Name: in vitro growth of mouse preantral follicles under simulated microgravity
Uploaded: 2017-12-17T13:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke Yilong Wang og Yanlin Zhao for deres hjelp i å opprettholde dyrene, Chan Zhang for henne hjelp forberede histologiske prøvene og Dr. Songtao He for kritisk lesing dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av Natural Science Foundation av Zhejiang-provinsen (gi nummer: LY13C120002).

Etiske godkjenning for denne studien ble anskaffet fra dyr forskning etikk komiteen av Wen Zhou Medical College.
1. forberedelse av kultur medier og Alginate Hydrogel
<ol>
	<li>Forberede ovarian vev og hårsekken håndtering medium ved hjelp av L-15 medium med 10% fosterets bovin serum, 100 IU/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin. Lagre på 4 ° C i to uker.</li>
	<li>Forberede ovarian vev og hårsekken kultur medium bestående av alpha-minimal viktig middels [α-MEM] med 5% fosterets bovin serum [FBS], 1% insulin-selen-transferrin, 10 mIU/ml rFSH, 100 IU/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin. Lagre på 4 ° C i to uker.</li>
	<li>Forberede alginate hydrogel bruker 0,8% (w/v) natrium alginate løsning i sterilt PBS, så slipp 10 µL av denne løsningen i innkapsling løsningen (140 mM NaCl /50 mM CaCl2) til å opprette alginate perler. Merk: Alginate bead størrelse var ca 3 mm i diameter.</li>
</ol>
2. musen hårsekken isolasjon og innkapsling
<ol>
	<li>Innhente 14 dager gamle ICR kvinnelige mus av cervical forvridning, Fjern eggstokkene tas aseptisk ved hjelp av saks og tang, og satte eggstokkene til 2 mL håndtering medium.</li>
	<li>Halvert eggstokkene ved hjelp av en skalpell. Halv størrelse ovarian vevet var ca 1 mm tykkelse for kultur i kultur medium.</li>
	<li>Manuelt isolere follikler fra eggstokkene over 26 1/2-guage pinner under en 2-4 X stereomicroscope, og samle valgte follikler for kultur i kultur medium. Merk: Hårsekken utvalgskriterier: 1) follikler var runde med oocytes i midten og 2-3 lag av granulosa celler rundt oocytes, 2) follikler hadde en intakt basale membran vedlagt med noen theca celler, og 3) hårsekken størrelse var 90-100 µm i diameter</li>
	<li>Opprette alginate perler per trinn 1.3. Vask follikler med alginate løsning og deretter Pipetter en enkelt hårsekken i midten av hver alginate perle å gjøre visse hver perle inneholder en enkelt hårsekken under en stereomicroscope. Etter skylling i kultur medium, kultur på alginate perler i 150 µL av kultur medium i en 35 × kultur 10 mm parabol eller en RWV enhet.</li>
</ol>
3. ovarian vev eller hårsekken kultur Under simulert mikrogravitasjon
<ol>
	<li>Bruke en RWV enhet for å generere simulert mikrogravitasjon. Fylle skipet med lyset parafinolje (~ 10 mL), plassere 150 µL av kultur medium i en dråpe i olje, deretter overføre en del av eggstokkene eller tre alginate perler med innkapslede hårsekkene til middels slippverktøyet. Lukk fartøyet port hetten og fikse fartøyet på roterende bunnen av enheten.</li>
	<li>Kontroll grupper, plasser alginate perler som inneholder follikler eller ovarian vev i 150 µL av kultur medium i en dråpe dekket med lys parafinolje 35 × 10 mm kultur retter.</li>
	<li>Inkuber både kultur retter og RWV enhet i en fuktet inkubator på 37 ° C med 5% CO2 i luften.</li>
	<li>Endre kultur medium i RWV enhet: hell olje og mediet fartøyet i en 150 × 20 mm kultur parabol, overføre ovarian vev eller alginate perler til en kultur parabol med kultur medium. Gjenopprette fartøyet kultur systemet per trinn 3.1.</li>
</ol>
4. utpakking og hårsekken henting
<ol>
	<li>Etter 4 dager med dyrking, hell olje og mediet fartøyet i en 150 × 20 mm kultur parabol. Plukke opp alginate perler og decapsulate follikler fra alginate perler ved incubating inne håndtering medium med 10 U/mL alginate lyase i 30 min på 37 ° C.</li>
