Name: in vitro growth of mouse preantral follicles under simulated microgravity
Uploaded: 2017-12-17T13:00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity at JoVE.com

Författarna vill tacka Yilong Wang och Yanlin Zhao för deras hjälp att upprätthålla djuren, Chan Zhang för hennes hjälp med att förbereda de histologiska proverna och Dr Songtao He för att kritiskt läsa detta manuskript. Detta arbete stöds av naturvetenskap Foundation av Zhejiangprovinsen (bevilja nummer: LY13C120002).

Etiskt godkännande för denna studie erhölls från djur forskning etiska kommittén av Wen Zhou Medical College.
1. beredning av kultur Media och alginat Hydrogel
<ol>
	<li>Utarbeta äggstockscancer vävnad och follikeln hantering medium med l-15-medium med 10% fetalt bovint serum, 100 IE/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin. Förvaras vid 4 ° C i två veckor.</li>
	<li>Förbereda äggstocksvävnad och follikeln odlingsmedium bestående av alpha-väsentliga minimalmedium [α-MEM] kompletterad med 5% fetalt bovint serum [FBS], 1% insulin-selen-transferrin, 10 mIU/ml rFSH, 100 IE/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin. Förvaras vid 4 ° C i två veckor.</li>
	<li>Förbereda alginat hydrogel med 0,8% (w/v) natriumalginat lösning i steril fosfatbuffrad Koksaltlösning och sedan släppa 10 µL av denna lösning i inkapsling lösningen (140 mM NaCl /50 mM CaCl2) att skapa alginat pärlor. Obs: Alginat pärla storlek var cirka 3 mm i diameter.</li>
</ol>
2. mus follikeln isolering och inkapsling
<ol>
	<li>Slakta 14 dagar gamla ICR honmöss av cervikal dislokation, ta bort äggstockarna aseptiskt med sax och pincett, och sätta äggstockarna i 2 mL hantering medium.</li>
	<li>Halvera äggstockarna med en skalpell. Den halv-sized äggstocksvävnad var ca 1 mm tjocklek för kultur i odlingssubstratet.</li>
	<li>Manuellt isolera folliklar från äggstockarna med 26 1/2-gauge nålar under en 2-4 X stereomikroskopet och samla valda hårsäckarna för kultur i odlingssubstratet. Obs: Follikeln urvalskriterier: 1) folliklar var runda med oocyter i mitten och 2-3 lager av granulosa celler kring oocyterna, 2) folliklar hade ett intakt basal membran fästs med vissa theca celler, och 3) follikeln storlek var 90-100 µm i diameter</li>
	<li>Skapa alginat pärlor per steg 1.3. Tvätta folliklar med alginat lösning och sedan Pipettera en enda follikel i mitten av varje alginat pärla att göra vissa varje pärla innehåller en enda follikel under ett stereomikroskop. Efter sköljning i odlingsmedium, kultur i alginat pärlor i 150 µL av odlingsmedium i en 35 × kultur 10 mm maträtt eller en virtuell enhet.</li>
</ol>
3. äggstocksvävnad eller follikeln kultur Under simulerade tyngdlöshet
<ol>
	<li>Använda en virtuell enhet för att generera simulerade mikrogravitation. Fyll kärlet med ljus paraffinolja (~ 10 mL), placera 150 µL av odlingsmedium i ett droplet-program i oljan och sedan överföra ett stycke för äggstocksvävnad eller tre alginat pärlor med inkapslade folliklar i medelstora droplet-programmet. Skruva på hatten på fartyget port och fixa fartyget på roterande basen av enheten.</li>
	<li>Grupper, placera alginat pärlor som innehåller folliklar eller äggstocksvävnad in 150 µL av odlingsmedium i en droplet täckt med ljus paraffinolja i 35 × 10 mm kultur rätter i kontroll.</li>
	<li>Inkubera både kultur rätter och virtuell enhet i en fuktad inkubator vid 37 ° C med 5% CO2 i luften.</li>
	<li>Ändra odlingsmedium i virtuell enhet: Häll olja och medium från fartyget i en 150 × 20 mm kultur maträtt, överföra äggstockscancer vävnad eller alginat pärlorna till en kultur skålen med odlingsmedium. Återupprätta fartyget kultur systemet per steg 3.1.</li>
</ol>
4. avkodning av inkapsling och follikeln hämtning
<ol>
	<li>Efter 4 dagars odling, häll olja och medium från fartyget i en 150 × 20 mm kultur maträtt. Plocka upp alginat pärlor och decapsulate folliklar från alginat pärlorna genom ruvning i hantering medium kompletteras med 10 U/mL alginat lyasen under 30 minuter vid 37 ° C.</li>
