Name: protein-trna agarose gel retardation assays for the analysis of the n6-threonylcarbamoyladenosine tcda function
Uploaded: 2017-06-21T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function at JoVE.com

MCV, CIB İleri Düzey Programı &quot;Daha İyi Yaşam için Moleküler Makineler&quot; (MACBET) üyesidir. Bu sonuçlara götüren araştırmalar, İspanyol Enstitü Salud Carlos III (PI12 / 01667&#39;den MCV&#39;ye), İspanya Ekonomi Bakanlığı Competitividad (CTQ2015-66206-C2-2-R ve SAF2015-72961-EXP&#39;den MCV&#39;ye) tarafından finanse edildi. ), Madrid Bölge Hükümeti (S2010 / BD-2316&#39;dan MCV&#39;ye) ve Avrupa Komisyonu (Çerçeve Programı 7 (FP7)) projesi olan ComplexINC (Sözleşme No. 279039&#39;dan MCV&#39;ye). Fon sağlayanlar, çalışma tasarımı, veri toplama ve analizi, yayın yapma kararı veya el yazmasının hazırlanmasında rol oynamadı.

Dikkat: Kullanmadan önce ilgili tüm malzeme güvenlik bilgi formlarına (MSDS) başvurun. Bu protokolde kullanılan kimyasallardan birçoğu toksik ve aşındırıcıdır. Davlumbaz ve kişisel koruyucu ekipmanlar (emniyet gözlükleri, eldivenler, laboratuar önlükleri, tam pantolonlar, kapalı pabuçlar, vb .) Dahil olmak üzere fenol kullanarak tRNA&#39;nın özümlenmesinde uygun uygulamaları kullanın. Bu protokol, toksik olmayan bir nükleik asit lekesi kullanıyor. Alternatif lekelerin kullanılması...

<ol>
	<li>Scott, V., Clark, A. R., Docherty, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+gel+retardation+assay.">The gel retardation assay.</a> Methods Mol Biol. 31, 339-347 (1994).</li><li>L&#243;pez-Estepa, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+crystal+structure+and+small-angle+X-ray+analysis+of+CsdL/TcdA+reveal+a+new+tRNA+binding+motif+in+the+MoeB/E1+superfamily.">The crystal structure and small-angle X-ray analysis of CsdL/TcdA reveal a new tRNA binding motif in the MoeB/E1 superfamily.</a> Plos One. 10 (4), e0118606 (2015).</li><li>Miyauchi, K., Kimura, S., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cyclic+form+of+N6-threonylcarbamoyladenosine+as+a+widely+distributed+tRNA+hypermodification.">A cyclic form of N6-threonylcarbamoyladenosine as a widely distributed tRNA hypermodification.</a> Nat Chem Biol. 9 (2), 105-111 (2013).</li><li>Bolstad, H. M., Botelho, D. J., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+protein-protein+interactions+within+the+Cysteine+Sulfinate+Desulfinase+Fe-S+cluster+biogenesis+system.">Proteomic analysis of protein-protein interactions within the Cysteine Sulfinate Desulfinase Fe-S cluster biogenesis system.</a> J Proteome Res. 9 (10), 5358-5369 (2010).</li><li>Loiseau, L., Ollagnier-de Choudens, S., Lascoux, D., Forest, E., Fontecave, M., Barras, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+heteromeric+CsdA-CsdE+cysteine+desulfurase,+assisting+Fe-S+cluster+biogenesis+in+Escherichia+coli.">Analysis of the heteromeric CsdA-CsdE cysteine desulfurase, assisting Fe-S cluster biogenesis in Escherichia coli.</a> J Biol Chem. 280 (29), 26760-26769 (2005).</li><li>Fried, M. G., Crothers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Equilibrium+studies+of+the+cyclic+AMP+receptor+protein-DNA+interaction.">Equilibrium studies of the cyclic AMP receptor protein-DNA interaction.</a> J Mol Biol. 172 (3), 241-262 (1984).</li><li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions:+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system.">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li><li>Rio, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+mobility+shift+assays+for+RNA-protein+complexes.">Electrophoretic mobility shift assays for RNA-protein complexes.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2014 (4), 435-440 (2014).</li><li>Ryder, S. P., Recht, M. I., Williamson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+analysis+of+protein-RNA+interactions+by+gel+mobility+shift.">Quantitative analysis of protein-RNA interactions by gel mobility shift.</a> Methods Mol Biol. 488, 99-115 (2008).</li><li>Yakhnin, A. V., Yakhnin, H., Babitzke, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel+mobility+shift+assays+to+detect+protein-RNA+interactions.">Gel mobility shift assays to detect protein-RNA interactions.</a> Methods Mol Biol. 905, 201-211 (2012).</li><li>Ream, J. A., Lewis, L. K., Lewis, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+agarose+gel+electrophoretic+mobility+shift+assay+for+quantitating+protein:+RNA+interactions.">Rapid agarose gel electrophoretic mobility shift assay for quantitating protein: RNA interactions.</a> Anal Biochem. 511, 36-41 (2016).</li><li>Hagel, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gel-filtration+chromatography.">Gel-filtration chromatography.</a> Curr Protoc Mol Biol. , (2001).</li></ol>