	<li>Samle follicles og deretter vaske dem i å håndtere middels under en stereomicroscope.</li>
</ol>
5. ovarian vev og hårsekken vurdering
<ol>
	<li>Cellen levedyktighet analysen
	<ol>
		<li>Vask decapsulated follikler tre ganger i D-PBS og deretter ruge dem i 150 µL av kombinerte celle levedyktighet analysen reagensene (2 µM calcein AM og 4 µM EthD-1) ved romtemperatur for 45 min.</li>
		<li>Overføre hårsekkene til en ren microscope skyve med 10 µL D-PBS, dekk med en dekkglassvæske, og deretter forsegle med klart fingernegl polish.</li>
		<li>Antall grønne og røde celler i lysbildene under AC confocal fluorescens mikroskop (400 X). Merk: I denne levedyktighet analysen, grønne celler er levende celler røde celler er døde celler. Follikler med mindre enn 10% røde celler (død) regnes som overlevde follikler.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hematoxylin og Eosin (H &#38; E) flekker av eggstokkene vev og hårsekken
	<ol>
		<li>Løse ferske 14 dager gamle musen eggstokkene og preantral follikler isolert fra 14 dager gamle mus i Bouins løsning som dag 0 prøver. Fastsette kulturperler ovarian vevet etter enten 2 eller 4-dager kultur og individuelle hårsekker inne alginate perler etter 4-dagers kultur som eksperimentelle prøver.</li>
		<li>Bygg inn alle prøvene i parafin delen serielt på 5 µm tykkelse, og deretter flekker med H &#38; E i henhold til produsentens instruksjoner.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hårsekken telle og Diameter måling
	<ol>
		<li>I eggstokkene vev deler med H &#38; E, telle alle follicles og sunn preantral follikler innen vev delen under et mikroskop (400 X forstørrelse). Beregne hårsekken tetthet ved å dele antall preantral follikler av antall follikler. Merk: sunn preantral follikler er de med minst to lag av granulosa celler.</li>
		<li>Mål hårsekken og oocyte diameter dag 0 follicles og dag 4 kultivert follikler.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunohistochemistry
	<ol>
		<li>Fikse ovarian vev i 4% paraformaldehyde, bygge inn i parafin delen på 5-µm-tykkelse, og montere vev deler på lysbilder. Dewax delene, rehydrate, og ruge dem i citrate buffer for 15 min. blokk av endogene peroxidase i 3% hydrogenperoksid, avsløre antigen i 5% geit serum og deretter ruge med primære antistoffer ved romtemperatur for 3t.<ol>
			<li>Vask i PBS i 3 minutter, deretter ruge lysbildene med 1:500 utvannet pepperrotperoksidase (HRP)-konjugert geit anti-kanin IgG (H + L) 1t ved romtemperatur. Merk: Primære antistoffer brukes i studien var kanin anti-GDF-9 antistoff (1:500 fortynning) og kanin anti-PCNA antistoff (1:200 fortynning).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Inkuber ovarian delen lysbilder med 3, 3-Diaminobenzidine [DAB] å oppdage peroxidase aktiviteten og montere på glass lysbilder med vandig montering medium.</li>
		<li>Observere ovarian delen lysbilder under et mikroskop på 400 X forstørrelse.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Overføring elektronmikroskop [TEM]
	<ol>
		<li>Fikse follikler i 2,5% glutaraldehyde for 3t ved romtemperatur, og deretter etter fikse i 1% osmium tetroxide 1t på 37 ° C.</li></ol></li></ol>Vask med PBS, deretter behandle follikler med 1% phosphotungstic syre og 1% natrium uranyl acetate 1t på 37 ° C. Tørke follikler bruker en aceton serie: 25, 50, 75, 95, og 100% (3 ganger) og epoxy harpiks-aceton blanding etter den siste 100% aceton trinn på 37 ° C, og deretter bygge inn i epoxy harpiks på 45 ° C.
		<li>Skjær innebygde blokkene i 1.0 µm semi tynne snitt og flekken avsnittene med 1% methylene blåfarge i 1-2 min å lokalisere hårsekkene i blokkene. Skjær innebygde blokkene i 50 nm ultrathin seksjoner og montere delene på nett for TEM.</li>
	
	

