li><li>Maloyan, A., Sayegh, J., Osinska, H., Chua, B. H., Robbins, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Manipulation+of+death+pathways+in+desmin-related+cardiomyopathy.">Manipulation of death pathways in desmin-related cardiomyopathy.</a> Circ Res. 106 (9), 1524-1532 (2010).</li><li>Altman, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+essential+to+suppress+cell+stress+and+to+allow+BCR-Abl-mediated+leukemogenesis.">Autophagy is essential to suppress cell stress and to allow BCR-Abl-mediated leukemogenesis.</a> Oncogene. 30 (16), 1855-1867 (2011).</li><li>Suarez, A. L., Kong, R., George, T., He, L., Yue, Z., van Dyk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gammaherpesvirus+68+infection+of+endothelial+cells+requires+both+host+autophagy+genes+and+viral+oncogenes+for+optimal+survival+and+persistence.">Gammaherpesvirus 68 infection of endothelial cells requires both host autophagy genes and viral oncogenes for optimal survival and persistence.</a> J Virol. 85 (13), 6293-6308 (2011).</li><li>Tra, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+in+human+embryonic+stem+cells.">Autophagy in human embryonic stem cells.</a> PLoS One. 6 (11), (2011).</li><li>Yuan, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bafilomycin+A1+targets+both+autophagy+and+apoptosis+pathways+in+pediatric+B-cell+acute+lymphoblastic+leukemia.">Bafilomycin A1 targets both autophagy and apoptosis pathways in pediatric B-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Haematologica. 100 (3), 345-356 (2015).</li><li>Leveque-El Mouttie, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+required+for+stem+cell+mobilization+by+G-CSF.">Autophagy is required for stem cell mobilization by G-CSF.</a> Blood. 125 (19), 2933-2936 (2015).</li><li>Watson, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+limits+proliferation+and+glycolytic+metabolism+in+acute+myeloid+leukemia.">Autophagy limits proliferation and glycolytic metabolism in acute myeloid leukemia.</a> Cell Death Discov. 1, 15008 (2015).</li><li>Stranks, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+Controls+Acquisition+of+Aging+Features+in+Macrophages.">Autophagy Controls Acquisition of Aging Features in Macrophages.</a> J Innate Immun. 7 (4), 375-391 (2015).</li><li>Clarke, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autophagy+is+activated+in+systemic+lupus+erythematosus+and+required+for+plasmablast+development.">Autophagy is activated in systemic lupus erythematosus and required for plasmablast development.</a> Ann Rheum Dis. 74 (5), 912-920 (2015).</li><li>Warnes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+assays+for+the+study+of+autophagy.">Flow cytometric assays for the study of autophagy.</a> Methods. 82, 21-28 (2015).</li><li>Bj&#248;rk&#248;y, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p62/SQSTM1+forms+protein+aggregates+degraded+by+autophagy+and+has+a+protective+effect+on+huntingtin-induced+cell+death.">p62/SQSTM1 forms protein aggregates degraded by autophagy and has a protective effect on huntingtin-induced cell death.</a> J Cell Biol. 171 (4), 603-614 (2005).</li><li>Phadwal, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+method+for+autophagy+detection+in+primary+cells:+Impaired+levels+of+macroautophagy+in+immunosenescent+T+cells.">A novel method for autophagy detection in primary cells: Impaired levels of macroautophagy in immunosenescent T cells.</a> Autophagy. 8 (4), 677-689 (2012).</li><li>Rajan, R., Karbowniczek, M., Pugsley, H. R., Sabnani, M. K., Astrinidis, A., La-Beck, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+autophagosomes+and+autolysosomes+in+cells+using+imaging+flow+cytometry.">Quantifying autophagosomes and autolysosomes in cells using imaging flow cytometry.</a> Cytometry A. 87 (5), 451-458 (2015).</li><li>Kwok, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HspB8+mutation+causing+hereditary+distal+motor+neuropathy+impairs+lysosomal+delivery+of+autophagosomes.">HspB8 mutation causing hereditary distal motor neuropathy impairs lysosomal delivery of autophagosomes.</a> J Neurochem. 119 (6), 1155-1161 (2011).</li><li>Lopez-Herrera, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deleterious+Mutations+in+LRBA+Are+Associated+with+a+Syndrome+of+Immune+Deficiency+and+Autoimmunity.">Deleterious Mutations in LRBA Are Associated with a Syndrome of Immune Deficiency and Autoimmunity.</a> Am J Hum Genet. 90 (6), 986-1001 (2012).</li><li>Pike, L. R., Phadwal, K., Simon, A. K., Harris, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ATF4+orchestrates+a+program+of+BH3-only+protein+expression+in+severe+hypoxia.">ATF4 orchestrates a program of BH3-only protein expression in severe hypoxia.</a> Mol Biol Rep. 39 (12), 10811-10822 (2012).</li><li>Pike, L. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptional+up-regulation+of+ULK1+by+ATF4+contributes+to+cancer+cell+survival.">Transcriptional up-regulation of ULK1 by ATF4 contributes to cancer cell survival.</a> Biochem J. 449 (2), 389-400 (2013).</li><li>Pugsley, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+autophagy:+Measuring+LC3+puncta+and+autolysosome+formation+in+cells+using+multispectral+imaging+flow+cytometry.">Quantifying autophagy: Measuring LC3 puncta and autolysosome formation in cells using multispectral imaging flow cytometry.</a> Methods. 112, 147-156 (2017).</li><li>IDEAS. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Image Data Exploration and Analysis Software User's Manual Version 6.2. , (2015).</li></ol>

Bu çalışmada kullanılan Amnis markası ImageStream&#39;in yapımcısı MilliporeSigma tarafından istihdam edildim.