Burada tarif edilen protein-tRNA agaroz jel geciktirme deneyi, çeşitli şekillerde modifiye edilebilir. Birincisi, jelin içindeki agaroz yüzdesi, burada analiz edilen protein (120 kDa) &#39;dan önemli ölçüde daha büyük protein-tRNA komplekslerinin ayrılması ve görselleştirilmesine izin vermek için azaltılabilir. İkincisi, hedef protein termolabilitedeyse, elektroforez cihazını soğuk bir odaya taşıyarak veya üretilen ısıyı derhal dağıtmak için elektroforez haznesi içindeki buz paketlerini ku...

<html> Jel gerilik testi 1 (elektroforetik mobilite kaydırma deneyi EMSA olarak da bilinir), protein-nükleik asit etkileşimlerini incelemek ve karakterize etmek için tasarlanmış bir elektroforetik yöntemdir. Protein-DNA&#39;nın yanı sıra protein-RNA etkileşimlerinin ve özellikle de tRNA ve tRNA-bağlayıcı proteinler arasındaki etkileşimlerin saflaştırılmış bileşenleri veya kompleks protein karışımları ( örn. , Hücre lizatları) veya nükleik asitler ( örn. , TRNA havuzları). Antikoodon kök döngüsünde (ASL) A37&#39;ye bağlanan threonylcarbamoyl yan zincirini siklize eden saflaştırılmış tRNA (UUU) ile TcdA, bir N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) dehidrataz arasındaki etkileşimin incelenmesine jel geciktirme testleri uyguladık TRNA&#39;ların siklik t6&#39;ya (ct 6 A) 2 , 3&#39;e dönüştürülmesi . TcdA ayrıca CsdL 3 olarak bilinir ,Fc &gt; 4. tcdA / csdL geni sistein desulfurase&#39;ı ve sistein sulfinase desulfinate (CSD) sisteminin sülfür akseptörünü kodlayan csdA ve csdE genleri 5 ile bir küme oluşturur ve canlı ortamda TcdA fonksiyonunu sürdürmek için gereklidir 3 . Jel retardasyon deneylerinin ardındaki mantık, serbest nükleik asit molekülleri, büyük negatif yüklerinden ötürü akrilamidin veya agaroz jellerinin önüne hızla göç ederken, aynı nükleik asitlerin protein komplekslerinin elektroforetik hareketliliği dramatik bir şekilde azalır. Hareketlilikteki azalma, ayrı bantlar olarak çözümlenen nükleik asit-protein komplekslerinde &quot;kayma&quot; olarak görülebilir. Pozitif yüklü ve daha büyük nükleik asit-protein kompleksi, bir jel üzerinde hareketlilikte daha büyük bir kayma veya azalma gösterir. Kompleksin yükle nötrleştirilmesi evrensel bir fenomendirProtein-nükleik asit kompleksleri için, jel retardasyon tahlili geniş bir kompleks yelpazesine ve nükleik asit tiplerine uygulanabilir. Yöntem basit, ucuzdur ve minimum ekipmanlarla laboratuvarlarda yürütülebilir. Sadece az miktarda protein ve tRNA gerekir. Bu, genellikle daha büyük miktarlarda numuneyi tüketen alternatif biyofiziksel teknikler üzerinde bir avantajdır. Jel retardasyon tahlili transkripsiyon faktörlerinin incelenmesi için yaygın olarak kullanılmaktadır. Deney, birçok farklı DNA dizisi için transkripsiyon faktörlerinin bağlanma kinetiği, mukavemeti ve özgünlüğünü analiz etmek için kullanılmıştır. Gerçekten de bu alanda EMSA ilk önce 6 , 7 geliştirildi. RNA 8 , 9 , 10 , 11 ve tRNA molekülleri ile jel geciktirme testleri ribozom araştırmasında da kullanılmıştırVe burada yaptığımız gibi, transkripsiyonel olarak tRNA nükleozidlerini değiştiren enzimleri analiz etmek. Birçok farklı parametre, sıcaklık, protein kalitesi ve tRNA örneği gibi jel retardasyon tahlilinin sonucunu ve bağlanma kuvvetini etkiler. Deneyin dikkatli planlanması ve uygulanması, serbest nükleik asit ve protein bağlı türlerin sonuçlarının yorumlanması için çok önemlidir. Burada, tRNA&#39;yı (UUU) kodlayan sentetik geni, promotörü Shine-Dalgarno ribozom bağlanma yerinden yoksun bir ifade vektörüne klonlandı ve büyük miktarda tRNA 2 sentezine yol açtı. Bu ayrıntılı protokol, yaygın hatalar önlenirken tRNA jel geciktirme deneyleri gerçekleştirmek için net bir kılavuz sağlamak üzere hazırlanmıştır.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1054">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:433px;">E. coli BL21(DE3)</td>
			<td style="width:135px;">Novagen</td>
			<td style="width:119px;">70235</td>
			<td style="width:367px;">DE3 lysogen contains T7 polymerase upon IPTG induction.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">pET23d</td>
			<td style="width:135px;">Novagen</td>
			<td style="width:119px;">69748-3</td>
			<td style="width:367px;">pET23d confers resistance to ampicillin; T7 promoter.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">LB Broth, Low Salt (Lennox L Broth), Granulated</td>
			<td style="width:135px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">GL1703</td>
			<td style="width:367px;">Conventional LB Broth, High Salt, can also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Ampicillin</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">10419313</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:433px;">Incubator Shaker (Thermostated)</td>
			<td style="width:135px;">NBS</td>
			<td style="width:119px;">Excella E24&#160;</td>
			<td style="width:367px;">Any shaker incubator with temperature control can be used.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG), &#62;=99%</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">BP1755</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Sodium acetate, anhydrous, &#62;99%</td>
