Name: protein-trna agarose gel retardation assays for the analysis of the n6-threonylcarbamoyladenosine tcda function
Uploaded: 2017-06-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function at JoVE.com

MCV is lid van het CIB Intramurale Programma &quot;Moleculaire Machines voor Beter Leven&quot; (MACBET). Het onderzoek dat leidde tot deze resultaten heeft financiering ontvangen van het Spaanse Instituto de Salud Carlos III (PI12 / 01667 naar MCV), het Spaanse Ministerie van Economie en Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R en SAF2015-72961-EXP naar MCV ), De regionale regering van Madrid (S2010 / BD-2316 tot MCV) en de Europese Commissie (kaderprogramma 7 (KP7)) project ComplexINC (contract nr. 279039 naar MCV). De financiers hadden geen rol in studieontwerp, dataverzameling en analyse, beslissing om te publiceren of voorbereiden van het manuscript.

Voorzichtigheid: Raadpleeg alle relevante veiligheidsinformatiebladen (MSDS) voor gebruik. Verscheidene van de in dit protocol gebruikte chemicaliën zijn giftig en bijtend. Gebruik geschikte praktijken bij het uitvoeren van de extractie van tRNA met behulp van fenol, met inbegrip van het gebruik van een afzuigkap en persoonlijke beschermende uitrusting (veiligheidsbril, handschoenen, laboratoriumjas, broek met volledige lengte, gesloten-schoenen, enz .). Dit protocol gebruikt een niet-toxische nucleïnezuurvle...

<ol>
	<li>Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+retardation+assay.">The gel retardation assay.</a> Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).</li><li>L&#243;pez-Estepa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+and+small-angle+X-ray+analysis+of+CsdL/TcdA+reveal+a+new+tRNA+binding+motif+in+the+MoeB/E1+superfamily.">The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily.</a> Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).</li><li>Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cyclic+form+of+N6-threonylcarbamoyladenosine+as+a+widely+distributed+tRNA+hypermodification.">A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification.</a> Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).</li><li>Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+protein-protein+interactions+within+the+Cysteine+Sulfinate+Desulfinase+Fe-S+cluster+biogenesis+system.">Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system.</a> J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).</li><li>Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+heteromeric+CsdA-CsdE+cysteine+desulfurase,+assisting+Fe-S+cluster+biogenesis+in+Escherichia+coli.">Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).</li><li>Fried, M. G., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+studies+of+the+cyclic+AMP+receptor+protein-DNA+interaction.">Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction.</a> J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).</li><li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions:+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system.">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assays+for+RNA-protein+complexes.">Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).</li><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift.">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li><li>Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+mobility+shift+assays+to+detect+protein-RNA+interactions.">Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions.</a> Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).</li><li>Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+agarose+gel+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+quantitating+protein:+RNA+interactions.">Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions.</a> Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).</li><li>Hagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-filtration+chromatography.">Gel-filtration chromatography.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li></ol>

De hierin beschreven eiwit-tRNA agarose gel retardatie-analyse kan op een aantal manieren worden gemodificeerd. Ten eerste kan het percentage agarose in de gel verminderd worden om de scheiding en visualisatie van eiwit-tRNA complexen aanzienlijk groter te maken dan de hier geanalyseerde (120 kDa). Ten tweede, als het doelproteïne thermolabiel is, moeten extra voorzorgsmaatregelen worden genomen om ervoor te zorgen dat de temperatuur onder de maximale aanvaardbare temperatuur wordt gehouden door het elektroforeseappara...

