Name: protein-trna agarose gel retardation assays for the analysis of the n6-threonylcarbamoyladenosine tcda function
Uploaded: 2017-06-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function at JoVE.com

MCV est membre du programme Intramural CIB «Molecular Machines for Better Life» (MACBET). La recherche menant à ces résultats a été financée par l&#39;Institut espagnol de santé Carlos III (PI12 / 01667 à MCV), le Ministère espagnol de l&#39;Économie et de la Compétitivité (CTQ2015-66206-C2-2-R et SAF2015-72961-EXP à MCV ), Le gouvernement régional de Madrid (S2010 / BD-2316 à MCV) et le projet ComplexINC (contrat n ° 279039 à MCV) de la Commission européenne (programme-cadre 7 (7e PC)). Les bailleurs de fonds n&#39;ont eu aucun rôle dans la conception de l&#39;étude, la collecte et l&#39;analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Attention: consultez toutes les fiches signalétiques pertinentes (fiche signalétique) avant utilisation. Plusieurs des produits chimiques utilisés dans ce protocole sont toxiques et corrosifs. Utiliser les pratiques appropriées lors de l&#39;extraction de l&#39;ARNt à l&#39;aide de phénol, y compris l&#39;utilisation d&#39;une hotte et d&#39;un équipement de protection individuelle (lunettes de sécurité, gants, blouse de laboratoire, pantalons complets, chaussures fermées, etc. ). Ce protocole utilise...

<ol>
	<li>Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+retardation+assay.">The gel retardation assay.</a> Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).</li><li>L&#243;pez-Estepa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+and+small-angle+X-ray+analysis+of+CsdL/TcdA+reveal+a+new+tRNA+binding+motif+in+the+MoeB/E1+superfamily.">The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily.</a> Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).</li><li>Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cyclic+form+of+N6-threonylcarbamoyladenosine+as+a+widely+distributed+tRNA+hypermodification.">A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification.</a> Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).</li><li>Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+protein-protein+interactions+within+the+Cysteine+Sulfinate+Desulfinase+Fe-S+cluster+biogenesis+system.">Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system.</a> J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).</li><li>Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+heteromeric+CsdA-CsdE+cysteine+desulfurase,+assisting+Fe-S+cluster+biogenesis+in+Escherichia+coli.">Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).</li><li>Fried, M. G., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+studies+of+the+cyclic+AMP+receptor+protein-DNA+interaction.">Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction.</a> J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).</li><li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions:+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system.">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assays+for+RNA-protein+complexes.">Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).</li><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift.">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li><li>Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+mobility+shift+assays+to+detect+protein-RNA+interactions.">Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions.</a> Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).</li><li>Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+agarose+gel+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+quantitating+protein:+RNA+interactions.">Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions.</a> Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).</li><li>Hagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-filtration+chromatography.">Gel-filtration chromatography.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li></ol>

L&#39;essai de retard de gel de protéine-ARNt d&#39;agarose décrit ici peut être modifié de plusieurs manières. Tout d&#39;abord, le pourcentage d&#39;agarose dans le gel peut être réduit pour permettre la séparation et la visualisation des complexes protéine-ARNt significativement plus importants que ceux analysés ici (120 kDa). Deuxièmement, si la protéine cible est thermolabile, des précautions supplémentaires doivent être prises pour que la température soit maintenue en dessous de la température max...

