Name: in vitro growth of mouse preantral follicles under simulated microgravity
Uploaded: 2017-12-17T13:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke Yilong Wang og Yanlin Zhao for deres assistance opretholde dyrene, Chan Zhang for hendes hjælp i de histologiske prøver og Dr. Songtao He til kritisk læsning af dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af Natural Science Foundation i Zhejiang provinsen (giver nummer: LY13C120002).

Etisk godkendelse for denne undersøgelse blev indhentet fra de dyr forskning etiske udvalg af Wen Zhou Medical College.
1. forberedelse af dyrkningsmedier og calciumalginat Hydrogel
<ol>
	<li>Forberede æggestokkene væv og follikel håndtering medium ved hjælp af L-15 medium med 10% føtal bovint serum, 100 IE/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin. Opbevares ved 4 ° C for to uger.</li>
	<li>Forberede æggestokkene væv og follikel næringssubstratet bestående af alpha-minimal afgørende medium [α-MEM] suppleret med 5% føtal bovint serum [FBS], 1% insulin-selen-transferrin, 10 mIU/ml rFSH, 100 IE/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin. Opbevares ved 4 ° C for to uger.</li>
	<li>Forberede calciumalginat hydrogel med 0,8% (w/v) natriumalginat løsning i steril PBS, så drop 10 µL af denne løsning i indkapsling løsning (140 mM NaCl /50 mM CaCl2) til at oprette calciumalginat perler. Bemærk: Calciumalginat perle størrelse var omkring 3 mm i diameter.</li>
</ol>
2. med musen follikel Isolation og indkapsling
<ol>
	<li>Frasortering 14 dage gamle ICR hunmus af cervikal dislokation, fjerne æggestokkene aseptisk ved hjælp af saks og pincet, og sætte æggestokkene til 2 mL håndtering medium.</li>
	<li>Skær æggestokkene i halve ved hjælp af en skalpel. Den halv størrelse æggestokkene væv var ca. 1 mm tykkelse for kultur i dyrkningsmediet.</li>
	<li>Manuelt isolere follikler fra æggestokkene ved hjælp af 26 1/2-guage nåle under et 2-4 X stereomikroskop, og indsamle de valgte follikler for kultur i dyrkningsmediet. Bemærk: Follikel udvælgelseskriterier: 1) follikler var runde med oocyter i midten og 2-3 lag af granulosa-celler omkring oocytter, 2) follikler havde en intakt basale membran fastgjort med nogle theca celler, og 3) follikel størrelse var 90-100 µm i diameter</li>
	<li>Oprette calciumalginat perler per trin 1.3. Vaske follikler med natriumalginat løsning og derefter afpipetteres en enkelt follikel i midten af hver calciumalginat perle til at gøre visse hver perle indeholder en enkelt follikel under et stereomikroskop. Efter skylning dyrkningsmedium, kultur af natriumalginat perler i 150 µL af næringssubstratet i en 35 × kultur 10 mm parabol eller en RWV enhed.</li>
</ol>
3. æggestokkene væv eller follikel kultur Under simulerede vægtløshed
<ol>
	<li>Bruge en RWV enhed til generering af simulerede vægtløshed. Fylde skibet med lys paraffinolie (~ 10 mL), placere 150 µL af næringssubstratet i en dråbe ind i olie, derefter overføre ét stykke af æggestokkene væv eller tre calciumalginat perler med indkapslede follikler i medium slipværktøjet. Luk fartøj port cap og lave fartøj på roterende soklen af enheden.</li>
	<li>I kontrol grupper, placere calciumalginat perler indeholdende follikler eller æggestokkene væv i 150 µL af næringssubstratet i en droplet dækket med lys paraffinolie i 35 × 10 mm kultur retter.</li>
	<li>Ruger både kultur retter og RWV enhed i en fugtig inkubator ved 37 ° C med 5% CO2 i luften.</li>
	<li>Ændre næringssubstratet i RWV enhed: Hæld olie og medium fra fartøjet i en 150 × 20 mm kultur parabol, overføre de æggestokkene væv eller calciumalginat perler til en kultur fad med næringssubstratet. Genetablere fartøj kultur system pr. trin 3.1.</li>
</ol>
4. udpakning og follikel hentning
<ol>
	<li>Efter 4 dage for dyrkning, hæld olie og medium fra fartøjet i en 150 × 20 mm kultur parabol. Afhente calciumalginat perler og decapsulate follikler fra calciumalginat perler af inkubere ved håndtering af medium suppleret med 10 U/mL calciumalginat lyase i 30 minutter ved 37 ° C.</li>
