Name: cardiac muscle cell-based actuator and self-stabilizing biorobot - part 2
Uploaded: 2017-05-09T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2 at JoVE.com

MT Holley é apoiado pelo programa Graduate Fellows da Louisiana Board of Regents, e C. Danielson é apoiado pelo Programa de Professores do Instituto Médico Howard Hughes. Este estudo é apoiado pelo NSF Grant No: 1530884.

Todos os procedimentos aqui descritos foram realizados utilizando um protocolo aprovado e de acordo com os regulamentos do Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais da Universidade de Notre Dame. 1. Semente e Cultura de Células <ol><li> Antes de iniciar, prepare os itens necessários: um pequeno funil, pipetas e meio de Eagle modificado Dulbecco morno (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS) e 1% de antibiótico penicilina (DMEM completo). </li><li> Tome frascos T-2...

<ol>
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C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Review+of+fish+swimming+modes+for+aquatic+locomotion.">Review of fish swimming modes for aquatic locomotion.</a> IEEE J. Ocean. Eng. 24, 237-252 (1999).</li></ol>

O procedimento descrito aqui descreve um método de sementeira bem sucedido para actuadores e biorobots baseados em PDMS, o que facilita a ligação de cardiomiócitos. Além disso, foi descrito o processo de aquisição de imagem e a subsequente análise que caracteriza o comportamento das células eo desempenho dos dispositivos. Observamos a contração espontânea de células nos braços cantilever após 24 h; A intensidade das contrações continuou a aumentar de forma constante ao longo...