<html> De gel retardatie assay 1 (ook bekend als elektroforetische mobiliteitsverschuivingsassay, EMSA) is een elektroforetische methode die is ontworpen om eiwit-nucleïnezuurinteracties te bestuderen en karakteriseren. Het laat de analyse van eiwit-DNA evenals eiwit-RNA-interacties en in het bijzonder interacties tussen tRNA en tRNA-bindende eiwitten toe, met behulp van ofwel gezuiverde componenten of complexe mengsels van eiwitten ( bijvoorbeeld cellysaten) of nucleïnezuren ( bijvoorbeeld tRNA zwembaden). We hebben gelretarderingsbepalingen toegepast op de studie van de interactie tussen gezuiverd tRNA (UUU) en TcdA, een N 6- threonylcarbamoyladenosine (t 6 A) dehydratase, die de threonylcarbamoylzijketen aan A37 in de anticodonstamloop (ASL) cycliseert. Van tRNA&#39;s tot cyclisch t6 (ct 6A) 2 , 3 . TcdA staat ook bekend als CsdL 3 ,F &quot;&gt; 4. Het tcdA / csdL- gen vormt een cluster met de csdA- en csdE- genen 5 , die het cysteïne-desulfurase en de zwavelacceptor van het cysteïne-sulfinase-desulfinaat (CSD) -systeem coderen en vereist is om TcdA-functie in vivo 3 te onderhouden. De redenatie achter de gel retardatie assays is dat, terwijl vrije nucleïnezuurmoleculen snel op de voorkant van acrylamide of agarose gels migreren op grond van hun grote negatieve lading, wordt de elektroforetische mobiliteit van eiwitcomplexen van dezelfde nucleïnezuren dramatisch verminderd. De reductie van mobiliteit wordt weergegeven als een &quot;shift&quot; in de nucleïnezuur-eiwit complexen, die oplossen als discrete banden. Positief geladen en groter nucleïnezuur-eiwit complex laten een grotere verschuiving of vermindering van mobiliteit op een gel zien. Sinds lading neutralisatie van het complex is een universeel fenomeenVoor eiwit-nucleïnezuur complexen kan de gel retardatie assay worden toegepast op een breed scala van complexen en nucleïnezuur typen. De methode is eenvoudig, goedkoop en kan uitgevoerd worden in laboratoria met minimale apparatuur. Het vereist slechts kleine hoeveelheden eiwitten en tRNA. Dit is een voordeel boven alternatieve biofysische technieken, die meestal grotere hoeveelheden monster verbruiken. De gel retardatie assay is wijd gebruikt voor de studie van transcriptiefactoren. De analyse is gebruikt om bindende kinetiek, sterkte en specificiteit van transcriptiefactoren voor veel verschillende DNA-sequenties te analyseren. Het was inderdaad op dit gebied dat de EMSA voor het eerst 6 , 7 werd ontwikkeld. Gel retardatie assays met RNA 8 , 9 , 10 , 11 en tRNA moleculen zijn ook gebruikt bij ribosoom onderzoekEn analyseren, zoals we hier doen, de enzymen die tRNA nucleosiden na transcriptie wijzigen. Veel verschillende parameters beïnvloeden het resultaat van een gel retardatie assay, zoals temperatuur, kwaliteit van het eiwit en tRNA monster, en de sterkte van de binding. Een zorgvuldige planning en uitvoering van het experiment is cruciaal voor de interpretatie van de resultaten van de vrije nucleïnezuur en eiwitgebonden soorten. Hier gebruikten we het synthetische gen dat codeert voor tRNA (UUU) gekloneerd in een expressievector waarvan de promotor de Shine-Dalgarno ribosoom bindingsplaats heeft, die leidt tot de synthese van grote hoeveelheden van de tRNA 2 . Dit gedetailleerde protocol is bedoeld om een ​​duidelijke gids voor het uitvoeren van tRNA gel retardatie experimenten te geven, terwijl gebruikelijke fouten voorkomen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1054">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:433px;">E. coli BL21(DE3)</td>
			<td style="width:135px;">Novagen</td>
			<td style="width:119px;">70235</td>
			<td style="width:367px;">DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">pET23d</td>
			<td style="width:135px;">Novagen</td>
			<td style="width:119px;">69748-3</td>
			<td style="width:367px;">pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated</td>
			<td style="width:135px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">GL1703</td>
			<td style="width:367px;">Conventional LB Broth, High Salt, can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10419313</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:433px;">Incubator Shaker (Thermostated)</td>
			<td style="width:135px;">NBS</td>
			<td style="width:119px;">Excella E24&#160;</td>
			<td style="width:367px;">Any shaker incubator with temperature control can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), &#62;=99%</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Sodium acetate, anhydrous, &#62;99%</td>
			<td style="width:135px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">B4017</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, &#62;99%</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC327205000</td>
			<td style="width:367px;">Harmful if inhaled.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Centrifuge (refrigerated)</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5430</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Centrifuge (refrigerated) rotor</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5430/5430P</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:135px;">Sorvall</td>
			<td style="width:119px;">RC5C</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Centrifuge rotor</td>
			<td style="width:135px;">Sorvall</td>
			<td style="width:119px;">SLA-3000</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:433px;">Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 &#177; 0.2</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4682</td>
			<td style="width:367px;">Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Ethanol absolute for analysis, 100% v/v</td>
			<td style="width:135px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">100983</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, &#62;=99%</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71643</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4</td>
			<td style="width:135px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">48,730,250</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">HiLoad 16/60 Superdex 75&#160;</td>
			<td style="width:135px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28989333</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Agarose</td>
			<td style="width:135px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">MB1200</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl]</td>
			<td style="width:135px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">T1513</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Boric Acid</td>
			<td style="width:135px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">B0503</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Microwave</td>
			<td style="width:135px;">Haier</td>
			<td style="width:119px;">HDA-2070M</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride]</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4706</td>
			<td style="width:367px;">Corrosive to metals and skin.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:433px;">ATP [Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, &#62;=99%</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2383</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:433px;">Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, &#62;=98%</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Sodium chloride (NaCl), &#62;99%</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">BP358</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Potassium chloride (KCl), &#62;99%</td>
			<td style="width:135px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">P0515</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">NZYDNA Ladder VI</td>
			<td style="width:135px;">NZYtech</td>
			<td style="width:119px;">MB8901</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Power supply</td>
			<td style="width:135px;">Consort</td>
			<td style="width:119px;">EV261</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Electrophoresis unit</td>
			<td style="width:135px;">Real Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">RELSMINI10</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Real Safe nucleic acid staining</td>
			<td style="width:135px;">Real Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">RBMSAFE</td>
			<td style="width:367px;">20,000X stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">UV Transilluminator (G:Box/EF)</td>
			<td style="width:135px;">Syngene</td>
			<td style="width:119px;">2216498</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Coomassie Brilliant Blue G</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B0770</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Rocker (Gyro-Rocker)</td>
			<td style="width:135px;">Stuart</td>
			<td style="width:119px;">SSL3</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Mixer Vortex&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Fisher brand</td>
			<td style="width:119px;">13214789</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein-trna agarose gel retardation assays for the analysis of the n6-threonylcarbamoyladenosine tcda function