	<li>Indsamle follikler og derefter vaske dem i håndtering medium under et stereomikroskop.</li>
</ol>
5. æggestokkene væv og follikel vurdering
<ol>
	<li>Celle levedygtighed Assay
	<ol>
		<li>Vask decapsulated follikler tre gange i D-PBS, og derefter inkuberes dem i 150 µL af de kombinerede celle levedygtighed analysereagenserne (2 µM calcein AM og 4 µM EthD-1) ved stuetemperatur i 45 min.</li>
		<li>Overføre follikler til et rent objektglas med 10 µL D-PBS, dække med en coverslip, og derefter forsegle med klare Fingernegl polish.</li>
		<li>Grev grønne og røde blodlegemer i dias under en Konfokal fluorescens mikroskop (400 X). Bemærk: I denne levedygtighed assay, grønne celler er levende celler, og røde celler er døde celler. Follikler med mindre end 10% røde blodlegemer (døde) betragtes som overlevede follikler.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hæmatoxylin og Eosin (H &#38; E) farvning af æggestokkene væv og hårsækken
	<ol>
		<li>Fix frisk 14 dage gamle mus æggestokke og preantral follikler isoleret fra 14 dage gamle mus i Bouins løsning som dag 0 prøver. Lave den kulturperler æggestokkene væv efter enten 2 eller 4-dage kultur og individuelle follikler inde calciumalginat perler efter 4 dages kultur som eksperimentelle prøver.</li>
		<li>Integrer alle prøver i paraffin, afsnit seriefremstillede på 5 µm tykkelse, og derefter pletten med H &#38; E ifølge producentens anvisninger.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Follikel optælling og Diameter måling
	<ol>
		<li>I æggestokkene væv sektioner plettet med H &#38; E, tælle alle hårsække og sund preantral follikler inden for området væv afsnit under et mikroskop (forstørrelse 400 X). Beregne follikel tæthed ved at dividere antallet af preantral follikler af det samlede antal follikler. Bemærk: de sunde preantral follikler er dem med mindst to lag af granulosa-celler.</li>
		<li>Foranstaltning hårsækken og oocyt diameter på dag 0 follikler og dag 4 kulturperler follikler.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunhistokemi
	<ol>
		<li>Fix æggestokkene væv i 4% PARAFORMALDEHYD, indkapsle i paraffin, afsnit på 5-µm-tykkelse, og montere væv sektioner på dias. Afvoksning afsnittene rehydrere, og Inkuber dem i citratbuffer for 15 min. blok den endogene peroxidase i 3% brintoverilte, afsløre antigen i 5% ged serum, og derefter inkuberes med primære antistoffer ved stuetemperatur i 3 timer.<ol>
			<li>Vask i PBS for 3 min, så glassene inkuberes med 1: 500 fortyndet peberrodsperoxidase (HRP)-konjugeret gede anti-kanin IgG (H + L) i 1 time ved stuetemperatur. Bemærk: De primære antistoffer bruges i undersøgelsen var kanin anti-GDF-9 antistof (1: 500 fortynding) og kanin anti-PCNA antistof (1:200 fortynding).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkuber æggestokkene afsnit dias med 3, 3'-Diaminobenzidine [DAB] til at registrere peroxidase aktivitet og mount på glas dias med vandig montering medium.</li>
		<li>Observere æggestokkene afsnit dias under et mikroskop på 400 X forstørrelse.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transmissions elektronmikroskopi [TEM]
	<ol>
		<li>Fix follikler i 2,5% glutaraldehyd i 3 timer ved stuetemperatur, så post fix i 1% osmium dinitrogentetraoxid i 1 timer ved 37 ° C.</li></ol></li></ol>Vask med PBS, så behandle follikler med 1% phosphorwolfram syre og 1% uranyl natriumacetat i 1 time ved 37 ° C. Dehydrere follikler ved hjælp af en acetone-serien: 25, 50, 75, 95, og 100% (3 gange) og epoxy harpiks-acetone blanding efter den endelige 100% acetone trin ved 37 ° C, og derefter integrere i epoxyharpiks på 45 ° C.
		<li>Skær de indlejrede blokke i 1,0 µm semi-tynde sektioner, og plette sektioner med 1% methylenblåt til 1-2 min til at lokalisere follikler i blokke. Skær de indlejrede blokke i 50 nm ultratynde sektioner og montere afsnittene om gitre for TEM.</li>
	