Bu analiz yapılırken göz önüne alınması gereken birkaç nokta var. Uygun kontrol örneklerine sahip olmak önemlidir. Bu deney için iki farklı kontrol kullanıldı: Kontrol ve Kontrol + Klorokin. Bölgeler için eşik değeri belirlemek için Kontrol örneği kullanıldı. Otofajinin temel seviyesini lizozomal bozunmayı durdurmadan gösterir ve Starved örneğinin kontrolüdür. Bununla birlikte, Kontrol örneği, Starved + Chloroquine örneğindeki sonuçlar ile karşılaştırmak için uygun bir kontrol değildir; çünkü klorokin kontrol numunesini etkiler. Dolayısıyla, bir Control + Chloroquine örneği almak gerekiyordu. Otofaj için herhangi bir analiz yapmadan önce, yalnızca odaklanan tek hücre ( yani, RMS, 60&#39;dan büyük gradyan) üzerinde analiz etmek / kapamak önemlidir, çünkü birden fazla hücre varsa veya görüntüler etkilenebilir odak dışı. OtofagosomunEs ve lizozomlar uygun nokta sayımı ve BDC3 analizi için odaklanmaktadır. Otofaji analizinden önce apoptotik hücreler çıkartılmalıdır, çünkü sonuç çarpıtabilir ve eklenmemelidir. Her üç belirteç için de uygun boyama yapılmalıdır ( yani, LC3, p62 ve LAMP1). Örneğin, üç belirteçin tümü hücrelerarasıdır ve noktalamalı bir işaret içermelidir; Sinyal işaretli değilse veya hücrenin yüzeyinde bulunuyorsa boyama uygun olmayacak ve deney / boyanma yeniden yapılmalıdır. Buna ek olarak, BDC3&#39;ün doğru olması için, ilgilenilen üç flüoresan markeri için parlak olan hücreleri kaplamak gereklidir. Olumlu olaylar üzerinde geçiş, BDC3&#39;ün spesifik olmayan bağlanma, görüntüleme eserleri ve / veya gürültü üzerindeki ölçümünü önlemek için gereklidir. BDC3, gerçek sinyaller olmayan eserleri potansiyel olarak artırabildiği için bu çok önemlidir. BDC3 yalnızca parlak olumlu olaylar üzerinde gerçekleştirilebildiğinden, birçok hücre son analizde yer almayabilir; Bu especLC3, p62 ve / veya LAMP1 birikimine sahip olmayan kontrol hücreleri için geçerlidir. Bu nedenle, bu tahlilde bir sınırlama, BDC3&#39;ün yalnızca üç markör için de pozitif olan hücreleri inceler, bu da tüm otofajy deneyleri için uygun olmayabilir. Daha önce 15 , 16 , 17 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 olarak bildirilen BDS gibi, BDC3 tek başına, birlikte lokalize olan otofaji organellerin sayısını hesaba katmaz, bu da büyük bir dereceye neden olur Otofagozom sayısındaki değişkenlik. Bu nedenle, Rajan ve ark. Tarafından sunulan iki değişkenli yaklaşım ; kullanılmıştır. İki değişkenli parsele baktığımızda,Hücreler LC3, p62 ve LAMP1 için pozitif olmalıdır; Neden 0 noktalı çok fazla hücre var? Bunun nedeni, LC3 sinyalinin birlikte lokalizasyon için yeterince parlak olabilmesidir, ancak bunun dikkate alınması için gerekli olan tepe maskesinin (Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 4)) belirlediği eşiğe gelmeyebilir yer. Burada sunulan protokol, otofajik akıyı ölçmek için LC3 noktalamasını saymak için MIFC&#39;yi ve üç otofaji belirteçinin birlikte lokalizasyonunu kullandı. Bazal şartlar altında (kontrol örneği), otofagozom sayısı düşük ve &quot;Yüksek Noktalar&quot; ile çok az hücre bulundu. Otofagozom / lizozom füzyonunu inhibe eden klorokin ilavesi ile LC3 lekelerinin sayısında bir artış olmuştur. Lizozom otofagozomu ve otofagozomda bulunan p62&#39;yi parçalayamadığından, LC3, p62 ve LAMP1 otolizozom birikiminin birlikte lokalizasyonunda artışa neden olur. Bu etki, besleyici starvatIyon, otofajiye neden olur. Bununla birlikte, klorokin ilavesi olmaksızın, büyük olasılıkla otofajik döngü oranındaki artıştan ötürü otofogozom sayısındaki belirgin bir artış görülmemiştir. Hücreler klorokin varlığında aç bırakıldığında, açlığın otofajik akıyı arttırdığı sonucunu destekleyen otofagozomların birlikte lokalizasyonunda ve sayısında bir artış oldu. EBSS, otofajinin güçlü bir uyarıcısı olarak bilinir. Dolayısıyla, artışın büyük olması bekleniyor. Otofajiyi indüklemek için uyuşturucu indüksiyonu gibi başka bir yöntem kullanılırsa, kontrol ve muamele edilmiş numuneler arasındaki fark daha ince olabilir. Bu özel protokol, insan hücre dizilerindeki otofajiyi ölçmek üzere tasarlanmıştı, ancak tahlil, bu türler için antikora geçiş yaparak diğer türlere adapte edilebilir. Buna ek olarak, analiz yöntemi, birlikte lokalizasyonu gerektiren herhangi bir hücre içi uygulama için kullanılabilirÜç prob / belirteçten oluşur.