			<td style="width:135px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">B4017</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA), Disodium salt, &#62;99%</td>
			<td style="width:135px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">AC327205000</td>
			<td style="width:367px;">Harmful if inhaled.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Centrifuge (refrigerated)</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5430</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Centrifuge (refrigerated) rotor</td>
			<td style="width:135px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:119px;">5430/5430P</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Centrifuge</td>
			<td style="width:135px;">Sorvall</td>
			<td style="width:119px;">RC5C</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Centrifuge rotor</td>
			<td style="width:135px;">Sorvall</td>
			<td style="width:119px;">SLA-3000</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:433px;">Phenol solution, Saturated with 0.1 M citrate buffer, pH 4.3 &#177; 0.2</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">P4682</td>
			<td style="width:367px;">Acute toxicity (oral, dermal, inhalation), corrosive</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Ethanol absolute for analysis, 100% v/v</td>
			<td style="width:135px;">Merck Millipore</td>
			<td style="width:119px;">100983</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate, Na2HPO4, &#62;=99%</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">71643</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Potassium dihydrogen phosphate, KH2PO4</td>
			<td style="width:135px;">Merck</td>
			<td style="width:119px;">48,730,250</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">HiLoad 16/60 Superdex 75&#160;</td>
			<td style="width:135px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:119px;">28989333</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Agarose</td>
			<td style="width:135px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">MB1200</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Tris [Tris(hydroxymethyl) aminomethane HCl]</td>
			<td style="width:135px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">T1513</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Boric Acid</td>
			<td style="width:135px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">B0503</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Microwave</td>
			<td style="width:135px;">Haier</td>
			<td style="width:119px;">HDA-2070M</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">TCEP [Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride]</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">C4706</td>
			<td style="width:367px;">Corrosive to metals and skin.</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:433px;">ATP [Adenosine 5&#8242;-triphosphate disodium salt hydrate], Grade I, &#62;=99%</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">A2383</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:433px;">Magnesium chloride (MgCl2), anhydrous, &#62;=98%</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">M8266</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Sodium chloride (NaCl), &#62;99%</td>
			<td style="width:135px;">Fisher Bioreagents</td>
			<td style="width:119px;">BP358</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Potassium chloride (KCl), &#62;99%</td>
			<td style="width:135px;">Melford</td>
			<td style="width:119px;">P0515</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">NZYDNA Ladder VI</td>
			<td style="width:135px;">NZYtech</td>
			<td style="width:119px;">MB8901</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Power supply</td>
			<td style="width:135px;">Consort</td>
			<td style="width:119px;">EV261</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Electrophoresis unit</td>
			<td style="width:135px;">Real Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">RELSMINI10</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Real Safe nucleic acid staining</td>
			<td style="width:135px;">Real Laboratory</td>
			<td style="width:119px;">RBMSAFE</td>
			<td style="width:367px;">20,000X stock</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">UV Transilluminator (G:Box/EF)</td>
			<td style="width:135px;">Syngene</td>
			<td style="width:119px;">2216498</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Coomassie Brilliant Blue G</td>
			<td style="width:135px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">B0770</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Rocker (Gyro-Rocker)</td>
			<td style="width:135px;">Stuart</td>
			<td style="width:119px;">SSL3</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:433px;">Mixer Vortex&#160;</td>
			<td style="width:135px;">Fisher brand</td>
			<td style="width:119px;">13214789</td>
			<td style="width:367px;"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protein-trna agarose gel retardation assays for the analysis of the n6-threonylcarbamoyladenosine tcda function