	

6. den statistiske analyse
<ol>
	<li>Præsentere alle data i gennemsnit ± SEM format. Fastslå forskelle mellem grupper af envejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af Tukey flere sammenligning test. Α tærsklen for test resultatet betydning blev sat på p &#60; 0,05.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Eppig, J. J., Schroeder, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+mouse+oocytes+from+preantral+follicles+to+undergo+embryogenesis+and+development+to+live+young+after+growth,+maturation,+and+fertilization+in+vitro.">Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro.</a> Biol Reprod. 41, 268-276 (1989).</li><li>O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+protocol+for+in+vitro+development+of+mouse+oocytes+from+primordial+follicles+dramatically+improves+their+developmental+competence.">A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence.</a> Biol Reprod. 68, 1682-1686 (2003).</li><li>Liu, J., Van der Elst, J., Van den Broecke, R., Dhont, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+offspring+by+in+vitro+fertilization+of+oocytes+from+cryopreserved+primordial+mouse+follicles+after+sequential+in+vivo+transplantation+and+in+vitro+maturation.">Live offspring by in vitro fertilization of oocytes from cryopreserved primordial mouse follicles after sequential in vivo transplantation and in vitro maturation.</a> Biology of Reproduction. 64, 171-178 (2001).</li><li>Parrish, E. M., Siletz, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+mouse+ovarian+follicle+development+in+vivo+versus+an+ex+vivo+alginate+culture+system.">Gene expression in mouse ovarian follicle development in vivo versus an ex vivo alginate culture system.</a> Reproduction. 142, 309-318 (2011).</li><li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+follicles+produce+live,+fertile+offspring.">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).</li><li>Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+stage-specific+permissive+in+vitro+culture+environment+for+follicle+growth+and+oocyte+development.">Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development.</a> Biol Reprod. 75, 916-923 (2006).</li><li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+tissues+in+real+and+simulated+microgravity:+new+methods+for+tissue+engineering.">Growing tissues in real and simulated microgravity: new methods for tissue engineering.</a> Tissue engineering. Part B, Reviews. 20, 555-566 (2014).</li><li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+responsiveness+of+endothelial+cells+to+vascular+endothelial+growth+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor+added+to+culture+media+under+gravity+and+simulated+microgravity.">Different responsiveness of endothelial cells to vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor added to culture media under gravity and simulated microgravity.</a> Tissue engineering Part A. 16, 1559-1573 (2010).</li><li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+delayed+type+of+three-dimensional+growth+of+human+endothelial+cells+under+simulated+weightlessness.">A delayed type of three-dimensional growth of human endothelial cells under simulated weightlessness.</a> Tissue engineering. Part A. 15, 2267-2275 (2009).</li><li>Pietsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+proteins+identified+in+human+thyroid+cells.">Interaction of proteins identified in human thyroid cells.</a> International journal of molecular sciences. 14, 1164-1178 (2013).</li><li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+using+a+rotary+cell+culture+system+promotes+chondrogenesis+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+via+the+p38+MAPK+pathway.">Simulated microgravity using a rotary cell culture system promotes chondrogenesis of human adipose-derived mesenchymal stem cells via the p38 MAPK pathway.</a> Biochem Biophys Res Commun. 414, 412-418 (2011).</li><li>Maier, J. A., Cialdai, F., Monici, M., Morbidelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microgravity+and+hypergravity+on+endothelial+cells.">The impact of microgravity and hypergravity on endothelial cells.</a> Biomed Res Int. 2015, 434803 (2015).</li><li>Zhu, M., Jin, X. W., Wu, B. Y., Nie, J. L., Li, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+simulated+weightlessness+on+cellular+morphology+and+biological+characteristics+of+cell+lines+SGC-7901+and+HFE-145.">Effects of simulated weightlessness on cellular morphology and biological characteristics of cell lines SGC-7901 and HFE-145.</a> Genet Mol Res. 13, 6060-6069 (2014).</li><li>Dang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+increases+heavy+ion+radiation-induced+apoptosis+in+human+B+lymphoblasts.">Simulated microgravity increases heavy ion radiation-induced apoptosis in human B lymphoblasts.</a> Life Sci. 97, 123-128 (2014).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+compromises+mouse+oocyte+maturation+by+disrupting+meiotic+spindle+organization+and+inducing+cytoplasmic+blebbing.">Simulated microgravity compromises mouse oocyte maturation by disrupting meiotic spindle organization and inducing cytoplasmic blebbing.</a> PLoS One. 6, e22214 (2011).</li><li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+differentiation+factor-9+is+required+during+early+ovarian+folliculogenesis.">Growth differentiation factor-9 is required during early ovarian folliculogenesis.</a> Nature. 383, 531-535 (1996).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+Microgravity+Using+a+Rotary+Culture+System+Compromises+the+In+Vitro+Development+of+Mouse+Preantral+Follicles.">Simulated Microgravity Using a Rotary Culture System Compromises the In Vitro Development of Mouse Preantral Follicles.</a> PLoS One. 11, e0151062 (2016).</li></ol>

Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende finansielle interesser.

Kritiske trin til vellykket dyrkning af preantral follikler er: 1) korrekt at vælge de preantral follikler ifølge de udvælgelseskriterier, der blev beskrevet i protokollens tekst 2.1); 2) du udfører alle procedurer i et skeptisk tilstand og opretholde et sterilt kultur; og 3) korrekt opsætning af RWV kultur-systemet.
Sikring af konsekvens af eksperimentelle observationer i Repliker eksperimenter er at bruge lignende eller identiske materialer. Kriterier for udvælgelse af mus preantral follikler afslørede, at follikler havde 1) sund oocyter på stadiet germinale vesikel opdeling (GVBD) omgivet af en tynd zona pellucida; 2) 2-3 lag af granulosa-celler omsluttet af en basal membran; og 3) nogle thecal celler knyttet til den basale membran. Follikler valgt havde således ikke kun alle tre funktionelle rum af en ovariefollikel til støtte for oocyt vækst, men også en lignende morfologiske identifikation med en diameter på 90-100 µm.
Dette er det første forsøg at vokse mus preantral follikler på samme måde som 3D dyrkning under den simulerede vægtløshed. Flere kultur systemer er udviklet til mus preantral follikler. Oocytter fra hårsækken kulturperler på en flad overflade på petriskåle, den såkaldte 2D kultur, kunne blive befrugtet og produceret levende afkom. Derudover opretholde 3D kulturer, såsom kulturer af follikler i calciumalginat perler, en væv struktur ligner hvad kroppen producerer i høj procentdel meiotically kompetente oocyter. Udviklingsprocessen af æggestokkene follikler/oocyter i en nul-tyngdekraft felt er dog ukendt. RWV, en enhed, som tiltrækker stor opmærksomhed i vævsmanipulering, kan generere en simuleret vægtløshed miljø og skabe et ideelt miljø for at undersøge virkningerne af simulerede vægtløshed på ovarie follicle/oocyter vækst i vitro.
Det er vigtigt at indstille RWV apparatet korrekt for cellekultur. Luftbobler i fartøjet skal fjernes. Metode til at fjerne luftbobler, hvis genereret i fartøjet, er som følger: Placer to sprøjter med 0,5 mL af olie i hver af de to sprøjte porte. Åbne ventiler kontrollere sprøjte havne. Manøvrere luftbobler under sprøjte port. Træk boblerne ind i sprøjten mens indsprøjte ca den samme mængde af medier via andre sprøjte porten. Efter alle bobler er fjernet, lukker ventilerne, fjerne sprøjter og erstatte sprøjten port caps. Det er også afgørende at finde ud af den korrekte rotationshastighed, som forhindrer celler i afregning via en konstant rotation. Optimering af hastigheden bestemmes af egenvægten af cellerne, den væske tæthed og viskositet.
Udtrykket profiler af PCNA og GDF-9, der svarer til dem i GDF-9-mangelfuld mus follikler16, afslørede, at simuleret vægtløshed havde skadelige virkninger på udviklingen af granulosa-celler og oocyter. Fartøj af enhedens RWV spundet omkring en vandret akse inde i en 5% CO2 inkubator, giver mulighed for gennemtrængning af ilt og kuldioxid på tværs af en membran i ryggen, giver effektiv iltning og meget lav shear stress, som var usandsynligt, at være den årsag til skade, follikel/oocyt. Optimering af eksperimentel opsætning og yderligere undersøgelser er nødvendige for at efterforske mekanismen af de skadelige virkninger.
Yderligere undersøgelser er nødvendige for at undersøge den udviklingsmæssige potentiale af in vitro- oocyter udvundet fra RWV kultur system. I øjeblikket er gennemføres in vitro modning af oocytter til MII fase. Den endelige validering af denne kultur system vil blive undersøgt af befrugtning kapacitet af de hentede oocyter.