	<li>Samla folliklar och sedan tvätta dem i hantering medium under ett stereomikroskop.</li>
</ol>
5. äggstocksvävnad och follikeln bedömning
<ol>
	<li>Cell livskraft Assay
	<ol>
		<li>Tvätta decapsulated folliklar tre gånger i D-PBS och sedan ruva dem i 150 µL av de kombinerade Cell livskraft analysreagenser (2 µM calcein AM och 4 µM EthD-1) i rumstemperatur i 45 min.</li>
		<li>Överföra folliklar till ett rent objektglas med 10 µL D-PBS, täck med ett täckglas och sedan skrivskydda med tydlig Nagel polska.</li>
		<li>Räkna gröna och röda blodkroppar i bilderna under en confocal fluorescens Mikroskop (X 400). Obs: I denna livskraft analys, gröna celler är levande celler, och röda celler är döda celler. Folliklar med mindre än 10% erytrocyter (döda) betraktas som överlevde folliklar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Hematoxylin och Eosin (H &#38; E) färgning för äggstocksvävnad och follikel
	<ol>
		<li>Fixa fräsch 14 dagar gamla mus äggstockarna och preantral folliklar isolerade från 14 dagar gamla möss i Bouins lösning som dag 0 prover. Fixa den odlade äggstocksvävnad efter antingen 2-dagars eller 4-dagars kultur och enskilda folliklar inne alginat pärlor efter 4 dagars kultur som experimentella prover.</li>
		<li>Bädda in alla prover i paraffin, avsnitt seriellt på 5 µm tjocklek, och sedan fläcken med H &#38; E enligt tillverkarens anvisningar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Follikeln räknar och diametermätning
	<ol>
		<li>I äggstocksvävnad sektioner färgas med H &#38; E, räkna alla folliklar och friska preantral folliklar inom området vävnad avsnitt under ett mikroskop (400 X förstoring). Beräkna follikeln densitet genom att dividera antalet preantral folliklar av det totala antalet folliklar. Obs: friska preantral hårsäckarna är de med minst två lager av granulosa celler.</li>
		<li>Åtgärd follikeln och äggcell diameter av folliklar som dag 0 och dag 4 odlade folliklar.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunohistokemi
	<ol>
		<li>Fixa äggstocksvävnad i 4% paraformaldehyd, bädda in i paraffin, avsnitt på 5-µm-tjocklek, och montera vävnadssnitt på bilder. Dewax avsnitten, rehydrera, inkubera dem i citratbuffert för 15 min. Block endogena peroxidaset i 3% väteperoxid, demaskera antigen i 5% get serum och sedan Inkubera med primära antikroppar i rumstemperatur i 3 h.<ol>
			<li>Tvätta i PBS för 3 min, sedan Inkubera bilderna med 1: 500 utspädd pepparrotsperoxidas (HRP)-konjugerad get anti-kanin IgG (H + L) för 1 h i rumstemperatur. Obs: De primära antikroppar som användes i studien var kanin-anti-GDF-9-antikropp (1: 500 utspädning) och kanin-anti-PCNA antikropp (spädning 1: 200).</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Odling av äggstockscancer avsnitt objektglas med 3, 3'-Diaminobenzidin [DAB] att detektera peroxidasaktiviteten och montera på glasskivor med aqueous monteringsmedium.</li>
		<li>Iaktta cystor avsnitt diabilder i Mikroskop på 400 X förstoring.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transmissionselektronmikroskopi [TEM]
	<ol>
		<li>Fixa folliklar i 2,5% glutaraldehyd för 3 h i rumstemperatur, då efter fixa i 1% osmium vanligtvis för 1 h vid 37 ° C.</li></ol></li></ol>Tvätta med PBS, sedan behandla hårsäckarna med 1% phosphotungstic syra och 1% natriumacetat uranyl för 1 h vid 37 ° C. Torkar ut äggblåsor med hjälp av en aceton serie: 25, 50, 75, 95 och 100% (3 gånger) och epoxi harts-aceton blandningen efter sista 100% aceton steg vid 37 ° C och sedan bädda in i epoxiharts vid 45 ° C.
		<li>Skär de inbäddade block i 1,0 µm semi tunna snitt, och fläckar avsnitten med 1% metylenblått för 1-2 min till lokalisera hårsäckarna i blocken. Skär de inbäddade block i 50 nm ultrathin sektioner och montera avsnitten på galler för TEM.</li>
	