Biorobots são dispositivos baseados em células vivas que são incorporados dentro de um backbone mecânico que é geralmente composto de materiais macios, elásticos, como PDMS ou hidrogéis 1 . As células sofrem contrações rítmicas, espontaneamente ou em resposta a estímulos, e assim funcionam como um atuador. A energia gerada a partir da célula de contração drives vários biorobots. As células do coração de mamíferos (cardiomiócitos) e as células do músculo esquelético são frequentemente utilizadas para a actuação biorobot devido às suas propriedades contrácteis. Além de cardiomiócitos e células musculares esqueléticas, foram utilizados outros tipos de células, tais como tecidos musculares de insectos 2 e tecidos musculares explantados 3 . Os tecidos musculares de insetos permitem a operação de atuadores biológicos à temperatura ambiente. A função eo desempenho de um biorobot são determinados principalmente pela força e consistência do atuador biológico ( ie. Células musculares), enquanto que a estrutura principal mecânica determina os mecanismos de locomoção, estabilidade e potência. Uma vez que estes dispositivos são exclusivamente movidos por forças geradas por células, não existem poluentes químicos ou ruídos operacionais. Portanto, eles formam uma alternativa de energia eficiente para outros robôs convencionais. Várias fontes da literatura discutiram os diferentes métodos para integrar células vivas e tecidos em biorobots 1 , 4 , 5 . Os avanços na microfabricação e técnicas de engenharia de tecidos permitiram o desenvolvimento de biorobôs que podem andar, segurar, nadar ou bombear 5 , 6 . Em geral, as células são cultivadas directamente sobre o esqueleto mecânico (polimérico) como uma folha de células confluentes ou são moldadas em estruturas de actuação tridimensionais dentro de andaimes tais como anéis e tiras. Na maioria das vezes, biorobots sãoFabricadas utilizando folhas de cardiomiócitos 6 , 7 , uma vez que estas células têm uma capacidade inata para exibir uma contracção espontânea sem estímulos externos. Por outro lado, os relatos sobre as folhas de células do músculo esquelético são limitados devido à sua necessidade de estímulos para iniciar as contrações in vitro , a fim de iniciar a despolarização da membrana 8 . Este protocolo descreve, em primeiro lugar, como semear cardiomiócitos num actuador biológico funcionalizado feito de um cantilever PDMS fino. Em seguida, descreve em detalhes a semeadura e análise dos perfis de natação. O cantilever é funcionalizado com uma proteína adesiva celular tal como a fibronectina e é semeado confluentemente com cardiomiócitos. À medida que as células semeadas no dispositivo se contraem, elas fazem com que o cantilever se dobre e assim actue como um actuador. Ao longo do tempo, à medida que as células se amadurecem, rastreamos as mudanças no estresse superficial no dispositivo, analisando vídeosDobra em cantilever. O actuador biológico desenvolvido aqui pode ser utilizado para determinar as propriedades contrácteis de qualquer tipo de célula, tal como os fibroblastos ou células de caules pluripotentes induzidas, à medida que sofrem diferenciação. Grande parte da pesquisa anterior sobre biorobôs foi focada no desenvolvimento de atuadores biológicos, enquanto a otimização da arquitetura biorobot e capacidades funcionais foram largamente negligenciadas. Recentemente, alguns estudos têm demonstrado a implementação de modos de natação em biorobôs que são inspirados pela natureza. Por exemplo, os biorobots de natação com movimento baseado em flagelos 6 , propulsão de água-viva 9 e raios bio-híbridos 4 foram projetados. Ao contrário de outros trabalhos na literatura, aqui nos concentramos em variar as propriedades da espinha dorsal mecânica para criar uma estrutura de auto-estabilização. O biorobot desenvolvido neste estudo é capaz de manter um passo constante, roll, e imMersion como ele nada. Estes parâmetros podem ser modificados variando a espessura de cada composto de base. Os passos de fabricação envolvidos no desenvolvimento do atuador PDMS, o biorobot submergível e a funcionalização do dispositivo são descritos detalhadamente na Parte 1 deste artigo em duas partes, bem como em nosso recente trabalho 7. A técnica desenvolvida aqui pode pavimentar o Para o desenvolvimento de novos, altamente eficientes biorobots para várias aplicações, tais como entrega de carga. O processo de isolamento seguido neste estudo é semelhante ao processo descrito em um trabalho anterior 10 , bem como em trabalhos recentemente publicados 7 . Os métodos de microfabricação utilizados para fabricar os actuadores PDMS e os dispositivos biorobot são descritos em pormenor na Parte 1 deste manuscrito de duas partes. A seção de protocolo deste manuscrito descreve os passos envolvidos na semeadura de cardiomiócitos no PDMS fabricado aE o biorobot após a sua funcionalização com proteínas adesivas celulares.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Chemicals and reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cardiomyocytes (primary cardiac cells)</td>
			<td>Charles River</td>
			<td>NA</td>
			<td>Isolated from 2-day old neonatal Sprague Dawley rats</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s modified eagle&#8217;s media (DMEM)</td>
			<td>Hyclone Laboratories</td>
			<td>16750-074</td>
			<td>with 4500 mg/L glucose, 4.0 mM L-glutamine, and 110 mg/L sodium pyruvate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetalclone III serum</td>
			<td>Hyclone industries, GE</td>
			<td>16777-240</td>
			<td>Fetal bovin serum (FBS)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#8217;s phosphate buffer (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D1408-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin-G sodium salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat serum</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G9023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4,6-diamidino-2-phenylindole dihydrocholride powder (DAPI)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fibronectin from bovine plasma</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>F1141</td>
			<td>Solution (1 mg/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcein-AM and ethidium homodimer-1 kit (Live/Dead Assay)</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>L3224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium Fluo-4, AM</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>F14217</td>
			<td>calcium indicator dye</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tyrodes salt solution</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T2397</td>
			<td>buffer solution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pluronic F-127</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P3000MP</td>
			<td>nonionic surfactant-20 % solution in Dimethylsiloxane (DMSO)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% Parafomaldehyde</td>
			<td>Electron microscopy</td>
			<td>15710</td>
			<td>Caution: Irritant and combustible</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton x-100</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>X-100 100 mL</td>
			<td>cell lyses detergent, (4-(1,1,3,3-Tetramethylbutyl)phenyl-polyethylene glycol, t-Octylphenoxypolyethoxyethanol, Polyethylene glycol tert-octylphenyl ether)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProLong gold antifade reagent</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>P10144</td>
			<td>Mounting agent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alexa Fluor 594 Phalloidin</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A12381</td>
			<td>Actin filament marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 conjugate</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pha</td>
			<td>Molecular Probes</td>
			<td>A-11001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-connexin 43 antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab11370</td>
			<td>Gap junction marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-cardiac troponin I antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab10231</td>
			<td>Contractile protein</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>16% EM grade paraformaldehyde solution</td>
			<td>Electron microscopy</td>
			<td>100503-916</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polydimethylsiloxane (PDMS)</td>
			<td>Elsevier</td>
			<td></td>
			<td>Sylgard 184</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Materials and Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Camera</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>DCC1545M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LED light strip</td>
			<td>NA</td>
			<td>NA</td>
			<td>Any white LED without spectrum emission</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Confocal microscope</td>
			<td>Nikkon C2</td>
			<td>NA</td>
			<td>Confocal microscope with three filter set.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zooming lens</td>
			<td>Infinity</td>
			<td>Model# 252120</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Matlab</td>
			<td>Mathworks</td>
			<td>NA</td>
			<td>Used in Section 4) for biological actuator analysis.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image J</td>
			<td>National Institute of Health</td>
			<td>NA</td>
			<td>Java-based image processing software. Used in Section 5) for biorobot analysis. 
			Free Image Processing and Analysis software in java. (https://imagej.nih.gov/ij/)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thor Cam</td>
			<td>Thor Labs</td>
			<td>NA</td>
			<td>Camera operating software</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