In vitro ovariefollikel udvikling og oocyt modning har opnået ved hjælp af traditionelle metoder for 2-dimensionelle kultur, som på overfladen af petriskåle, og tre-dimensionelle (3D) matrix, f.eks. natriumalginat og hydrogel1 ,2,3. En 3D kultur system effektivt vedligeholdes follikler i et væv-lignende struktur og holdt de lignende gen expression profiler som i vivo4 follikler, og produceret meiotically kompetente oocyter5,6. 3D kultur systemer kan også fastsættes i en matrix-fri tilstand, eksempelvis hængende drop suspension og rullende fartøjer. Den roterende væg fartøj (RWV) udviklet af National Aeronautics and Space Administration (NASA) genererer en simuleret vægtløshed (s-µg) for cellerne kulturperler inde fartøj7. Dette simulerede vægtløshed tilstand giver en unik kultur system til celleproliferation og differentiering på grund af manglen på bundfældning for konvektion. Det har vist sig at simuleret vægtløshed forfremmet endotel fartoej formation i endothelial celler8,9, thyreoideavæv montage fra skjoldbruskkirtlen celler10, og chondrogenesis fra fedt-afledt mesenkymale stamceller i RWV enheder11. Andre undersøgelser har dog vist, at simuleret vægtløshed induceret apoptose i mavens celler og B Lymfoblaster12,13,14, hvilket tyder på effekter af simuleret vægtløshed på cellular personskader kan være celle type-afhængig. Simuleret vægtløshed kan også forårsage ændringer på ultrastrukturelle niveau, som rapporteret i den forstyrrede spindel organisation og induceret cytoplasmatisk blebbing i oocyter15. Optimeret simulerede vægtløshed forhold og mekanismer, der inducerer tissue engineering eller cellulære skader under systemet kræver yderligere undersøgelse. In vitro- eksperimenter med voksende æggestokkene follikler/oocyter ved hjælp af RWV enheder kan give værdifulde oplysninger om oocyt gen udtryk og ultrastructures af oocyt organeller. I denne undersøgelse, æggestokkene væv indeholdende preantral follikler og isolerede preantral follikler blev brugt til at undersøge virkningerne af simulerede vægtløshedpå follikel udvikling og oocyt modning.
I denne undersøgelse, æggestokkene væv indeholdende preantral follikler og isolerede preantral follikler blev brugt til at undersøge virkningerne af simulerede vægtløshed på follikel udvikling og oocyt modning. I vores undersøgelse, RWV, giver en simuleret vægtløshed enhed, spin omkring en vandret akse inde i en 5% CO2 inkubator, en simuleret vægtløshed tilstand med effektiv iltning og meget lav shear stress. Vi analyseret gen udtryk for prolifererende celle nukleare antigen (PCNA) og differentiering vækstfaktor 9 (GDF-9) som indikatorer for udviklingen af granulosa-celler og oocyter, henholdsvis. Vi viste, at PCNA og GDF-9 udtryk blev undertrykt i granulosa celler og oocyter, henholdsvis, når kulturperler i RWV enheden, og vi viste tilbagetrækning af oocyt microvilli fra zona pellucida i follikler kulturperler under s-µ g betingelse, som var lig den i GDF-9-mangelfuld mus follikler16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="999">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ICR mice</td>
			<td style="width:121px;">SLRC Laoratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:543px;">14-day-old female mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-15 medium</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L1518</td>
			<td>With L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10100147</td>
			<td>Origin: Australia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin V potassium</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1504503</td>
			<td>United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard (USP)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Streptomycin sesquisulfate hydrate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">46754</td>