	

6. statistisk analys
<ol>
	<li>Presentera alla data i medelvärde ± SEM format. Bestämma skillnaderna mellan grupper av envägs variansanalys (ANOVA) följt av Tukey flera jämförande test. Α tröskeln för test resultat betydelse fastställdes till p &#60; 0,05.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Eppig, J. J., Schroeder, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capacity+of+mouse+oocytes+from+preantral+follicles+to+undergo+embryogenesis+and+development+to+live+young+after+growth,+maturation,+and+fertilization+in+vitro.">Capacity of mouse oocytes from preantral follicles to undergo embryogenesis and development to live young after growth, maturation, and fertilization in vitro.</a> Biol Reprod. 41, 268-276 (1989).</li><li>O'Brien, M. J., Pendola, J. K., Eppig, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+revised+protocol+for+in+vitro+development+of+mouse+oocytes+from+primordial+follicles+dramatically+improves+their+developmental+competence.">A revised protocol for in vitro development of mouse oocytes from primordial follicles dramatically improves their developmental competence.</a> Biol Reprod. 68, 1682-1686 (2003).</li><li>Liu, J., Van der Elst, J., Van den Broecke, R., Dhont, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Live+offspring+by+in+vitro+fertilization+of+oocytes+from+cryopreserved+primordial+mouse+follicles+after+sequential+in+vivo+transplantation+and+in+vitro+maturation.">Live offspring by in vitro fertilization of oocytes from cryopreserved primordial mouse follicles after sequential in vivo transplantation and in vitro maturation.</a> Biology of Reproduction. 64, 171-178 (2001).</li><li>Parrish, E. M., Siletz, A., Xu, M., Woodruff, T. K., Shea, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+mouse+ovarian+follicle+development+in+vivo+versus+an+ex+vivo+alginate+culture+system.">Gene expression in mouse ovarian follicle development in vivo versus an ex vivo alginate culture system.</a> Reproduction. 142, 309-318 (2011).</li><li>Xu, M., Kreeger, P. K., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue-engineered+follicles+produce+live,+fertile+offspring.">Tissue-engineered follicles produce live, fertile offspring.</a> Tissue Eng. 12, 2739-2746 (2006).</li><li>Xu, M., West, E., Shea, L. D., Woodruff, T. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+a+stage-specific+permissive+in+vitro+culture+environment+for+follicle+growth+and+oocyte+development.">Identification of a stage-specific permissive in vitro culture environment for follicle growth and oocyte development.</a> Biol Reprod. 75, 916-923 (2006).</li><li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growing+tissues+in+real+and+simulated+microgravity:+new+methods+for+tissue+engineering.">Growing tissues in real and simulated microgravity: new methods for tissue engineering.</a> Tissue engineering. Part B, Reviews. 20, 555-566 (2014).</li><li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Different+responsiveness+of+endothelial+cells+to+vascular+endothelial+growth+factor+and+basic+fibroblast+growth+factor+added+to+culture+media+under+gravity+and+simulated+microgravity.">Different responsiveness of endothelial cells to vascular endothelial growth factor and basic fibroblast growth factor added to culture media under gravity and simulated microgravity.</a> Tissue engineering Part A. 16, 1559-1573 (2010).</li><li>Grimm, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+delayed+type+of+three-dimensional+growth+of+human+endothelial+cells+under+simulated+weightlessness.">A delayed type of three-dimensional growth of human endothelial cells under simulated weightlessness.</a> Tissue engineering. Part A. 15, 2267-2275 (2009).</li><li>Pietsch, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interaction+of+proteins+identified+in+human+thyroid+cells.">Interaction of proteins identified in human thyroid cells.</a> International journal of molecular sciences. 14, 1164-1178 (2013).</li><li>Yu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+using+a+rotary+cell+culture+system+promotes+chondrogenesis+of+human+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells+via+the+p38+MAPK+pathway.">Simulated microgravity using a rotary cell culture system promotes chondrogenesis of human adipose-derived mesenchymal stem cells via the p38 MAPK pathway.</a> Biochem Biophys Res Commun. 414, 412-418 (2011).</li><li>Maier, J. A., Cialdai, F., Monici, M., Morbidelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+microgravity+and+hypergravity+on+endothelial+cells.">The impact of microgravity and hypergravity on endothelial cells.</a> Biomed Res Int. 2015, 434803 (2015).</li><li>Zhu, M., Jin, X. W., Wu, B. Y., Nie, J. L., Li, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+simulated+weightlessness+on+cellular+morphology+and+biological+characteristics+of+cell+lines+SGC-7901+and+HFE-145.">Effects of simulated weightlessness on cellular morphology and biological characteristics of cell lines SGC-7901 and HFE-145.</a> Genet Mol Res. 13, 6060-6069 (2014).</li><li>Dang, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+increases+heavy+ion+radiation-induced+apoptosis+in+human+B+lymphoblasts.">Simulated microgravity increases heavy ion radiation-induced apoptosis in human B lymphoblasts.</a> Life Sci. 97, 123-128 (2014).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+microgravity+compromises+mouse+oocyte+maturation+by+disrupting+meiotic+spindle+organization+and+inducing+cytoplasmic+blebbing.">Simulated microgravity compromises mouse oocyte maturation by disrupting meiotic spindle organization and inducing cytoplasmic blebbing.</a> PLoS One. 6, e22214 (2011).</li><li>Dong, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+differentiation+factor-9+is+required+during+early+ovarian+folliculogenesis.">Growth differentiation factor-9 is required during early ovarian folliculogenesis.</a> Nature. 383, 531-535 (1996).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simulated+Microgravity+Using+a+Rotary+Culture+System+Compromises+the+In+Vitro+Development+of+Mouse+Preantral+Follicles.">Simulated Microgravity Using a Rotary Culture System Compromises the In Vitro Development of Mouse Preantral Follicles.</a> PLoS One. 11, e0151062 (2016).</li></ol>