Escherichia coli&#39;de tRNA&#39;nın (UUU) eksprese edilmesi ve saflaştırılması için yöntemler ve tRNA&#39;nın (UUU) TcdA, bir N6-threonylcarbamoyladenosine (t6A) dehidrataz ile bağlanmasının jel geciktirme deneyleri ile analizi, bu, threonylcarbamoyl TRNA&#39;ların antikodon kök döngüsünde (ASL) A37&#39;ye bağlanmış yan zincirin siklik t6A&#39;ya (ct 6 A) dönüştürülmesi. TRNA (UUU) kodlayan sentetik genin transkripsiyonu E. coli&#39;de 1 mM izopropil β-D-l-tiogalaktopiranozit (IPTG) ile indüklenir ve tRNA içeren hücreler indüksiyonun 24 saat sonra hasat edilir. RNA fraksiyonu asit fenol ekstraksiyon yöntemi kullanılarak saflaştırılır. Saf tRNA, küçük boyutlu tRNA moleküllerini bozulmamış veya parçalanmış nükleik asitlerden verimli bir şekilde ayıran bir jel filtrasyon kromatografisiyle elde edilir. TRNA&#39;ya (UUU) TcdA bağlanmasını analiz etmek için, TcdA tRNA&#39;ya (UUU) karıştırılır ve doğal bir agaroz jelinde 4 ° C&#39;de ayrılır.Serbest tRNA (UUU) daha hızlı göç ederken, TcdA-tRNA (UUU) kompleksleri jel boyama sırasında gözlemlenebilen bir mobilite geriliğine uğrarlar. TcdA&#39;nın bir tRNA (UUU) bağlayıcı enzim olduğunu kanıtlıyoruz. Bu jel gerilik testi, TcdA mutantlarını ve katkı maddelerinin ve diğer proteinlerin bağlanma üzerindeki etkilerini incelemek için kullanılabilir.

Büyük miktarda tRNA (UUU), güçlü bir indüklenebilir T7 promotörü kontrolü altında E. coli&#39;de tRNA geninin eksprese edilmesi ile elde edilebilir. İfade edilen tRNA (UUU), sitoplazmada birikir ve doğal olarak bol miktarda bulunan tRNA&#39;ların havuzunda zenginleştirilir. EMSA dereceli tRNA elde etmek için bir yakalama / ekstraksiyon basamağı ve bir jel filtrasyon / parlatma aşaması içeren iki aşamalı bir saflaştırma işlemi kullanılmıştır. Yakalama...