<html> Le test de retard de gel 1 (également connu sous le nom de test de déplacement de mobilité électrophorétique, EMSA) est une méthode électrophorétique conçue pour étudier et caractériser les interactions protéines-acides nucléiques. Il permet l&#39;analyse de l&#39;ADN protéique ainsi que des interactions protéine-ARN et, en particulier, des interactions entre les protéines de liaison à l&#39;ARNt et à l&#39;ARNt, en utilisant soit des composants purifiés, soit des mélanges complexes de protéines ( par exemple , des lysats cellulaires) ou des acides nucléiques ( p . Ex . ARNt Piscines). Nous avons appliqué des essais de retard de gel à l&#39;étude de l&#39;interaction entre l&#39;ARNt purifié (UUU) et TcdA, une N 6 -théonylcarbamoyladenosine (t 6 A) déshydratase, qui cyclise la chaîne latérale de thréonylcarbamoyle attachée à A37 dans la boucle de tige anticodon (ASL) Des tRNAs à t 6 cyclique (ct 6 A) 2 , 3 . TcdA est également connu sous le nom CsdL 3 ,F &quot;&gt; 4. Le gène tcdA / csdL forme une grappe avec les gènes csdA et csdE 5 , qui codent pour la cysteine ​​desulfurase et l&#39;accepteur de soufre du système de désulfinase de cysteine ​​sulfinase (CSD) et est nécessaire pour maintenir la fonction TcdA in vivo 3 . La raison d&#39;être des tests de retard de gel est que, bien que les molécules d&#39;acide nucléique libres migrent rapidement vers l&#39;avant de l&#39;acrylamide ou des gels d&#39;agarose en raison de leur grande charge négative, la mobilité électrophorétique des complexes de protéines des mêmes acides nucléiques est considérablement réduite. La réduction de la mobilité est visualisée comme un «décalage» dans les complexes acide nucléique-protéine, qui se résolvent sous forme de bandes discrètes. Un complexe de protéines d&#39;acide nucléique et de charge positif et plus large montre un déplacement plus important ou une réduction de la mobilité sur un gel. Puisque la neutralisation des charges du complexe est un phénomène universelPour les complexes protéine-acide nucléique, l&#39;essai de retard de gel peut être appliqué à une large gamme de complexes et de types d&#39;acides nucléiques. La méthode est simple, peu coûteuse et peut être effectuée dans des laboratoires avec un équipement minimum. Il ne nécessite que de petites quantités de protéines et d&#39;ARNt. C&#39;est un avantage par rapport à d&#39;autres techniques biophysiques, qui habituellement consomment de plus grandes quantités d&#39;échantillons. Le test de retard de gel a été largement utilisé pour l&#39;étude des facteurs de transcription. Le test a été utilisé pour analyser la cinétique de liaison, la force et la spécificité des facteurs de transcription pour de nombreuses séquences d&#39;ADN différentes. C&#39;est en effet dans ce domaine que l&#39;EMSA a été développée pour la première fois 6 , 7 . Des essais de retard de gel avec des molécules d&#39;ARN 8 , 9 , 10 , 11 et tRNA ont également été utilisés dans la recherche sur les ribosomesEt d&#39;analyser, comme nous le faisons ici, les enzymes qui modifient les nucléosides d&#39;ARNt post-transcriptionnellement. De nombreux paramètres différents affectent le résultat d&#39;un essai de retard de gel tel que la température, la qualité de l&#39;échantillon de protéines et d&#39;ARNt et la force de la liaison. Une planification minutieuse et l&#39;exécution de l&#39;expérience est cruciale pour l&#39;interprétation des résultats de l&#39;acide nucléique et des espèces liées aux protéines. Ici, nous avons utilisé le gène synthétique codant pour l&#39;ARNt (UUU) clone dans un vecteur d&#39;expression dont le promoteur n&#39;a pas le site de liaison au ribosome Shine-Dalgarno, ce qui conduit à la synthèse de grandes quantités d&#39;ARNt 2 . Ce protocole détaillé est destiné à fournir un guide clair pour effectuer des expériences de retard de gel d&#39;ARNt tout en évitant les erreurs courantes.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1054">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:433px;">E. coli BL21(DE3)</td>
			<td style="width:135px;">Novagen</td>
			<td style="width:119px;">70235</td>
			<td style="width:367px;">DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">pET23d</td>
			<td style="width:135px;">Novagen</td>
			<td style="width:119px;">69748-3</td>
			<td style="width:367px;">pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated</td>
			<td style="width:135px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">GL1703</td>
			<td style="width:367px;">Conventional LB Broth, High Salt, can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10419313</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:433px;">Incubator Shaker (Thermostated)</td>
			<td style="width:135px;">NBS</td>
			<td style="width:119px;">Excella E24&#160;</td>
			<td style="width:367px;">Any shaker incubator with temperature control can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), &#62;=99%</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Sodium acetate, anhydrous, &#62;99%</td>
			<td style="width:135px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">B4017</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, &#62;99%</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC327205000</td>
			<td style="width:367px;">Harmful if inhaled.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Centrifuge (refrigerated)</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5430</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Centrifuge (refrigerated) rotor</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5430/5430P</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:135px;">Sorvall</td>
			<td style="width:119px;">RC5C</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Centrifuge rotor</td>
			<td style="width:135px;">Sorvall</td>
			<td style="width:119px;">SLA-3000</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:433px;">Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 &#177; 0.2</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4682</td>
			<td style="width:367px;">Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Ethanol absolute for analysis, 100% v/v</td>
			<td style="width:135px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">100983</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, &#62;=99%</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71643</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4</td>
			<td style="width:135px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">48,730,250</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">HiLoad 16/60 Superdex 75&#160;</td>
			<td style="width:135px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28989333</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Agarose</td>
			<td style="width:135px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">MB1200</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl]</td>
			<td style="width:135px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">T1513</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Boric Acid</td>
			<td style="width:135px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">B0503</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Microwave</td>
			<td style="width:135px;">Haier</td>
			<td style="width:119px;">HDA-2070M</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride]</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4706</td>
			<td style="width:367px;">Corrosive to metals and skin.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:433px;">ATP [Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, &#62;=99%</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2383</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:433px;">Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, &#62;=98%</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Sodium chloride (NaCl), &#62;99%</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">BP358</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Potassium chloride (KCl), &#62;99%</td>
			<td style="width:135px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">P0515</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">NZYDNA Ladder VI</td>
			<td style="width:135px;">NZYtech</td>
			<td style="width:119px;">MB8901</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Power supply</td>
			<td style="width:135px;">Consort</td>
			<td style="width:119px;">EV261</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Electrophoresis unit</td>
			<td style="width:135px;">Real Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">RELSMINI10</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Real Safe nucleic acid staining</td>
			<td style="width:135px;">Real Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">RBMSAFE</td>
			<td style="width:367px;">20,000X stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">UV Transilluminator (G:Box/EF)</td>
			<td style="width:135px;">Syngene</td>
			<td style="width:119px;">2216498</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Coomassie Brilliant Blue G</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B0770</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Rocker (Gyro-Rocker)</td>
			<td style="width:135px;">Stuart</td>
			<td style="width:119px;">SSL3</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Mixer Vortex&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Fisher brand</td>
			<td style="width:119px;">13214789</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein-trna agarose gel retardation assays for the analysis of the n6-threonylcarbamoyladenosine tcda function