Författarna förklarar att de har inga konkurrerande finansiella intressen.

De kritiska steg för lyckad odling av preantral folliklar är: 1) att korrekt välja preantral hårsäckarna enligt urvalskriterier som beskrevs i protokollet Text 2.1); (2) Förformning alla procedurer i en skeptisk skick och underhålla en steril kultur; och 3) korrekt ställa in virtuell kultur systemet.
Skyddet av konsekvens av experimentella observationer i replikera experiment är att använda liknande eller identiska material. Kriterierna för urval av mus preantral folliklar visade att hårsäckarna hade 1) friska oocyter i skede germinal vesikler uppdelning (GVBD) omges av en tunn zona pellucida; (2) 2-3 lager av granulosa celler omges av en basal membran; och 3) vissa thecal celler bifogas med basala membranet. Således, hårsäckarna valt hade inte bara alla tre funktionella fack i en äggblåsa för att stödja äggcellen tillväxt, men också en liknande morfologisk identifiering med en diameter på 90-100 µm.
Detta är det första försöket att växa mus preantral folliklar på samma sätt som 3D odling under den simulerade mikrogravitation. Flera kultur-system har utvecklats för mus preantral folliklar. Oocyter som erhållits från follikeln odlade på en plan yta av petriskålar, den så kallade 2D kulturen, kunde befruktas och producerat levande avkomma. Dessutom upprätthålla 3D kulturer, till exempel kulturer av folliklar i alginat pärlor, en vävnad struktur liknar vad kroppen producerar i hög andel meiotically behöriga oocyter. Utvecklingsprocessen av äggstockscancer folliklar/oocyter i ett nollgravitation fält är dock okänd. Virtuell, en anordning som väcker stor uppmärksamhet i vävnadsteknik, kan generera en simulerad mikrogravitation miljö och erbjuder en idealisk miljö för att undersöka effekterna av simulerade tyngdlöshet på ovarian follicle/oocyter tillväxten in vitro.
Det är viktigt att ställa in virtuell apparaten ordentligt för cellodling. Luftbubblor i kärlet måste tas bort. Metoden för att avlägsna luftbubblor, om genereras i fartyget, är följande: Placera två sprutor med 0,5 mL olja i varje av de två spruta hamnarna. Öppna de ventiler som styr spruta hamnarna. Manövrera luftbubblor under sprutporten. Dra bubblor i sprutan och injicera ungefär samma volym av media via andra sprutporten. Efter alla bubblor tas bort, stänga ventilerna, ta bort sprutor och ersätta sprutan port mössor. Det är också avgörande för att ta reda på rätt rotationshastighet, som hindrar celler från att lösa via en ständig rotation. Optimering av rotationshastighet bestäms av den specifika vikten av cellerna, fluid densitet och viskositet.
Uttrycket profiler av PCNA och GDF-9, som var liknande dem i GDF-9-brist mus folliklar16, avslöjade det simulerade mikrogravitation hade negativa effekter på utvecklingen av granulosa celler och oocyter. Fartyget av virtuell enheten snurrade runt en horisontell axel inuti en 5% CO2 inkubator, möjliggör genomträngning av syre och koldioxid över ett membran i ryggen, som ger effektiv syresättning och mycket låg skjuvspänning, som var osannolikt att de orsak till follikeln/äggcellen skada. Optimering av experiment och ytterligare analyser behövs för att undersöka mekanismen av de skadliga effekterna.
Ytterligare studier behövs för att undersöka utvecklingspotentialen av in vitro- oocyterna härrör från virtuell kultur systemet. In vitro mognad av oocyter till MII skede genomförs för närvarande. Slutliga valideringen av detta kultur-system kommer att granskas av Hämtad oocyterna befruktning kapacitet.