cardiac muscle cell-based actuator and self-stabilizing biorobot - part 2

Nos últimos anos, foram desenvolvidos dispositivos híbridos que consistem numa célula viva ou componente de tecido integrado com uma espinha dorsal mecânica sintética. Estes dispositivos, chamados biorobots, são alimentados apenas pela força gerada a partir da atividade contrátil do componente vivo e, devido às suas muitas vantagens inerentes, poderia ser uma alternativa aos robôs convencionais totalmente artificiais. Aqui, descrevemos os métodos para semear e caracterizar um atuador biológico e um biorobot que foi projetado, fabricado e funcionalizado na primeira parte deste artigo em duas partes. O actuador biológico fabricado e os dispositivos biorobot compostos por uma base de polidimetilsiloxano (PDMS) e um cantilever de película fina foram funcionalizados para ligação de células com fibronectina. Após a funcionalização, os cardiomiócitos de ratos neonatais foram semeados no braço cantilever PDMS a uma densidade elevada, resultando numa folha de células confluentes. Os dispositivos foram visualizados todos os dias eo movimento do cantiBraços de alavanca foi analisada. No segundo dia após a semeadura, observamos a flexão dos braços em consola devido às forças exercidas pelas células durante as contrações espontâneas. Após análise quantitativa da dobra em cantilever, observou-se um aumento gradual no stress superficial exercido pelas células à medida que amadureciam ao longo do tempo. Da mesma forma, observamos o movimento do biorobot devido à atuação do braço cantilever PDMS, que atuou como uma aleta. Após a quantificação dos perfis de natação dos dispositivos, foram observados vários modos de propulsão, que foram influenciados pelo ângulo de repouso da barbatana. A direção do movimento e a freqüência de batimento também foram determinadas pelo ângulo de repouso da barbatana, e observou-se uma velocidade máxima de natação de 142 μm / s. Neste artigo, descrevemos o procedimento para preencher os dispositivos fabricados com cardiomiócitos, bem como para a avaliação do atuador biológico e atividade biorobot.

O atuador biológico feito de um cantilever PDMS fino (25 μm de espessura) e cardiomiócitos constitui o núcleo do biorobot de natação, conforme mostrado na esquemática e captura de tela dos dispositivos na Figura 1 . As células começam a apresentar contracções após 24 h em cultura e a flexão dos braços em consola foi observada até ao dia 2. O perfil lateral do dispositivo foi registado todos os dias e o stress superficial foi quantificado a partir da dobra ...

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Cardiac Muscle Cell-based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - Part 2

Neste estudo, um atuador biológico e um biorobot de natação auto-estabilizante com braços elastoméricos em cantilever funcionalizados são semeados com cardiomiócitos, cultivados e caracterizados por suas propriedades bioquímicas e biomecânicas ao longo do tempo.

Atuador baseado em células musculares cardíacas e auto-estabilizante Biorobot - Parte 2

In recent years, hybrid devices that consist of a living cell or tissue component integrated with a synthetic mechanical backbone have been developed. ...

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JoVE Journal

Bioengineering

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Cardiac Muscle-cell Based Actuator and Self-stabilizing Biorobot - PART 1

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