Nous démontrons des méthodes pour l&#39;expression et la purification de l&#39;ARNt (UUU) dans Escherichia coli et l&#39;analyse par des essais de retard de gel de la liaison de l&#39;ARNt (UUU) à TcdA, une N 6 -théonylcarbamoyladénosine (t 6 A) déshydratase, qui cyclise le thréonylcarbamoyle Chaîne latérale attachée à A37 dans la boucle de tige anticodon (ASL) des tRNAs à t 6 A cyclique (ct 6 A). La transcription du gène synthétique codant pour l&#39;ARNt (UUU) est induite chez E. coli avec 1 mM de ß-D-1-thiogalactopyranoside isopropylique (IPTG) et les cellules contenant de l&#39;ARNt sont récoltées 24 heures après l&#39;induction. La fraction d&#39;ARN est purifiée en utilisant la méthode d&#39;extraction du phénol acide. L&#39;ARNt pur est obtenu par une Chromatographie de filtration sur gel qui sépare efficacement les molécules d&#39;ARNt de petite taille des plus grands acides nucléiques intacts ou fragmentés. Pour analyser la liaison TcdA à l&#39;ARNt (UUU), TcdA est mélangé avec l&#39;ARNt (UUU) et séparé sur un gel d&#39;agarose natif à 4 ° C.L&#39;ARNt libre (UUU) migre plus rapidement, tandis que les complexes TcdA-ARNt (UUU) subissent un retard de mobilité qui peut être observé lors de la coloration du gel. Nous démontrons que TcdA est une enzyme de liaison à l&#39;ARNt (UUU). Ce test de retard de gel peut être utilisé pour étudier les mutants TcdA et les effets des additifs et d&#39;autres protéines sur la liaison.

De grandes quantités d&#39;ARNt (UUU) peuvent être obtenues en exprimant le gène de l&#39;ARNt dans E. coli sous le contrôle d&#39;un promoteur T7 inducible fort. L&#39;ARNt exprimé (UUU) s&#39;accumule dans le cytoplasme et est enrichi sur le pool d&#39;ARNt naturellement abondants. Un procédé de purification en deux étapes consistant en une étape de capture / extraction et une étape de filtration / polissage sur gel a été utilisé pour obtenir l&#39;ARNt EMSA. L&#3...

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Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Un protocole est présenté pour la production de l&#39;ARNt (UUU) et l&#39;analyse de l&#39;ARNt (UUU) en complexe avec l&#39;enzyme TcdA par des essais de retard de gel d&#39;agarose.

Dosages de retard de gel d&#39;agarose et de protéine-ARNt pour l&#39;analyse de la<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup&gt; -thereylcarbamoyladénosine TcdA Fonction

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Analyse des supercomplexes de la chaîne de transport d&#39;électrons mitochondriaux avec électrophorèse native, essais en gel et électroélution

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

Utilisation de deux dimensions semi dénaturation détergent Gel d’agarose pour confirmer l’hétérogénéité de la taille des fibres amyloïdes ou type amyloïde

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Toeprinting analyse de Translation Initiation complexe formé sur l’ARNm chez les mammifères

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Échantillonnage et prétraitement de l’émail dentaire Carbonate pour stables du carbone et de l’analyse des isotopes d’oxygène

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dynamique de protéomique et de miRNA analyse des Polysomes d’isolé souris coeur après Perfusion de Langendorff

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Analyse des Complexes de protéine de Membrane de Thylakoid par électrophorèse sur Gel natif bleu

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Agarose interconnectée activée pour le développement rapide des résines de chromatographie d'affinité - Capture d'anticorps comme étude de cas

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Utilisation de l’amélioration de la fluorescence induite par les protéines résolues dans le temps pour identifier les conformations locales stables un α-synucléine à la fois

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...