			<td>Analytical standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Universal&#160;Click&#160;Pen Needles</td>
			<td style="width:121px;">Penfine</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>12&#215;1/2&#34; 0.33&#215;12 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alginate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">alpha-minimal essential medium</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>M0894</td>
			<td style="width:543px;">Alpha Modification, with L-glutamine, without ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin-selenium-transferrin</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">51500056</td>
			<td>Liquid, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GONAL-F</td>
			<td style="width:121px;">Merck Serono</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Recombinant follitropin alfa for injection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Disposable high-aspect-ratio rotating vessel</td>
			<td style="width:121px;">Synthecon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Culture oil</td>
			<td style="width:121px;">Vitrolife</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sterile light paraffin oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alginate Lyase</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1603</td>
			<td>powder, &#62;10,000 units/g solid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">26 1/2-guage needle</td>
			<td style="width:121px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35&#215;10mm dish</td>
			<td style="width:121px;">Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Viability/Cytotoxicity assay Kit</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bouin&#8217;s solution</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">HT10132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:121px;">Jackson Immuno-Research Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">111-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride</td>
			<td style="width:121px;">Beyotime</td>
			<td style="width:119px;">P0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aqueous mounting medium</td>
			<td style="width:121px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">C0563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Rabbit anti-GDF-9 antibody</td>
			<td style="width:121px;">Beijing Biosynthesis Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">BS-175R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit anti-PCNA antibody</td>
			<td style="width:121px;">Proteintech</td>
			<td>24036-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:121px;">Hitachi</td>
			<td style="width:119px;">H-7500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro growth of mouse preantral follicles under simulated microgravity

14 dage gamle mus æggestokkene væv og preantral follikler isoleret fra samme-alderen mus blev inkuberet i en simuleret vægtløshed kultur system. Vi kvantitativt vurderet follikel overlevelse, målte hårsækken og oocyt diametre, og undersøgt ultrastruktur af oocytter produceret fra systemet. Vi observeret nedsat follikel overlevelse, downregulation af udtryk for prolifererende celle nukleare antigen og differentiering vækstfaktor 9, som indikatorer for udviklingen af granulosa-celler og oocyter, henholdsvis, og oocyt ultrastrukturelle abnormaliteter på betingelse af simulerede vægtløshed. Simuleret vægtløshed eksperimentelle installationsprogrammet skal være optimeret til at give en model for undersøgelse af de mekanismer, der er involveret i oocyt/follikel in vitro- udvikling.