In vitro äggblåsa utveckling och oocytmognaden har uppnåtts med traditionella metoder för 2-dimensionella kultur, som på ytan av petriskålar och tre dimensionell (3D) matris, såsom alginat och hydrogel1 ,2,3. Ett 3D kultur system effektivt underhålls folliklar i en vävnad-liknande struktur och höll de liknande gen uttryck profilerna som i vivo4 folliklar, och producerade meiotically behöriga oocyter5,6. 3D kultur system kan också fastställas i en matrix-fri skick, exempelvis hängande släpp fjädring och rullande fartyg. Roterande vägg fartyget (virtuell) utvecklats av National Aeronautics and Space Administration (NASA) genererar en simulerad mikrogravitation (s-µg) för de celler som odlade inuti fartyget7. Detta simulerade mikrogravitation tillstånd ger en unik kultur system för cellproliferation och differentiering avsaknaden av sedimentering för konvektion. Det har visats att simulerade mikrogravitation främjas bildandet av endothelial blodkärl från endotelceller8,9, sköldkörtelvävnad montering från sköldkörtel cellerna10och kondrogenes från adipose-derived mesenkymala stamceller i virtuell enheter11. Andra studier har dock visat att simulerade mikrogravitation inducerad apoptos i magsäckens celler och B lymfoblaster12,13,14, vilket tyder på effekter av simulerade tyngdlöshet på cellulär skada kan vara cell typberoende. Simulerade tyngdlöshet kan också orsaka förändringar på ultrastrukturella nivå, som rapporterats i störda spindeln organisationen och inducerad cytoplasmiska blebbing i oocyter15. Optimerad simulerade mikrogravitation villkor och mekanismer som inducerar tissue engineering eller cellulära skador enligt systemet kräver ytterligare utredning. In vitro experiment av växande cystor folliklar/oocyter använder virtuell enheter kan ge värdefull information om äggcell genuttryck och ultrastructures av äggcell organeller. I denna studie användes äggstocksvävnad innehållande preantral folliklar och isolerade preantral folliklar att undersöka effekterna av simulerade mikrogravitationpå follikeln utveckling och oocyt mognad.
I denna studie användes äggstocksvävnad innehållande preantral folliklar och isolerade preantral folliklar att undersöka effekterna av simulerade tyngdlöshet på follikeln utveckling och oocyt mognad. I vår studie, en virtuell, tillhandahåller en simulerad mikrogravitation enhet, snurrar runt en horisontell axel inuti en 5% CO2 inkubator, en simulerad mikrogravitation skick med effektiv syresättning och mycket låg skjuvspänning. Vi analyserade genuttryck av prolifererande cell nukleära antigen (PCNA) och differentiering tillväxtfaktor 9 (GDF-9) som indikatorer för utvecklingen av granulosa celler och oocyter, respektive. Vi visat att PCNA och GDF-9 uttryck dämpades i granulosa celler och oocyter, respektive när odlade i virtuell enhet, och vi visade ett tillbakadragande av äggcell Mikrovilli från zona pellucida i hårsäckarna odlade under de s-µ g villkorar, som liknade i GDF-9-brist mus folliklar16.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="999">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">ICR mice</td>
			<td style="width:121px;">SLRC Laoratory</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:543px;">14-day-old female mice</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L-15 medium</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">L1518</td>
			<td>With L-glutamine, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">fetal bovine serum</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">10100147</td>
			<td>Origin: Australia</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Penicillin V potassium</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">1504503</td>
			<td>United States Pharmacopeia (USP) Reference Standard (USP)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Streptomycin sesquisulfate hydrate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">46754</td>
			<td>Analytical standard</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Universal&#160;Click&#160;Pen Needles</td>
			<td style="width:121px;">Penfine</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>12&#215;1/2&#34; 0.33&#215;12 mm</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alginate</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">W201502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">alpha-minimal essential medium</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td>M0894</td>
			<td style="width:543px;">Alpha Modification, with L-glutamine, without ribonucleosides, deoxyribonucleosides and sodium bicarbonate, powder, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Insulin-selenium-transferrin</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">51500056</td>
			<td>Liquid, sterile-filtered, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">GONAL-F</td>
			<td style="width:121px;">Merck Serono</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Recombinant follitropin alfa for injection</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Disposable high-aspect-ratio rotating vessel</td>
			<td style="width:121px;">Synthecon</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>10 mL</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Culture oil</td>
			<td style="width:121px;">Vitrolife</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Sterile light paraffin oil</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Alginate Lyase</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A1603</td>
			<td>powder, &#62;10,000 units/g solid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">26 1/2-guage needle</td>
			<td style="width:121px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">35&#215;10mm dish</td>
			<td style="width:121px;">Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Viability/Cytotoxicity assay Kit</td>
			<td style="width:121px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:119px;">L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Bouin&#8217;s solution</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">HT10132</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Horseradish peroxidase (HRP)-conjugated goat anti-rabbit IgG (H+L)</td>
			<td style="width:121px;">Jackson Immuno-Research Laboratories</td>
			<td style="width:119px;">111-035-003</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">3,3N-Diaminobenzidine Tertrahydrochloride</td>
			<td style="width:121px;">Beyotime</td>
			<td style="width:119px;">P0203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Aqueous mounting medium</td>
			<td style="width:121px;">Dako</td>
			<td style="width:119px;">C0563</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Rabbit anti-GDF-9 antibody</td>
			<td style="width:121px;">Beijing Biosynthesis Biotechnology</td>
			<td style="width:119px;">BS-175R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Rabbit anti-PCNA antibody</td>
			<td style="width:121px;">Proteintech</td>
			<td>24036-1-AP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Methylene blue</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M9140</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Transmission electron microscope</td>
			<td style="width:121px;">Hitachi</td>
			<td style="width:119px;">H-7500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro growth of mouse preantral follicles under simulated microgravity