Watch this Scientific Journal Video about Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function at JoVE.com

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

TRNA (UUU) üretimi ve agaroz jel geciktirme testleri ile TcdA enzimi ile kompleks içinde tRNA (UUU) analizi için bir protokol sunulmuştur.

Analiz için Protein-tRNA Agaroz Jel Retardasyon Testleri<em&gt; K</em<sup&gt; 6</sup&gt; Threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

We demonstrate methods for the expression and purification of tRNA(UUU) in Escherichia coli and the analysis by gel retardation assays of the binding of ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Protein-tRNA Agarose Gel Retardation Assays for the Analysis of the N6-threonylcarbamoyladenosine TcdA Function

Automated Acoustic Dispensing for the Serial Dilution of Peptide Agonists in Potency Determination Assays

Etkili belirlenmesi tahlillerinde Peptit Agonistlerinin seri Seyreltme için Dağıtım Otomatik Akustik

As with small molecule drug discovery, screening for peptide agonists requires the serial dilution of peptides to produce concentration-response curves. ...

An Efficient Method for the Isolation of Highly Purified RNA from Seeds for Use in Quantitative Transcriptome Analysis

Kantitatif Transkriptom analizinde kullanım için tohumlar yüksek oranda saf RNA&#39;nın izolasyonu için etkili bir yöntem

Plant seeds accumulate large amounts of storage reserves comprising biodegradable organic matter. Humans rely on seed storage reserves for food and as ...

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Mitokondriyal Elektron Nakil Zincirinin Süper Komplekslerinin Yerli Elektroforez, In-Jel Testleri ve Elektroelüsyon ile İncelenmesi

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Use of Two Dimensional Semi-denaturing Detergent Agarose Gel Electrophoresis to Confirm Size Heterogeneity of Amyloid or Amyloid-like Fibers

İki boyutlu yarı denaturing deterjan özel Jel Elektroforez amiloid veya amiloid benzeri liflerin boyutu heterojen onaylamak için kullanımı

Amyloid or amyloid-like fibers have been associated with many human diseases, and are now being discovered to be important for many signaling pathways. ...

Toeprinting Analysis of Translation Initiation Complex Formation on Mammalian mRNAs

Çeviri başlatma karmaşık oluşumu memeli mRNA'ların Toeprinting analizi

Translation initiation is the rate-limiting step of protein synthesis and represents a key point at which cells regulate their protein output. Regulation ...

Sampling and Pretreatment of Tooth Enamel Carbonate for Stable Carbon and Oxygen Isotope Analysis

Örnekleme ve diş minesini Önarıtma kararlı karbon ve oksijen izotop analizi için karbonat

Stable carbon and oxygen isotope analysis of human and animal tooth enamel carbonate has been applied in paleodietary, paleoecological, and ...

Dynamic Proteomic and miRNA Analysis of Polysomes from Isolated Mouse Heart After Langendorff Perfusion

Dinamik proteomik ve miRNA analiz polizomlar izole fare kalp sonra Langendorff perfüzyon üzerinden

Studies in dynamic changes in protein translation require specialized methods. Here we examined changes in newly-synthesized proteins in response to ...

Analysis of Thylakoid Membrane Protein Complexes by Blue Native Gel Electrophoresis

Thylakoid membran Protein kompleksleri tarafından mavi yerli jel elektroforez Analizi

Photosynthetic electron transfer chain (ETC) converts solar energy to chemical energy in the form of NADPH and ATP. Four large protein complexes embedded ...

Activated Cross-linked Agarose for the Rapid Development of Affinity Chromatography Resins - Antibody Capture as a Case Study

Affinity Kromatografi Reçiyatlarının Hızlı Gelişimi İçin Aktif Çapraz Bağlantılı Agarose - Örnek Olay Olarak Antikor Yakalama

The purification of monoclonal antibodies (mAbs) is commonly achieved by Protein A affinity chromatography, which can account for up to 25% of the overall ...

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One &#945;-Synuclein Monomer at a Time

Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One ÃƒÅ½Ã‚Â±-Synuclein Monomer at a Time

Kararlı Yerel Konformasyonları Belirlemek için Zaman Çözümlenmiş Protein Kaynaklı Floresan Geliştirmeyi Kullanmak Bir Seferde Bir α-Synuclein Monomer

Using spectroscopic rulers to track multiple conformations of single biomolecules and their dynamics have revolutionized the understanding of structural ...