Figur 1A viser et RWV med olie inde i skibet. En dråbe af 150 µL medium indeholdende et stykke af æggestokkene væv eller tre calciumalginat perler med indkapslede follikler blev sat ind i olie. Den medium droplet blev holdt i en tilstand af terminal velocity på grund af den flydende træk på dråberne i den roterende olie med hastighed på 25 rotationer pr. minut, der genereres en simuleret vægtløshed (s-µg) tilstand. I et kontrol-eksperiment, æggestokkene væv eller capsulated follikler var kulturperler i en dråbe af 150 µL medium dækket med mineralsk olie i 35 × 10 mm retter (figur 1B), der genereres en 1 -g tilstand.
For at studere virkningerne af simulerede vægtløshed på preantral follikel udvikling i vitro, vi kulturperler 14 daggamle mus æggestokkene væv under 1 -g (kontrol eksperiment) eller s-µg betingelser. Vi tælles antallet af sunde follikler i H &#38; E farves sektioner i to betingelser efter 0, 2 og 4 dage af kulturen (figur 2). Vi fandt, at hårsækken overlevelse i æggestokkene væv behandlet i s-µg stand var væsentligt lavere end under 1 -g tilstand på dag 2 og 4 i dyrkning (p &#60; 0,05, ANOVA). Desuden, vi fandt, at ingen PCNA positive signaler blev fundet i æggestokkene væv under s-µg tilstand (figur 3). I kulturen af isolerede preantral follikler indkapslet i calciumalginat perler, vi afslørede at overlevet betydeligt flere follikler under 1 -g tilstand (76,8% ± 5,3%, n = 227) end s-µg tilstand (54,4% ± 6,7%, n = 249) på dag 4 af dyrkning . Derudover oocyt størrelse havde ingen signifikant stigning efter 4 dages dyrkning, selv hårsækken størrelse steg betydeligt under begge tyngdekraften betingelser (figur 4). Follikler med mindre end 10% døde granulosa celler (figur 5) var imidlertid væsentligt lavere under 1 -g tilstand (81.5 ± 5%, n = 10) end under s-µg tilstand (90 ± 8%, n = 10) (p &#60; 0,05).
For at undersøge virkningerne af simulerede vægtløshed på oocyt funktionalitet, undersøgte vi udtryk for oocyt-specifikke markør GDF-9. Vi viste, at GDF-9 udtryk var bemærkelsesværdigt nedreguleret i æggestokkene væv under s-µg tilstand (figur 6). Desuden demonstrerede vi hyppige ultrastrukturelle abnormiteter af oocyt organeller i de indkapslede follikler på dag 4 af kultur på s-µg betingelse (figur 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig1.jpg"> 
Figur 1 : Opsætning af s -μg og 1g kultur betingelser. (A) s-µg blev skabt af den roterende væg fartøj og at holde kultur fag i en tilstand af konstant frit fald inden for den bevægende olie. (B) A 1 -g betingelse blev oprettet ved dyrkning af æggestokkene væv eller follikler på overfladen af en petriskål, dækket med mineralsk olie. Pilen angiver en dråbe af medium. Skalalinjen = 1 cm. Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig1large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig2.jpg"> 
Figur 2 : Virkningerne af s-µg den æggestokkene væv kultur. (A) dele af æggestokkene væv kulturperler under 1 -g eller s-µg betingelser for 0, 2 og 4 dage. Skalalinjen = 50 µm. (B) follikel tæthed i afsnittene æggestokkene væv. Fejl bar repræsenterer 1 SEM, *: p &#60; 0,05. Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig2large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig3.jpg"> 
Figur 3 : Immunhistokemi af PCNA. PCNA protein udtryk blev undersøgt i granulosa-celler i æggestokkene væv kulturperler under 1 -g eller s-µg betingelser for 0, 2 og 4 dage. Skalalinjen = 50 µm. Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig3large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig4.jpg"> 
Figur 4 : Virkningerne af s-µg på kulturen i indkapslede preantral follikler i calciumalginat perler. (A) morfologi af preantral follikler kulturperler under 1 -g eller s-µg betingelser for 0 dage og 4 dage. Skalalinjen = 50 µm. (B) oocyt diameter og (C) follikel diameter sammenlignet mellem 1 g og s-µg betingelser. Fejl bar repræsenterer 1 SEM, *: p &#60; 0,05. Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig4large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig5.jpg"> 
Figur 5 : Celle levedygtighed assay. Repræsentative billeder blev taget under et mikroskop på 400 X forstørrelse. Assay bruger Calcein AM at visualisere levende celler farvede i grøn og EthD-1 til at visualisere kerner af døde celler farves rød. (A): en follikel med ~ 100% live granulosa celler (grønne). (B): en follikel med live granulosa celler (grønne), samt mere end 10% døde celler (rød). Skalalinjen = 50 µm.Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig5large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig6.jpg"> 
Figur 6 : Immunhistokemi GDF-9. GDF-9 protein udtryk blev undersøgt i oocyter i æggestokkene væv kulturperler under 1 -g eller s-µg betingelser for 0, 2 og 4 dage. Skalalinjen = 50 µm. Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig6large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig7.jpg"> 
Figur 7 : Ultrastrukturelle analyse af isolerede preantral follikler kulturperler under 1 - g eller s-µ g betingelser på dag 4 af kultur. (A) en oocyt med microvilli (pile) udvide i zona pellucida (1 -g betingelse). (B-F) Oocyter med store vacuoles (*), multilamellar organer (#), lipid dråber (pile), vacuolated mitokondrier mangler cristae (pil), og sprede Golgi apparatet (pil), henholdsvis (s-µg betingelse). O: oocyt; ZP: zona pellucida. Dette tal er blevet ændret fra Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig7large.jpg" target="_blank">venligst klik her for at se en større version af dette tal.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity at JoVE.com