Wij tonen methoden voor de expressie en zuivering van tRNA (UUU) in Escherichia coli en de analyse door gel-retardatie assays van de binding van tRNA (UUU) tot TcdA, een N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) dehydratase, die de threonylcarbamoyl cycliseert Zijketen verbonden aan A37 in de anticodon stamlus (ASL) van tRNAs tot cyclische t 6 A (ct 6 A). Transcriptie van het synthetische gen dat codeert voor tRNA (UUU) wordt geïnduceerd in E. coli met 1 mM isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) en de cellen die tRNA bevatten worden 24 uur na inductie geoogst. De RNA fractie wordt gezuiverd met behulp van de methode voor extractie van zure fenolen. Zuiver tRNA wordt verkregen door middel van een gelfiltratiechromatografie die de kleinere tRNA-moleculen efficiënt scheidt van grotere intacte of gefragmenteerde nucleïnezuren. Om TcdA binding aan tRNA (UUU) te analyseren wordt TcdA gemengd met tRNA (UUU) en gescheiden op een native agarosegel bij 4 ° C.De vrije tRNA (UUU) migreert sneller, terwijl de TcdA-tRNA (UUU) complexen een mobiliteitsvertraging ondergaan die kan waargenomen worden bij het kleuren van de gel. We tonen aan dat TcdA een tRNA (UUU) bindend enzym is. Deze gel retardatie assay kan worden gebruikt om TcdA mutanten te bestuderen en de effecten van additieven en andere eiwitten op binding.

Grote hoeveelheden tRNA (UUU) kunnen worden verkregen door het tRNA-gen in E. coli te onderdrukken onder de controle van een sterk induceerbare T7 promotor. Het uitgedrukte tRNA (UUU) accumuleert in het cytoplasma en is verrijkt over het zwembad van natuurlijk overvloedige tRNAs. Een tweestapszuiveringsproces bestaande uit een opname- / extractiestap en een gelfiltratie- / polijststap werd gebruikt om EMSA-gehalte tRNA te verkrijgen. De opname- / extractiestap maakt gebruik van ...

Watch this Scientific Journal Video about Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function at JoVE.com

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Een protocol wordt gepresenteerd voor de productie van tRNA (UUU) en de analyse van tRNA (UUU) in complex met het enzym TcdA door middel van agarose gel retardatie assays.

Proteïne-tRNA Agarose Gel Retardatie Assays voor de analyse van de<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -threonylcarbamoyladenosine TcdA-functie

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Geautomatiseerde Acoustic Afgifte voor de seriële verdunning van Peptide agonisten in potentie Bepaling Testen

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Een efficiënte methode voor het isoleren van zeer gezuiverde RNA uit zaden voor gebruik in Quantitative Analysis Transcriptome

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analyse van supercomplexen van de Mitochondrial Electron Transport Chain met Native Electrophoresis, In-gel Assays, en Electroelution

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Gebruik van twee dimensionale semi-denatureren wasmiddel Agarose gelelektroforese te bevestigen grootte heterogeniteit van amyloïde of Amyloid-achtige vezels

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analyse van vertaling initiatie complexvorming op zoogdieren mRNAs

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Monstername en voorbehandeling van tandglazuur carbonaat voor stabiele koolstof en zuurstof isotoop analyse

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamische Proteomic en miRNA analyse van Polysomes van geïsoleerde muis hart na Langendorff perfusie

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse van eiwitcomplexen thylakoïde membraan door blauwe inheemse gelelektroforese

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Geactiveerde kruisgebonden agarose voor de snelle ontwikkeling van Affiniteits chromatografie harsen-antilichamen vangen als een casestudy

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Gebruik van time-resolved eiwit-geïnduceerde fluorescentieverbetering om stabiele lokale conformaties één α-synucleïnemonomeer tegelijk te identificeren

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...