Bundan sonra otofajinin olarak anılacaktır Macroautophagy, zarar görmüş ya da işlevsel parçalar, uzun ömürlü proteinler ve organeller lizozom ile parçalanan ve 1 geri dönüştürülür edildiği bir katabolik geçiş yoludur. Otofaji, bir otofagosom oluşumunu içeren dinamik, çok aşamalı bir süreçtir; Otoflikozomun lizozom ile kaynaşması, otolizozomun oluşturulması; Ve otolizozomun içeriğinin bozunması 2 . Membran sistemlerinde otofajiyi tanımlamak için kullanılan kritik biyolojik belirteç otofajozomal membranı oluşturan mikrotübüle bağlı protein 1A / 1B-hafif zincir 3 (LC3) &#39;dur. Otofaji sırasında sitosolik LC3-1, LC3-II oluşturmak üzere fosfatidiletanolamine konjüge edilir; Daha sonra LC3-II, otofajozomal zar 3 içine dahil edilir. Otofajik akı için yaygın olarak kullanılan bir diğer marker, otofaj reseptör sekestozomu 1 (SQSTM1, p62) olup, bunlar fiziksel olarak liAutophagic membran 4 , 5&#39;e otofajik yük getirir. Geleneksel olarak otofajiyi ölçmek için kullanılan yöntemler Western lekeleri ve floresan mikroskobu 7&#39;dir . Ancak bu yöntemlerin hiçbirinin &quot;altın standart&quot; olarak kabul edilir 2, bu tekniklerin her ikisi ile ilişkili zorluklar vardır 6 olarak. Western lekeleri ortalama verir çünkü homojen bir örnek kullandıklarından, gözlemciler tek tek hücrelerde neler olduğunu göremezler. Öte yandan, flüorür mikroskobu, tek hücre seviyesinde bir gözlemci bilgi verir, ancak, objektif ve istatistiksel olarak titiz değerlendirmelerin elde edilmesini zorlaştıran üretim kapasitesinden yoksundur. Son yıllarda, multispektral görüntüleme akış sitometrisi (MIFC, Malzeme Tablosuna bakınız) ile LC3 ve p62 ölçümü popülasyon kazanmaktadırNiceliksel gücü, yüksek işleme kapasitesi, çoklama potansiyeli ve her hücrenin imajını oluşturma yeteneği nedeniyle çok sayıda. Otofaji kendi kendine analiz yazılımıyla (bkz . Malzemelerin Tablosu ) birlikte kullanarak otofajiyi ölçmek için en yaygın kullanılan yöntemlerden biri, LC3 punktasının veya otofagozomların 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14&#39;ün nokta sayımı yoluyla yapılır , 15 , 16 , 17 . Bununla birlikte, otofagozomlarda bir artış, mutlaka, otofajide bir artış olduğu anlamına gelmez çünkü süreçte bir blokaj da gösterebilir 2 . LC3-II cirosu, varlıklardaki hücreleri analiz ederek otofajik akıyı ölçmek için yararlı bir parametredir veKlorosin gibi bir lizozomal bozunma önleyicisinin bulunmaması. Klorokuin, böylece 18 oluşabilir lizozomal bozulması önce otofajik akı durdurulması ile otofajinin derecesinin bir ölçüsü olarak, otofagozom oluşumunun miktarının belirlenmesine izin veren lizozoma otofagozom füzyonunu inhibe eder. Buna ek olarak, p62 öncelikle otofaji ile bozundur ve otofagozomun ve içeriğinin lizozomal parçalanması engellendiğinde, p62&#39;nin birikimi 17 , 19 olması beklenir. Otofaji çok aşamalı bir süreçtir ve LC3 veya p62&#39;nin tek başına ölçümü, hücrelerde olup bitenenin tam bir resmini vermez. Yakın tarihli yayınlar, otolizozomun eşzamanlı oluşumunu inceleme ihtiyacını vurgulamıştır 2 , 17 , 20 , 21 . MIFC17, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 - lizozom 15 otofagozom ko-lokalizasyonunu görüntüleme ile autolysosome oluşumunu ölçmek için benzersiz mümkün. Buna ek olarak, P62 ve MIFC kullanılarak LC3 eş yerleşimi de otofajik akı 5 ölçmek için incelenmiştir. Referans analiz yazılımında, birlikte yerelleştirmeyi ölçen &quot;özellik&quot;, &quot;Parlak Detay Benzerliği R3&quot; (BDS) olarak adlandırılır ve iki görüntünün küçük, parlak görüntü ayrıntılarını karşılaştırmak için özel olarak tasarlanmıştır. BDS, 3 piksel veya daha düşük bir yarıçapa sahip lokalize parlak noktaların log dönüşümlü Pearson korelasyon katsayısıdır; Başka bir deyişle, BDS hesaplar o derecesiİki farklı flüoresan kanalından pikseller verlapping. Parlak noktalar ya birbiriyle ilişkilendirilir (diğer bir deyişle, aynı uzaysal konum) veya ilişkisizdir ( yani, farklı uzaysal yerler). Bu nedenle korelasyon katsayısı 0 (korelasyonsuz) ile 1 (mükemmel korelasyon) arasında değişir. Katsayı aralığı sıfırdan sonsuza 26 , 27&#39;ye çıkarmak için log dönüşümlüdür. BDS tek başına yeterli olmayabilir; Rajan ve ark. Sadece BDS&#39;nin kullanılması yanlış-pozitif veya yanlış-negatif sonuçlara neden olabileceğini bulmuştur 21 . BDS, otofajinin iki belirteçinin birlikte lokalizasyonunu değerlendirir, ancak otofagozom sayısını dikkate almaz. Otofagozom sayısını açıklamak için Rajan ve ark. LC3 puncta 21&#39;in nokta sayımını içermektedir. Rajan ve ark. BDS&#39;ye karşı LC3 nokta sayımının bir iki değişkenli dağılım grafiğini kullanarak önerdi. Bu iki değişkenli arsa kullanılarak iki popülasyonİlk tanımlanan: biri yüksek seviyede LC3 lekelerine sahip hücreler ve diğeri düşük seviyeli LC3 lekelerine sahip hücreler. Yüksek eş-lokalizasyonu (yani otolizozomlara birikmesi), düşük (diğer bir deyişle, otofagozomların birikmesi) eş-lokalizasyonu ve hücreler ile hücrelerin: Yüksek LC3 nokta popülasyonu ayrıca iki popülasyona sınıflandırılmıştır. Bu iki değişkenli arsa, az sayıda otofagozomlu hücreler ile otofagozom birikimi ve / veya otolizozomlar 21 olan hücreleri ayırt etmeyi sağlar. Şimdiye kadar, LC3, p62 ve LAMP1&#39;in (lizozomal markör) eş zamanlı birlikte lokalizasyonu, MIFC tamamlayıcı analiz yazılımında tek bir &quot;Özellik Türü&quot; kullanarak mümkün değildi (Malzeme Tablosuna bakın). Bununla birlikte, kısa süre