14 dagar gamla mus äggstocksvävnad och preantral folliklar isolerade från samma ålder möss inkuberades i en simulerad mikrogravitation kultur system. Vi kvantitativt bedömde follikeln överlevnad, uppmätta follikeln och äggcell diametrar och undersökte ultrastruktur av oocyterna produceras från systemet. Vi observerat minskad follikeln överlevnad, nedreglering av uttryck av frodas cell nukleär antigen och differentiering tillväxtfaktor 9, som indikatorer för utvecklingen av granulosa celler och oocyter, respektive, och äggcell ultrastrukturella avvikelser under simulerade mikrogravitation förutsättning. Den simulerade mikrogravitation experimentella setup måste optimeras för att ge en modell för utredning av mekanismerna som är involverade i äggcellen/follikeln in vitro- utvecklingen.

Figur 1A visar en virtuell med olja inuti fartyget. En droppe av 150 µL medium som innehåller ett stycke för äggstocksvävnad eller tre alginat pärlor med inkapslade folliklar sattes i oljan. Den medelstora droplet hölls i ett tillstånd av Gränshastighet på grund av vätska dra på droppar inom roterande oljan skattesats på 25 varv per minut, vilket genererade en simulerad mikrogravitation (s-µg) tillstånd. I ett experiment med kontroll äggstocksvävnad eller capsulated folliklar odlades i en droppe av 150 µL medium täckt med mineralolja i 35 × 10 mm rätter (figur 1B), vilket genererade en 1 -g skick.
För att studera effekterna av simulerade tyngdlöshet på preantral follikel utveckling i vitro, vi odlade den 14 dagar gamla mus äggstocksvävnad under 1 -g (kontroll experiment) eller s-µg villkor. Vi räknade antalet friska folliklar i H &#38; E färgade sektioner i två villkor efter 0, 2 och 4 dagar av kultur (figur 2). Vi fann att follikeln överlevnad i äggstocksvävnad behandlas i s-µg skick var betydligt lägre än under 1 -g skick vid dag 2 och dag 4 av odling (p &#60; 0,05, ANOVA). Dessutom fann vi att inga PCNA positiva signaler upptäcktes i äggstocksvävnad på s-µg villkor (figur 3). I kulturen av isolerade preantral folliklar inkapslade i alginat pärlor, avslöjade vi att betydligt fler folliklar överlevt under 1 -g skick (76,8% ± 5,3%, n = 227) än s-µg villkorar (54,4% ± 6,7%, n = 249) på dag 4 av odling . Dessutom hade äggcellen storlek ingen betydande ökning efter 4 dagars odling, dock follikeln storlek ökat kraftigt både gravitationen villkor (figur 4). Dock folliklar med mindre än 10% döda granulosa celler (figur 5) var betydligt lägre under 1 -g skick (81,5 ± 5%, n = 10) än s-µg villkor (90 ± 8%, n = 10) (p &#60; 0,05).
För att undersöka effekterna av simulerade tyngdlöshet på äggcellen funktionalitet, undersökte vi uttrycket av äggcell-specifik markör GDF-9. Vi visade att GDF-9 uttryck var anmärkningsvärt down-reglerade i äggstocksvävnad s-µg villkor (figur 6). Dessutom visade vi frekvent ultrastrukturella avvikelser i äggcellen organeller i inkapslade hårsäckarna på dag 4 av kultur på s-µg villkor (figur 7).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig1.jpg"> 