6. statistisk analyse
<ol>
	<li>Vise alle data i gjennomsnittlig ± SEM format. Fastslå forskjellene mellom grupper ved veis variansanalyse (ANOVA) etterfulgt av Tukey flere sammenligning test. Α terskelen for test resultat betydning ble satt på p &#60; 0,05.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Eppig, J. J., Schroeder, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+mouse+oocytes+from+preantral+follicles+to+undergo+embryogenesis+and+development+to+live+young+after+growth,+maturation,+and+fertilization+in+vitro.">Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro.</a> Biol Reprod. 41, 268-276 (1989).</li><li>O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+protocol+for+in+vitro+development+of+mouse+oocytes+from+primordial+follicles+dramatically+improves+their+developmental+competence.">A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence.</a> Biol Reprod. 68, 1682-1686 (2003).</li><li>Liu, J., Van der Elst, J., Van den Broecke, R., Dhont, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+offspring+by+in+vitro+fertilization+of+oocytes+from+cryopreserved+primordial+mouse+follicles+after+sequential+in+vivo+transplantation+and+in+vitro+maturation.">Live offspring by in vitro fertilization of oocytes from cryopreserved primordial mouse follicles after sequential in vivo transplantation and in vitro maturation.</a> Biology of Reproduction. 64, 171-178 (2001).</li><li>Parrish, E. M., Siletz, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+mouse+ovarian+follicle+development+in+vivo+versus+an+ex+vivo+alginate+culture+system.">Gene expression in mouse ovarian follicle development in vivo versus an ex vivo alginate culture system.</a> Reproduction. 142, 309-318 (2011).</li><li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+follicles+produce+live,+fertile+offspring.">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).</li><li>Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+stage-specific+permissive+in+vitro+culture+environment+for+follicle+growth+and+oocyte+development.">Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development.</a> Biol Reprod. 75, 916-923 (2006).</li><li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+tissues+in+real+and+simulated+microgravity:+new+methods+for+tissue+engineering.">Growing tissues in real and simulated microgravity: new methods for tissue engineering.</a> Tissue engineering. Part B, Reviews. 20, 555-566 (2014).</li><li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+responsiveness+of+endothelial+cells+to+vascular+endothelial+growth+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor+added+to+culture+media+under+gravity+and+simulated+microgravity.">Different responsiveness of endothelial cells to vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor added to culture media under gravity and simulated microgravity.</a> Tissue engineering Part A. 16, 1559-1573 (2010).</li><li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+delayed+type+of+three-dimensional+growth+of+human+endothelial+cells+under+simulated+weightlessness.">A delayed type of three-dimensional growth of human endothelial cells under simulated weightlessness.</a> Tissue engineering. Part A. 15, 2267-2275 (2009).</li><li>Pietsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+proteins+identified+in+human+thyroid+cells.">Interaction of proteins identified in human thyroid cells.</a> International journal of molecular sciences. 14, 1164-1178 (2013).</li><li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+using+a+rotary+cell+culture+system+promotes+chondrogenesis+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+via+the+p38+MAPK+pathway.">Simulated microgravity using a rotary cell culture system promotes chondrogenesis of human adipose-derived mesenchymal stem cells via the p38 MAPK pathway.</a> Biochem Biophys Res Commun. 414, 412-418 (2011).</li><li>Maier, J. A., Cialdai, F., Monici, M., Morbidelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microgravity+and+hypergravity+on+endothelial+cells.">The impact of microgravity and hypergravity on endothelial cells.</a> Biomed Res Int. 2015, 434803 (2015).</li><li>Zhu, M., Jin, X. W., Wu, B. Y., Nie, J. L., Li, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+simulated+weightlessness+on+cellular+morphology+and+biological+characteristics+of+cell+lines+SGC-7901+and+HFE-145.">Effects of simulated weightlessness on cellular morphology and biological characteristics of cell lines SGC-7901 and HFE-145.</a> Genet Mol Res. 13, 6060-6069 (2014).</li><li>Dang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+increases+heavy+ion+radiation-induced+apoptosis+in+human+B+lymphoblasts.">Simulated microgravity increases heavy ion radiation-induced apoptosis in human B lymphoblasts.</a> Life Sci. 97, 123-128 (2014).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+compromises+mouse+oocyte+maturation+by+disrupting+meiotic+spindle+organization+and+inducing+cytoplasmic+blebbing.">Simulated microgravity compromises mouse oocyte maturation by disrupting meiotic spindle organization and inducing cytoplasmic blebbing.</a> PLoS One. 6, e22214 (2011).</li><li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+differentiation+factor-9+is+required+during+early+ovarian+folliculogenesis.">Growth differentiation factor-9 is required during early ovarian folliculogenesis.</a> Nature. 383, 531-535 (1996).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+Microgravity+Using+a+Rotary+Culture+System+Compromises+the+In+Vitro+Development+of+Mouse+Preantral+Follicles.">Simulated Microgravity Using a Rotary Culture System Compromises the In Vitro Development of Mouse Preantral Follicles.</a> PLoS One. 11, e0151062 (2016).</li></ol>

Forfatterne erklærer at de har ingen konkurrerende økonomiske interesser.