önce 6.1 sürümünde tanıtılan yeni bir özellik, Parlak Ayrıntı Ayrıntılı Yerleştirme 3 (BDC3) olarak adlandırılır. BDC3, üç görüntünün her birinden parlak ayrıntı resimlerini karşılaştırır (bu durumda, LC3, p62 ve LAMP1) ve üç sondanın birlikte lokalizasyonunu niceleştirir ( yani, LC3, p62 ve LAMP1). BDC3 özelliği, Pearson korelasyon katsayısını üç görüntüye kadar genişletmek için hesaplar. Üç görüntünün parlak noktaları ya korelasyonlu ya da korelasyonsuz olduğundan, korelasyon katsayısı 0 (korelasyonsuz) ile 1 (mükemmel korelasyon) arasında değişir. Katsayı, 0 ile sonsuz arasındaki dinamik aralığı arttırmak için günlüğe dönüştürülür. BDS özelliğini BDC3 özelliğiyle değiştirerek, Rajan ve ark. Tarafından sunulan analiz yöntemi, Autophagy&#39;yi aynı anda bir sistemde ölçmek için en çok kullanılan üç markörü bir araya getirebilir. Otofajinin bu üç belirteçinin tek bir deneyde birlikte lokalize edilmesi, otofajinin indüksiyonunda ve düzenlenmesinde yeni anlayışlara yol açabilir. Aşağıdaki protokol, Jurkat hücrelerinde otofaji indirecek adımları özetlemektedir; Hücreleri LC3, p62 ve LAMP1 antikorları ile etiketleyin; Multisp hakkında veri edininEktral görüntüleme akış sitometresi; Ve otofajik akıyı değerlendirmek için verileri analiz eder.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1012">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">15 mL centrifuge tube</td>
			<td style="width:244px;">Falcon</td>
			<td style="width:161px;">352096</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">50 mL centrifuge tube</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352070</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;">AF647 labeled Donkey anti-Mouse - IgG&#160;</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>A-31571</td>
			<td style="width:299px;">Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 647. Concntration 2mg/mL. https://www.thermofisher.com/antibody/product/Donkey-anti-Mouse-IgG-H-L-Secondary-Antibody-Polyclonal/A-31571</td>
		</tr>
		<tr height="62">
			<td height="62" style="height:62px;width:308px;">anti-human CD107a-PE (LAMP1)</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328607</td>
			<td style="width:299px;">Clone H4A3. Concentration 400 &#181;g/mL. http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;">anti-human CD45- AF488</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304017</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30. http://www.biolegend.com/alexa-fluor-488-anti-human-cd45-antibody-2738.html</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;">anti-human CD45- PE&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304008</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30.&#160; http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd45-antibody-708.html</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;">anti-human CD45-AF647&#160;</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>304018</td>
			<td style="width:299px;">Clone HI30.&#160; http://www.biolegend.com/alexa-fluor-647-anti-human-cd45-antibody-2739.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Anti-LC3 (Human) mAb clone 4E12</td>
			<td>MBL International Corporation</td>
			<td>M152-3</td>
			<td style="width:299px;">Clone 4E+12.&#160; Concentration 2 mg/mL.&#160; https://www.mblintl.com/products/m152-3</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Anti-SQSTM1 / p62 antibody [EPR4844] - Autophagosome Marker (Alexa Fluor 488)</td>
			<td>abcam</td>
			<td>ab185015</td>
			<td style="width:299px;">Clone EPR4844.&#160; Concentration 0.5 mg/mL.&#160; http://www.abcam.com/sqstm1-p62-antibody-epr4844-autophagosome-marker-alexa-fluor-488-ab185015.html</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Chloroquine diphosphate Salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C6628-25G</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">Cleanser - Coulter Clenz&#160;</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>8546931</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Cleanser.&#160; https://www.beckmancoulter.com/wsrportal/page/itemDetails?itemNumber=8546931#2/10//0/25/1/0/asc/2/8546931///0/1//0/</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">DAPI Stain 5mg/mL</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>508741</td>
			<td style="width:299px;">http://www.emdmillipore.com/US/en/product/DAPI-Stain---CAS-28718-90-3---Calbiochem,EMD_BIO-508741</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:308px;">Debubbler - 70% Isopropanol</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>1.3704</td>
			<td style="width:299px;">Fill container with 200 mL of Debubbler.&#160; http://www.emdmillipore.com/US/en/product/2-Propanol-70%25-%28V%2FV%29-0.1-%C2%B5m-filtred,MDA_CHEM-137040?ReferrerURL=https%3A%2F%2Fwww.google.com%2F</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 10X</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-2010-B</td>
			<td style="width:299px;">&#160;Ca++Mg++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">PBS Ca++Mg++ Free&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Earle&#39;s Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14155</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Fetal Bovine Serum</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30071.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="241">