Figur 1 : Inställning av s -µg och 1-g kultur villkor. (A) s-µg skapades av roterande vägg fartyg och att hålla den kultur ämnen i ett tillstånd av konstant fritt fall inom den rörliga oljan. (B) A 1 -g skick skapades av odlingsskålar äggstocksvävnad eller folliklar på ytan av en petriskål täckt med mineralolja. Pilen anger en droppe av medium. Skalstapeln = 1 cm. Denna siffra har ändrats från Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig1large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig2.jpg"> 
Figur 2 : Effekter av s-µg på äggstockscancer vävnad kulturen. (A) sektioner för äggstocksvävnad odlade under 1 -g eller s-µg villkor för 0, 2 och 4 dagar. Skalstapeln = 50 µm. (B) follikeln densitet i avsnitten för äggstocksvävnad. Fel bar representerar 1 SEM, *: p &#60; 0,05. Denna siffra har ändrats från Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig2large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig3.jpg"> 
Figur 3 : Immunohistokemi av PCNA. PCNA proteinuttryck undersöktes i granulosa celler i äggstocksvävnad odlade under 1 -g eller s-µg villkor för 0, 2 och 4 dagar. Skalstapeln = 50 µm. Denna siffra har ändrats från Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig3large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig4.jpg"> 
Figur 4 : Effekter av s-µg på kulturen av inkapslade preantral folliklar i alginat pärlor. (A) morfologi av preantral folliklar odlade under 1 -g eller s-µg villkor för 0 dagar och 4 dagar. Skalstapeln = 50 µm. (B) äggcellen diameter och (C) follikeln diameter jämfördes mellan 1 g och s-µg villkor. Fel bar representerar 1 SEM, *: p &#60; 0,05. Denna siffra har ändrats från Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig4large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig5.jpg"> 
Figur 5 : Cell livskraft assay. Representativa bilder togs under ett Mikroskop på 400 X förstoring. Assay användningar Calcein AM att visualisera levande celler färgade i grönt och EthD-1 att visualisera atomkärnor av döda celler målat i rött. (A): en follikel med ~ 100% levande granulosa celler (grön). (B): en follikel med levande granulosa celler (grön), as well as mer än 10% döda celler (röd). Skalstapeln = 50 µm.Denna siffra har ändrats från Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig5large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig6.jpg"> 
Figur 6 : Immunohistokemi GDF-9. GDF-9 proteinuttryck undersöktes i oocyterna i äggstocksvävnad odlade under 1 -g eller s-µg villkor för 0, 2 och 4 dagar. Skalstapeln = 50 µm. Denna siffra har ändrats från Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig6large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55641/55641fig7.jpg"> 
Figur 7 : Ultrastrukturella analys av isolerade preantral folliklar odlade under 1 - g eller s-µ g villkor på dag 4 av kultur. (A) en äggcell med Mikrovilli (pilar) utvidga till zona pellucida (1 -g skick). (B-F) Oocyter med stora vakuoler (*), multilamellar organ (#), lipid droppar (pilar), vakuoliserade mitokondrier saknas cristae (pil) och dispergering Golgiapparaten (pil), respektive (s-µg tillstånd). O: äggcellen; ZP: zona pellucida. Denna siffra har ändrats från Zhang et al. 17 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55641/55641fig7large.jpg" target="_blank">vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity at JoVE.com