Kritisk fremgangsmåten for vellykket dyrking av preantral follikler er: 1) velge riktig preantral follikler ifølge utvalgskriteriene som ble beskrevet i protokollen tekst 2.1); 2) preforming alle prosedyrer i en skeptisk tilstand og opprettholde en steril kultur; og 3) riktig å sette opp RWV kultur-systemet.
Ivaretakelse av konsistensen av eksperimentelle observasjoner i Repliker eksperimenter er å bruke lignende eller identiske materialer. Kriteriene for valg av mus preantral follikler viste at hårsekkene hadde 1) sunn oocytes på germinal vesicle nedbryting (GVBD) scenen omgitt av en tynn zona pellucida; 2) 2-3 lag av granulosa celler omsluttet av en basal membran; og 3) noen thecal celler knyttet til basale membranen. Dermed follikler valgt hadde ikke bare alle tre funksjonelle rom med en ovarian follikkelen for å støtte oocyte vekst, men også en lignende morfologiske identifikasjon med en diameter på 90-100 µm.
Dette er første forsøk på å vokse musen preantral follikler på måten av 3D dyrking under den simulerte mikrogravitasjon. Flere kultur systemer har blitt utviklet for mus preantral follikler. Oocytes fra hårsekken kultivert på flate petri retter, den såkalte 2D kulturen, kan befruktes og produsert live avkom. Videre opprettholde 3D kulturer, som kulturer av hårsekkene i alginate perler, en vevet struktur lik hva kroppen produserer i høy andel meiotically kompetent oocytes. Men er utviklingsprosessen til eggstokkene follikler/oocytes i et null-gravitasjon ukjent. RWV, en enhet som tiltrekker betydelig oppmerksomhet i vev engineering, kan generere en simulert mikrogravitasjon miljø og gi et ideelt miljø for å undersøke effekten av simulert mikrogravitasjon på ovarian follikkelen/oocytes vekst i vitro.
Det er viktig å konfigurere RWV apparater for cellekultur. Luftbobler i fartøyet må fjernes. Metoden å fjerne luftbobler, hvis generert i fartøyet, er som følger: plassere to sprøyter med 0,5 mL olje i hver av de to sprøyte portene. Åpne ventiler kontrollere sprøyte portene. Manøvrere luftbobler under sprøytepumpe porten. Dra bobler i sprøyten mens injisering omtrent samme volum av media gjennom andre sprøytepumpe porten. Etter alle bobler er fjernet, lukker ventilene, fjerne sprøyter og erstatte sprøytepumpe porten caps. Det er også viktig å finne ut riktig rotasjonshastigheten, som hindrer cellene seg via en konstant rotasjon. Optimalisering av rotasjonshastigheten bestemmes av egenvekt av cellene, flytende tetthet og viskositeten.
Uttrykket profiler av PCNA og GDF-9, som var lik de i GDF-9-mangelfull musen follikler16, avslørte at simulert mikrogravitasjon hadde skadevirkninger på utviklingen av granulosa celler og oocytes. Fartøyet av RWV enheten spunnet rundt en vannrett akse innenfor en 5% CO2 inkubator, slik at gjennomtrengning av oksygen og karbondioksid over en membran i ryggen, gir effektiv oksygenering og svært lav skjæring stress, som var sannsynligvis ikke det årsaken til hårsekken/oocyte skade. Optimalisering av eksperimentelle oppsett og videre analyser for å undersøke mekanismen av de skadelige virkningene.
Videre studier er nødvendig for å undersøke den utviklingsmessige potensialet av i vitro oocytes avledet fra RWV kultur-systemet. In vitro modning av oocytes MII scenen er for tiden blir utført. Siste valideringen av denne kultur-systemet vil bli undersøkt av befruktning kapasitet Hentet oocytes.