			<td height="241" style="height:241px;width:308px;">Formaldehyde, 10%, methanol free, Ultra Pure</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>04018</td>
			<td style="width:299px;">This is what is used for the 4% and 1% Formalin. CAUTION: Formalin/Formaldehyde toxic by inhalation and if swallowed.&#160; Irritating to the eyes, respiratory systems and skin.&#160; May cause sensitization by inhalation or skin contact. Risk of serious damage to eyes.&#160; Potential cancer hazard.&#160; http://www.polysciences.com/default/catalog-products/life-sciences/histology-microscopy/fixatives/formaldehydes/formaldehyde-10-methanol-free-pure/</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Hanks&#39; Balanced Salt Solution 1X</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14175</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Jurkat, Clone E6-1 (ATCC TIB-152)</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>TIB-152</td>
			<td style="width:299px;">https://www.atcc.org/products/all/TIB-152.aspx</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">MEM Non-Essential Amino Acids 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30238.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="201">
			<td height="201" style="height:201px;width:308px;">MIFC - ImageStreamX Mark II</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">A 2 camera ImageStreamX Mark II eqiped with the 405nm, 488nm, and 642nm lasers was used. http://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/imagestreamx-Mark-ii-imaging-flow-cytometer/VaSb.qB.QokAAAFLzRop.zHe,nav?cid=BI-XX-BDS-P-GOOG-FLOW-B325-0006</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">MIFC analysis software - IDEAS 6.2</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">The companion software to the MIFC (ImageStreamX MKII).&#160; IDEAS version 6.2</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">MIFC software - INSPIRE</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>100220</td>
			<td style="width:299px;">This is the software that runs the MIFC (ImageStreamX MKII). INSPIRE version 200.1.388.0</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">PE anti-human CD107a (LAMP-1) Antibody clone H4A3</td>
			<td>BioLegend</td>
			<td>328608</td>
			<td style="width:299px;">http://www.biolegend.com/pe-anti-human-cd107a-lamp-1-antibody-4967.html</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:308px;">Penicllin/Streptomycin/Glutamine solution 100X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SV30082.1</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:308px;">Rinse - Ultrapure water or deionized water</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td style="width:299px;">You can use any ultrapure water or deionized water.&#160; Fill container with 900 mL of Rinse.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">RPMI-1640 Medium 1X</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30027.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Sheath - PBS</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>BSS-1006-B</td>
			<td style="width:299px;">This is the same as Dulbecco&#39;s Phosphate Buffered Saline 1X&#160; Ca++MG++ free.&#160; Fill container with 900mL of Sheath.</td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">Siliconized polypropylene microcentrifuge tubes</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>02-681-320</td>
			<td style="width:299px;">Fisherbran Siliconized Low-Retention Microcentrifuge Tubes 1.5 mL. https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-siliconized-low-retention-microcentrifuge-tubes-8/p-193936</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Sodium Pyruvate solution (100mM)</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30239.01</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:308px;">Sterilizer - 0.4-0.7% Hypochlorite</td>
			<td>VWR</td>
			<td>JT9416-1</td>
			<td style="width:299px;">This is assentually 10% Clorox bleach that can be made by deluting Clorox bleach with water.&#160; Fill container with 200 mL of Sterilzer.</td>
		</tr>
		<tr height="121">
			<td height="121" style="height:121px;width:308px;">System Calibration Reagent - SpeedBead</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>400041</td>
			<td style="width:299px;">Each tube holds ~10 mL.&#160; https://www.emdmillipore.com/US/en/life-science-research/cell-analysis/amnis-imaging-flow-cytometers/support-training/XDqb.qB.wQMAAAFLBDUp.zHu,nav&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">T75 flask</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>353136</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:308px;">TRITON X-100, PROTEIN GRADE Detergent, 10% Solution, Sterile-Filtered</td>
			<td>MilliporeSigma</td>
			<td>648463-50ML</td>
			<td style="width:299px;">http://www.emdmillipore.com/US/en/product/TRITON-X-100,-PROTEIN-GRADE-Detergent,-10%25-Solution,-Sterile-Filtered---CAS-9002-93-1---Calbiochem,EMD_BIO-648463</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:308px;">Water, Cell Culture Grade&#160;</td>
			<td>HyClone</td>
			<td>SH30529.03</td>
			<td style="width:299px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessing autophagic flux by measuring lc3, p62, and lamp1 co-localization using multispectral imaging flow cytometry