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

Et meget lovende teknik til at generere væv konstruktioner uden brug af matrix er kultur celler i en simuleret vægtløshed tilstand. Ved hjælp af en roterende kultur system, undersøgte vi ovariefollikel vækst og oocyt modning follikel overlevelse, morfologi, vækst og oocyt funktion under simulerede vægtløshed tilstand.

In Vitro Vækst af mus Preantral follikler Under simulerede vægtløshed

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Kultur og Co-kultur Mouse æggestokke og ovariefollikler

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Karakterisering af tymisk Bundfældning Progenitorer i Mouse Embryo Brug<em&gt; In vivo</em&gt; Og<em&gt; In vitro</em&gt; Analyser

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generering af aggregater af mus embryonale stamceller, der Vis Symmetry Breaking, Polarisering og Emergent Collective Adfærd<em&gt; In vitro</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolering af Mouse Endometrial epitel- og stromacellers for<em&gt; In vitro</em&gt; decidualisering

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

En roman brug af tre-dimensionelle høj frekvens ultralyd for tidlig graviditet karakterisering i mus

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation af stillads-fri, tre-dimensionelle Insulin udtrykker Pancreatoids fra mus i bugspytkirtlen stamfaderen In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal plade i Gastrulating mus embryoner ved hjælp af Scanning elektronmikroskopi og hele Mount immunfluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Induktion i Endothelial differentiering i hjertets stamceller lavt Serum betingelser

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Bestemmelse galdegang tæthed i muse leveren

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...