In vitro ovarian follikkelen utvikling og oocyte modning er oppnådd bruke tradisjonelle metoder for 2-dimensjonal kultur, som på overflaten av petri retter, og tre-dimensjonale (3D) matrix, som alginate og hydrogel1 ,2,3. En 3D kultur-systemet effektivt opprettholdes follikler i en vev-lignende struktur holdt lignende genet uttrykket profiler i vivo4 hårsekker og produsert meiotically kompetent oocytes5,6. 3D kultur systemer kan også opprettes i en matrix-fri tilstand, for eksempel hengende slippe suspensjon og rullende fartøy. Det roterende veggen fartøyet (RWV) utviklet av National Aeronautics and Space Administration (NASA) genererer en simulert mikrogravitasjon (s-µg) for cellene kultivert innsiden av fartøyet7. Denne simulerte mikrogravitasjon tilstand gir en unik kultur-systemet for celle spredning og differensiering på grunn av sedimentering for konveksjon. Det har vist at simulert mikrogravitasjon forfremmet endothelial fartøyet formasjon endotelceller8,9, skjoldbrusk vev montering fra thyroid cellene10og chondrogenesis fra liggende under adipose-avledet Mesenchymal stamceller i RWV enheter11. Men har andre studier vist at simulert mikrogravitasjon indusert apoptose i mage celler og B lymphoblasts12,13,14, tyder effekten av simulert mikrogravitasjon på cellular skade kan være celle Typeavhengige. Simulert mikrogravitasjon kan også forårsake endringer på ultrastructural nivå, som rapportert i forstyrret spindel organisasjonen og indusert cytoplasmatiske blebbing i oocytes15. Optimalisert simulert mikrogravitasjon betingelsene og mekanismer som induserer tissue engineering eller cellular skader under system krever videre etterforskning. In vitro eksperimenter av voksende ovarian follikler/oocytes med RWV enheter kan gi verdifull informasjon om oocyte genet uttrykk og ultrastructures av oocyte organeller. I denne studien ovarian vev som inneholder preantral follicles og isolerte preantral follikler ble brukt til å undersøke virkningene av simulert mikrogravitasjonpå hårsekken utvikling og oocyte modning.
I denne studien ovarian vev som inneholder preantral follicles og isolerte preantral follikler ble brukt til å undersøke virkningene av simulert mikrogravitasjon på hårsekken utvikling og oocyte modning. I vår studie, RWV, gir en simulert mikrogravitasjon enhet, spinner rundt en vannrett akse innenfor en 5% CO2 incubator, en simulert mikrogravitasjon tilstand med effektiv oksygenering og svært lav skjæring stress. Vi analyserte genet uttrykk for voksende celle kjernefysiske antigen (PCNA) og differensiering vekstfaktor 9 (GDF-9) som indikatorer for utviklingen av granulosa celler og oocytes, henholdsvis. Vi viste at PCNA og GDF-9 ble undertrykket i granulosa celler og oocytes, henholdsvis når kultivert RWV enheten, og vi viste tilbaketrekning av oocyte microvilli fra zona pellucida i hårsekkene kultivert under s-µ g tilstand, som var lik som i GDF-9-mangelfull musen follikler16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="999">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ICR mice</td>
			<td style="width:121px;">SLRC Laoratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:543px;">14-day-old female mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-15 medium</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L1518</td>
			<td>With L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10100147</td>
			<td>Origin: Australia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin V potassium</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1504503</td>
			<td>United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard (USP)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Streptomycin sesquisulfate hydrate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">46754</td>
			<td>Analytical standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Universal&#160;Click&#160;Pen Needles</td>
			<td style="width:121px;">Penfine</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>12&#215;1/2&#34; 0.33&#215;12 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alginate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">alpha-minimal essential medium</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>M0894</td>
			<td style="width:543px;">Alpha Modification, with L-glutamine, without ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin-selenium-transferrin</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">51500056</td>
			<td>Liquid, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GONAL-F</td>
			<td style="width:121px;">Merck Serono</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Recombinant follitropin alfa for injection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Disposable high-aspect-ratio rotating vessel</td>
			<td style="width:121px;">Synthecon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Culture oil</td>
			<td style="width:121px;">Vitrolife</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sterile light paraffin oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alginate Lyase</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1603</td>
			<td>powder, &#62;10,000 units/g solid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">26 1/2-guage needle</td>
			<td style="width:121px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35&#215;10mm dish</td>
			<td style="width:121px;">Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Viability/Cytotoxicity assay Kit</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bouin&#8217;s solution</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">HT10132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:121px;">Jackson Immuno-Research Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">111-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride</td>
			<td style="width:121px;">Beyotime</td>
			<td style="width:119px;">P0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aqueous mounting medium</td>
			<td style="width:121px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">C0563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Rabbit anti-GDF-9 antibody</td>
			<td style="width:121px;">Beijing Biosynthesis Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">BS-175R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit anti-PCNA antibody</td>
			<td style="width:121px;">Proteintech</td>
			<td>24036-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:121px;">Hitachi</td>
			<td style="width:119px;">H-7500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro growth of mouse preantral follicles under simulated microgravity