Otofaji, büyüme ve farklılaşma esnasında biriken normal veya işlevsel olmayan hücresel bileşenlerin lizozom ile parçalanması ve geri dönüşüme tabi tutulduğu katabolik bir yoludur. Otofaji sırasında, sitoplazmik LC3 proteini lipidize edilir ve otofagosomatik membranlara işe alır. Otofagozom daha sonra autosfosome vezikülün parçalanması ve içeriğinin bulunduğu otolizozomu oluşturmak için lizozom ile birleşir. LC3&#39;e bağlanan ubiquitin ile ilişkili protein p62, otofajik akıyı izlemek için de kullanılır. Otofajyondan geçen hücreler, p62, LC3 ve lizozomal belirteçlerin birlikte lokalizasyonunu göstermelidir. İmmünofloresan mikroskobu, LC3 punktasını, p62&#39;yi ve / veya lizozomları hücre başına bazında görsel olarak tanımlamak için kullanılmıştır. Bununla birlikte, objektif ve istatistiksel olarak titiz bir değerlendirme yapmak zor olabilir. Bu problemlerin üstesinden gelmek için multispektral görüntüleme akım sitometrisi ve parlak de-Üç otofaji belirteçlerinden (LC3, p62 ve lizozomal LAMP1) kuyruk görüntüleri üretir ve otofajiyi objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçmek için LC3 nokta sayımı ile kombinasyon halinde birlikte lokalizasyonunu nicelendirir.