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

En mycket lovande teknik för att generera vävnad konstruktioner utan använder matrix är att odla celler i en simulerad mikrogravitation skick. Använder ett roterande kultur granskat vi äggblåsa tillväxt och oocytmognaden i form av follikeln överlevnad, morfologi, tillväxt och äggcell funktion under simulerade mikrogravitation förutsättning.

In Vitro Tillväxt av mus Preantral folliklar Under simulerade tyngdlöshet

14 day-old mouse ovarian tissue and preantral follicles isolated from same-aged mice were incubated in a simulated microgravity culture system. We ...

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vitro Growth of Mouse Preantral Follicles Under Simulated Microgravity

Culture and Co-Culture of Mouse Ovaries and Ovarian Follicles

Kultur och Co-kultur av Mouse Äggstockar och folliklar

The mammalian ovary is composed of ovarian follicles, each follicle consisting of a single oocyte surrounded by somatic granulosa cells, enclosed together ...

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Characterization of Thymic Settling Progenitors in the Mouse Embryo Using In Vivo and In Vitro Assays

Karakterisering av Thymic Settling stamfäder i Mouse Embryo Använda<em&gt; In Vivo</em&gt; Och<em&gt; In Vitro</em&gt; Analyser

Characterizing thymic settling progenitors is important to understand the pre-thymic stages of T cell development, essential to devise strategies for T ...

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generation of Aggregates of Mouse Embryonic Stem Cells that Show Symmetry Breaking, Polarization and Emergent Collective Behaviour In Vitro

Generation av aggregat av Mouse embryonala stamceller som Visa Symmetry Breaking, Polarisering och Emergent Collective Behaviour<em&gt; In Vitro</em

We have developed a protocol improving current Embryoid Body (EB) culture which allows the study of self-organization, symmetry breaking, axial elongation ...

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization

Isolering av Mouse Endometrial epitelceller och stromaceller celler för<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualisering

Decidualization is a progesterone-dependent differentiation process of endometrial stromal cells and is a prerequisite for successful embryo implantation. ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

En ny användning av tredimensionella högfrekvent ultraljud för tidig graviditet karakterisering i musen

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Generation av byggnadsställning-fri, tredimensionella Insulin att uttrycka Pancreatoids från mus bukspottskörteln föräldraparets In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

Visualizing the Node and Notochordal Plate In Gastrulating Mouse Embryos Using Scanning Electron Microscopy and Whole Mount Immunofluorescence

Visualisera den noden och Notochordal plattan i Gastrulating musembryon som använder Scanning Electron Microscopy och hela Mount immunofluorescens

The post-implantation mouse embryo undergoes major shape changes after the initiation of gastrulation and morphogenesis. A hallmark of morphogenesis is ...

Induction of Endothelial Differentiation in Cardiac Progenitor Cells Under Low Serum Conditions

Induktion av Endothelial differentiering i hjärt stamceller låga Serum villkor

Cardiac progenitor cells (CPCs) may have therapeutic potential for cardiac regeneration after injury. In the adult mammalian heart, intrinsic CPCs are ...

Determining Bile Duct Density in the Mouse Liver

Bestämning av gallgången densitet i mus levern

Mouse is broadly used as a model organism to study biliary diseases. To evaluate the development and function of the biliary system, various techniques ...