14 dager gamle musen ovarian vev og preantral follikler isolert fra samme-alderen mus var ruges i et simulert mikrogravitasjon kultur-systemet. Vi kvantitativt vurdert hårsekken overlevelse, målt hårsekken og oocyte diameter og undersøkt ultrastructure av oocytes produsert fra systemet. Vi observert redusert hårsekken overlevelse, downregulation av uttrykk for voksende celle kjernefysiske antigen og differensiering vekstfaktor 9, som indikatorer for utviklingen av granulosa celler og oocytes, henholdsvis, og oocyte ultrastructural abnormiteter under forutsetning av simulert mikrogravitasjon. Simulert mikrogravitasjon eksperimentelle oppsett må være optimalisert for å gi en modell for undersøkelse av mekanismer involvert i oocyte/hårsekken i vitro utviklingen.

Figur 1A viser en RWV med oljen innsiden av fartøyet. En dråpe av 150 µL medium som inneholder en del av eggstokkene eller tre alginate perler med innkapslede follikler ble satt inn i olje. Middels slippverktøyet ble holdt i en tilstand av terminal hastighet på grunn av væske dra på dråpene innen roterende olje minst 25 rotasjoner per minutt, generert en simulert mikrogravitasjon (s-µg) tilstand. I en kontroll eksperimentet, ovarian vev eller capsulated follikler ble kultivert i en dråpe av 150 µL medium dekket med mineralolje i 35 × 10 mm retter (figur 1B), genereres en 1 -g tilstand.
For å studere virkningene av simulert mikrogravitasjon på preantral hårsekken utvikling i vitro, vi kulturperler 14 dager gamle musen ovarian vevet under 1 -g (kontroll eksperimentet) eller s-µg forhold. Vi teller antall sunt follikler i H &#38; E farget deler i to betingelser etter 0, 2 og 4 dager med kultur (figur 2). Vi fant at hårsekken overlevelse i eggstokkene vev behandlet s-µg tilstanden var betydelig lavere enn under den 1 -g tilstand på dag 2 og dag 4 i dyrking (p &#60; 0,05, ANOVA). Videre fant vi at ingen PCNA positive signaler ble oppdaget i eggstokkene vevet under s-µg forutsetning (Figur 3). I kulturen i isolerte preantral follikler innkapslet i alginate perler, vi viste at betydelig mer follikler overlevde under 1 -g tilstand (76,8% ± 5,3%, n = 227) enn s-µg tilstand (54.4% ± 6,7%, n = 249) på dag 4 dyrking . I tillegg oocyte størrelse hadde ingen betydelig økning etter 4 dager dyrking, skjønt hårsekken størrelse betraktelig under begge tyngdekraften forhold (Figur 4). Men follikler med mindre enn 10% døde granulosa celler (figur 5) var betydelig lavere under 1 -g tilstand (81,5 ± 5%, n = 10) enn under s-µg tilstand (90 ± 8%, n = 10) (p &#60; 0,05).
Undersøke effektene av simulert mikrogravitasjon på oocyte funksjonalitet, undersøkte vi uttrykket av oocyte-spesifikke markøren GDF-9. Vi viste at GDF-9 uttrykk var bemerkelsesverdig ned-regulert i eggstokkene vevet under s-µg tilstand (figur 6). I tillegg viste vi hyppige ultrastructural unormale oocyte organeller i innkapslet follicles på dag 4 av kultur under s-µg forutsetning (figur 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig1.jpg"> 
Figur 1 : Oppsett av s -µg og 1-g kultur forhold. (A) s-µg ble opprettet av den roterende veggen fartøyet og holde kultur fag i en tilstand av konstant fritt fall innen flytte olje. (B) en 1 -g tilstand ble opprettet av dyrking ovarian vev eller follikler på overflaten av en Petriskål dekket med mineralolje. Pilen viser en dråpe av medium. Skala bar = 1 cm. Dette tallet har blitt endret fra Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig2.jpg"> 
Figur 2 : Effekter av s-µg på ovarian vev kultur. (A) deler av eggstokkene vev kulturperler under 1 -g eller s-µg vilkår for 0, 2 og 4 dager. Skala bar = 50 µm. (B) hårsekken tetthet i delene ovarian vev. Feil bar representerer 1 SEM, *: p &#60; 0,05. Dette tallet har blitt endret fra Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig3.jpg"> 
Figur 3 : Immunhistokjemi av PCNA. PCNA protein uttrykk ble undersøkt i granulosa celler i eggstokkene vevet kulturperler under 1 -g eller s-µg vilkår for 0, 2 og 4 dager. Skala bar = 50 µm. Dette tallet har blitt endret fra Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig4.jpg"> 
Figur 4 : Effekter av s-µg på kulturen i encapsulated preantral follikler i alginate perler. (A) morfologi av preantral follikler kulturperler under 1 -g eller s-µg vilkår for 0 dager og 4 dager. Skala bar = 50 Oocyte diameter µm. (B) og (C) hårsekken diameter var forhold mellom 1 g og s-µg forhold. Feil bar representerer 1 SEM, *: p &#60; 0,05. Dette tallet har blitt endret fra Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig5.jpg"> 
Figur 5 : Celle levedyktighet analysen. Representant bilder ble tatt under et mikroskop på 400 X forstørrelse. Analysen bruker Calcein AM å visualisere lever celler farget i grønt og EthD-1 å visualisere kjerner i døde celler farget i rødt. (A): en follicle med ~ 100% live granulosa celler (grønn). (B): en follicle med live granulosa celler (grønn), i tillegg til mer enn 10% døde celler (rød). Skala bar = 50 µm.Dette tallet har blitt endret fra Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig6.jpg"> 
Figur 6 : Immunhistokjemi av GDF-9. GDF-9 protein uttrykk ble undersøkt i oocytes i eggstokkreft vevet kulturperler under 1 -g eller s-µg vilkår for 0, 2 og 4 dager. Skala bar = 50 µm. Dette tallet har blitt endret fra Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig7.jpg"> 
Figur 7 : Ultrastructural analyse av isolerte preantral follikler kultivert under 1 - g eller s-µ g forhold på dag 4 av kultur. (A) en oocyte med microvilli (piler) utvide inn i zona pellucida (1 -g tilstand). (B-F) Oocytes med stor vacuoles (*), multilamellar organer (#), lipid dråper (piler), vacuolated mitokondrier mangler cristae (pil), og spre Golgi apparatet (pil), henholdsvis (s-µg tilstand). O: oocyte; ZP: zona pellucida. Dette tallet har blitt endret fra Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig7large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity at JoVE.com