Bu analiz metodu, otofajik akışını değerlendirmek için birden fazla özellik kullanmaktadır. Nihai iki yönlü çizimi tam olarak anlamak için, önce bireysel analiz özellikleri araştırılmalıdır. Otofagozomların sayımı, otofajiyi ölçmek için mantıklı bir yöntemdir; Bununla birlikte, LC3 noktalannın boyutu / şekli / parlaklığı, hücreler arasında büyük ölçüde değişebilir. Varyasyon, otofagozomları manuel olarak veya analiz yazılımında bir nokta sayımı özelliği kullanarak saymayı zorlaştırabilir. Bu nedenle, otofagosomlardaki bu büyük değişkenlik nedeniyle nokta sayma özelliği mükemmel olmayacaktır. Bununla birlikte, çoğu nokta hücresinde iyi bir nokta sayımı özelliği çalışacaktır 26 . Şekil 3 , farklı spot maskeleri kullanan Jurkat hücrelerinde LC3 punktasının spot maskeleme örneğini göstermektedir. Bu veri seti için seçilen nokta sayımı özelliği, Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 4) _4&#39;tür; bu, nokta sayımı özelliğinin nokta(Parlak, 4) nokta-hücre arka plan oranıyla 11 kanalında (Ch11-LC3-AF647) varsayılan kanal 11 maskesinde (M11) tanımlanan ak maskesi. Şekil 4 , anti-LC3-AF647 ile etiketlenmiş Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved + Kloroquin Jurkat hücreleri için ortalama nokta sayısı için nokta sayım histogramlarını ve temsili görüntüleri göstermektedir. Kontrol ve Açlık ortalaması spot sayıları önemli ölçüde farklı değildir; Klorokuin ilavesi ile, Starved + Chloroquine&#39;e kıyasla Control + Chloroquine ortalamasında büyük bir fark vardır. Araştırılacak bir sonraki özellik BDC3&#39;tür. BDC3, bu durumda, LC3, p62 ve LAMP1 olmak üzere üç belirteç / probun ortak lokalizasyonunun bir ölçümüdür. Şekil 5A - 5D , anti-p62-AF488 ile etiketlenmiş Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved ve Starved + Chloroquine Jurkat hücreleri için BDC3 histogramlarını göstermektedir, Anti-LAMP1-PE ve anti-LC3-AF647. Kontrol ortalama ile Açlığa ortalam arasında bir kayma vardır, bunun yanında Kontrol + Klorokin ortalama + Klorokin ortalaması anlamına gelir. Bununla birlikte, Şekil 5E ortalama BDC3 puanlardan hücre görüntüleri bakarak - 5H, inanmak için bir neden olabilir histogramlar daha örnekler arasında büyük bir fark vardır. Bunun nedeni, BDC3&#39;ün aynı lokalize olduğu otofaji organellerin sayısını göz önünde bulundurmaması ve aynı BDC3 skoru için otofagosom sayısının büyük ölçüde değişmesine neden olmasıdır. Çoğu durumda, üç prob arasında da çakışma vardır, çünkü bazal seviyelerde bile, p62, LAMP1 ve LC3, belirli bir seviyede, hücrelerdeki benzer bölgelerde birlikte lokalize olmalı veya kalmalıdır. Aksine, birlikte lokalize edilmemesi gereken üç probun bir örneği, Şekil 6&#39;da gösterilen Starved + Chloroquine örneği için anti-p62-AF488, anti-LC3-AF647 ve DAPI nükleer boyadır. &lt;/ P&gt; Nokta sayımı özelliği ve BDC3 özelliği birleştirildiğinde, çeşitli örnek / koşulları ayırt etme becerisini geliştiren farklı alt popülasyonların varlığı belirgindir. Şekil 7 , dört örnek için BDC3 p62 / LAMP1 / LC3&#39;e karşı LC3 spot sayımının iki değişkenli grafiğini göstermektedir: Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved ve Starved + Chloroquine. Kontrol örneği üç popülasyon için geçiş stratejisini belirlemek için kullanıldı: Düşük Noktalar, Yüksek Nokta / Düşük BDC3 ve Yüksek Nokta / Yüksek BDC3. Kontrol örnekleri, hücrelerin% 98&#39;den fazlasının 1 veya daha az noktaya sahip olduğunu göstermiştir. Yüksek Nokta / Düşük BDC3 ve Yüksek Nokta / Yüksek BDC3 arasındaki sınır, BDC3 skoru 1 olarak ayarlandı, çünkü Kontrol örneğinin% 91&#39;den fazlası bir BDC3 puanı 1&#39;den daha düşüktü. İki değişkenli parseller için sonuçların özeti Tablo 1&#39;de gösterilmektedir. yaş = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Şekil 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig1.jpg" /> Şekil 1: MIFC Enstrüman Ayarı. Protokolün 8. adımında özetlenen, bu deney için kullanılan MIFC cihaz ayarlarının bir ekran görüntüsü. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig1large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="şekil 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig2.jpg" /> Şekil 2: Analiz Yazılımı Geçitleme Stratejisi. Protokolün 9. adımında ana hatlarıyla verilen analiz yazılımları geçiş planının bir ekran görüntüsü. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig2large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> Fig3.jpg &quot;/&gt; Şekil 3: LC3 Nokta Maskelemesi. Jurkat hücre görüntüleri ve maskeleri, nokta sayımı özelliğini oluşturmak için kullanılıyordu. Gösterilen BrightField (BF), LC3-AF647, Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 2), Zirve (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 4), Zirve (M11, Ch11-LC3-AF647 , Parlak, 5), Spot (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 5,3,1) ve Nokta (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 6,2,1). Gösterilen tüm hücreler için en iyi sonucu veren maske Peak&#39;ti (M11, Ch11-LC3-AF647, Bright, 4). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig3large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig4.jpg" /> Şekil 4: LC3 Spot-sayımlı Histogramlar. Nokta sayımı özelliği Spot Count_Peak (M11, Ch11-LC3-AF647, Parlak, 4) _4 ve LC3-AF647 Kontrol ( A , açık mavi), Kontrol + Klorokin için spot-sayım histogramları kullanılarakE ( B , mavi), Starved ( C , pembe) ve Starved + Chloroquine ( D , kırmızı). Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved ve Starved + Chloroquine için ortalama nokta sayısı sırasıyla 0.07, 1.13, 0.10 ve 2.77&#39;dir. BF, LC3-AF647 (kırmızı), DAPI nükleer boya (mavi) ve ortalama nokta sayımı için temsili hücrelerin LC3-AF647 ve DAPI görüntüsünün bir bileşimi Kontrol ( E , 0 noktalar), Kontrol + Klorokin F , 1 nokta), Starved ( G , 0 lekeler) ve Starved + Chloroquine ( H , 3 lekeler). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig4large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig5.jpg" /> Şekil 5: p62 / LAMP1 / LC3&#39;ün BDC3 Histogramları. BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 histogramlarıKontrol ( A , açık mavi), Kontrol + Klorokin ( B , mavi), Starved ( C , pembe) ve Starved + Chloroquine ( D , kırmızı). Kontrol, Kontrol + Klorokin, Starved ve Starved + Chloroquine için ortalama BDC3 skoru sırasıyla 0.57, 0.82, 0.74 ve 0.98&#39;dir. BF; P62-AF488 (yeşil); LAMP1-PE (sarı); LC3-AF647 (kırmızı); Ve ortalama BDC3 için temsili hücrelerin p62-AF488, LAMP1-PE ve LC3-AF647 görüntülerinin bir bileşimi, Kontrol ( E ), Kontrol + Kloroquin ( F ), Starved ( G ) ve Starved + Chloroquine H ). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig5large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig6.jpg" /> Şekil 6: p62 / L&#39;nin BDC3 HistogramlarıStarved + Chloroquine Örneği için C3 / DAPI. ( A ) Starved + Chloroquine örneği için BDC3 p62 / LC3 / DAPI histogramı gösterilmektedir. BDC3 ortalama puanı 0.07&#39;dir. ( B ) BF; P62-AF488 (yeşil); LC3-AF647 (kırmızı); DAPI (mavi); Ve Starved + Chloroquine örneği için ortalama BDC3 için temsili hücrelerin p62-AF488, LC3-AF647 ve DAPI görüntülerinin bir bileşimi gösterilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig6large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55637/55637fig7.jpg" /> Şekil 7: LC3 Nokta Sayısı ile BDC3 p62 / LAMP1 / LC3 arasındaki İki Değişkenli Grafikler. ( A ) Control, Control + Chloroquine, Starved ve Starved + Chloroquine Jurkat hücreleri için LC3 spot sayısına karşılık BDC3 p62 / LAMP1 / LC3&#39;ün iki değişkenli parselleri. ( B ) BF; P62-AF488 (yeşil); LAMP1-PE (sarı); LC3-AF647 (kırmızı); Ve Starved + Chloroquine örneği için üç bölgeden ( yani, Düşük Noktalar, Yüksek Noktalar / Düşük BDC3 ve Yüksek Nokta / Yüksek BDC3) p62-AF488, LAMP1-PE ve LC3-AF647 görüntülerinin bir bileşimi gösterilmiştir. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55637/55637fig7large.jpg" target="_blank">Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> Hücre Sayısı </td><td> Parlak Ayrıntılı Kolokalizasyon 3 Ortalama </td><td> Nokta Sayısı LC3 Ortalama </td><td> Düşük Nokta </td><td> Yüksek Spot / Düşük BDC3 </td><td> Yüksek Spot / Yüksek BDC3 </td></tr><tr><td> Kontrol </td><td> 439 </td><td> 0.57 </td><td> 0.07 </td><td> 98.2 </td><td> 1.8 </td><td> 0.0 </td></tr><tr><td> Kontrol + Klorokin </td><td> 1432 </td><td> 0,82 </td><td> 1.13 </td><td> 68.9 </td&gt; <td> 19.5 </td><td> 11.7 </td></tr><tr><td> hasret </td><td> 1204 </td><td> 0.74 </td><td> 0.10 </td><td> 98.4 </td><td> 0.6 </td><td> 1.0 </td></tr><tr><td> Starved + Chloroquine </td><td> 1811 </td><td> 0.98 </td><td> 2.77 </td><td> 32.1 </td><td> 36.9 </td><td> 31.0 </td></tr></tbody></table> Tablo 1: Jurkat LC3 Noktası Özeti BDC3 P62 / LAMP1 / LC3 değişkenli grafiği Sayısı