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

En lovende teknikk for å generere vev lager uten hjelp av matrise er kultur celler i en simulert mikrogravitasjon tilstand. Bruker en roterende kultur, undersøkte vi ovarian follikkelen vekst og oocyte modning i hårsekken overlevelse, morfologi, vekst og oocyte funksjonen under forutsetning av simulert mikrogravitasjon.

In Vitro Veksten av musen Preantral follikler Under simulert mikrogravitasjon

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Kultur og Co-Culture of Mouse Eggstokkene og ovariefollikler

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Karakterisering av Thymus- Bosetting stamfedre i Mouse Embryo hjelp<em&gt; I Vivo</em&gt; Og<em&gt; In Vitro</em&gt; Analyser

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generering av Aggregater av mus embryonale stamceller som Vis Symmetry Breaking, Polarisering og Emergent Collective Behaviour<em&gt; In Vitro</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolering av Mouse Livmor Epithelial og stromale celler for<em&gt; In Vitro</em&gt; Decidualization

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

Romanen bruk av tredimensjonal høyfrekvente Ultrasonography for tidlig Graviditet karakterisering musen

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generasjon av stillaset-fri, tredimensjonale Insulin uttrykke Pancreatoids fra musen bukspyttkjertelen Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisere Node og Notochordal Plate i Gastrulating Mouse embryoer skanning elektronmikroskop og hele Mount Immunofluorescence

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Induksjon av Endothelial differensiering i Cardiac Progenitor celler Under lav Serum forhold

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Bestemme galle duct tetthet i musen Liver

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...