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry at JoVE.com

Assessing Autophagic Flux by Measuring LC3, p62, and LAMP1 Co-localization Using Multispectral Imaging Flow Cytometry

Burada, otofajiyi objektif, kantitatif ve istatistiksel olarak sağlam bir şekilde ölçmek için, 3 autofagy markörün parlak detaylı görüntülerini karşılaştıran ve LC3 nokta sayımı ile birlikte lokalizasyonunu niceleyen analitik bir özelliğe sahip multispektral görüntüleme akış sitometrisi kullanılmıştır.

Multifektral Görüntüleme Akış Sitometrisi Kullanılarak LC3, p62 ve LAMP1 Birlikte Lokalizasyonu Ölçülerek Otofajik Fluxın Değerlendirilmesi

Autophagy is a catabolic pathway in which normal or dysfunctional cellular components that accumulate during growth and differentiation are degraded via ...

Research

JoVE Journal

Biology

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

IP FCM: Sitometrisi ile Algılandı Immunoprecipitation

Immunoprecipitation detected by flow cytometry (IP-FCM) is an efficient method for detecting and quantifying protein-protein interactions. The basic ...

Quantitative Measurement of GLUT4 Translocation to the Plasma Membrane by Flow Cytometry

Akış Sitometri Plazma Membran GLUT4 Translokasyon Kantitatif Ölçüm

Glucose is the main source of energy for the body, requiring constant regulation of its blood concentration. Insulin release by the pancreas induces ...

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

Fare Mayotik Hücreler Sitometrisi Arıtma

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Measuring Cell Cycle Progression Kinetics with Metabolic Labeling and Flow Cytometry

Metabolik Etiketleme ve Flow Sitometri ile Hücre Döngüsü İlerleme Kinetik Ölçüm

Precise control of the initiation and subsequent progression through the various phases of the cell cycle are of paramount importance in proliferating ...

Optimized Staining and Proliferation Modeling Methods for Cell Division Monitoring using Cell Tracking Dyes

Cep Takip Boyalar kullanarak Hücre Bölünmesi İzleme için optimize Boyama ve Çoğalma Modelleme Yöntemleri

Fluorescent cell tracking dyes, in combination with flow and image cytometry, are powerful tools with which to study the interactions and fates of ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Hücre içi Ca Ölçme<sup&gt; 2 +</supDört Teknikleri ile İnsan rm&gt; Değişiklikler: Konvansiyonel Florometre, Akış Florometre, Sitometrisi ve Tek Hücre Görüntüleme Durduruldu

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Identification of a Murine Erythroblast Subpopulation  Enriched in Enucleating Events by Multi-spectral Imaging Flow Cytometry

Multi-spektral Görüntüleme Sitometrisi ile Enucleating Olaylar bir Kemirgen erythroblast ICSI&#39;nin Zenginleştir tanımlanması

Erythropoiesis in mammals concludes with the dramatic process of enucleation that results in reticulocyte formation. The mechanism of enucleation has not ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Yetişkin Fare Kalvaryal Kemik İliği içinde Hematopoietik kök hücrelerin Vivo 4-Boyutlu Takip

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...

Cytosolic Calcium Measurements in Renal Epithelial Cells by Flow Cytometry

Sitometrisi ile Böbrek Hücrelerine sitozolik kalsiyum Ölçümleri

A variety of cellular processes, both physiological and pathophysiological, require or are governed by calcium, including exocytosis, mitochondrial ...