Name: a graphical user interface for software-assisted tracking of protein concentration in dynamic cellular protrusions
Uploaded: 2017-07-11T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions at JoVE.com

Författarna erkänner finansiering från DFG (EXC-1003 till MG).

1. Cellkultur <ol><li> Culture HeLa eller COS-celler i Dulbecco&#39;s Modified Eagle Medium (DMEM) innehållande 4,5 g / 1 D-glukos, L-alanin-L-glutamindipeptid, pyruvat, 10% fetalt bovint serum och 10 enheter / ml penicillin / streptomycin. Kulturneuroner i odlingsmedium utan L-glutamin, glutaminsyra eller asparaginsyra, kompletterad med 0,5 mM L-alanin-L-glutamindipeptid, serumfria neuronstillägg och 10 enheter / ml penicillin / streptomycin. </li><li> När väl 40% konfluens har uppnåtts transfekterar celler med ...

<ol>
	<li>Dunaevsky, A., Tashiro, A., Majewska, A., Mason, C., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+regulation+of+spine+motility+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Developmental regulation of spine motility in the mammalian central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (23), 13438-13443 (1999).</li><li>Matus, A., Brinkhaus, H., Wagner, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Actin+dynamics+in+dendritic+spines:+a+form+of+regulated+plasticity+at+excitatory+synapses.">Actin dynamics in dendritic spines: a form of regulated plasticity at excitatory synapses.</a> Hippocampus. 10 (5), 555-560 (2000).</li><li>Galic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+recruitment+of+the+curvature-sensitive+protein+ArhGAP44+to+nanoscale+membrane+deformations+limits+exploratory+filopodia+initiation+in+neurons.">Dynamic recruitment of the curvature-sensitive protein ArhGAP44 to nanoscale membrane deformations limits exploratory filopodia initiation in neurons.</a> Elife. 3, e03116 (2014).</li><li>Hotulainen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+mechanisms+of+actin+polymerization+and+depolymerization+during+dendritic+spine+morphogenesis.">Defining mechanisms of actin polymerization and depolymerization during dendritic spine morphogenesis.</a> J Cell Biol. 185 (2), 323-339 (2009).</li><li>Leijnse, N., Oddershede, L. B., Bendix, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Helical+buckling+of+actin+inside+filopodia+generates+traction.">Helical buckling of actin inside filopodia generates traction.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (1), 136-141 (2015).</li><li>Tsygankov, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CellGeo:+a+computational+platform+for+the+analysis+of+shape+changes+in+cells+with+complex+geometries.">CellGeo: a computational platform for the analysis of shape changes in cells with complex geometries.</a> J Cell Biol. 204 (3), 443-460 (2014).</li><li>Xiong, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+characterization+of+cell+shape+changes+during+amoeboid+motility+by+skeletonization.">Automated characterization of cell shape changes during amoeboid motility by skeletonization.</a> BMC Syst Biol. 4, 33 (2010).</li><li>Styner, M., Gerig, G., Lieberman, J., Jones, D., Weinberger, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Statistical+shape+analysis+of+neuroanatomical+structures+based+on+medial+models.">Statistical shape analysis of neuroanatomical structures based on medial models.</a> Med Image Anal. 7 (3), 207-220 (2003).</li><li>Blum, H., Wathen-Dunn, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+transformation+for+extracting+new+descriptors+of+shape.">A transformation for extracting new descriptors of shape.</a> Models for the Perception of Speech and Visual Form: Proceedings of a Symposium. , 362-380 (1967).</li><li>Barry, D. J., Durkin, C. H., Abella, J. V., Way, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Open+source+software+for+quantification+of+cell+migration,+protrusions,+and+fluorescence+intensities.">Open source software for quantification of cell migration, protrusions, and fluorescence intensities.</a> J Cell Biol. 209 (1), 163-180 (2015).</li><li>Machacek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordination+of+Rho+GTPase+activities+during+cell+protrusion.">Coordination of Rho GTPase activities during cell protrusion.</a> Nature. 461 (7260), 99-103 (2009).</li><li>Saha, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+analysis+of+filopodial+length+and+spatially+resolved+protein+concentration+via+adaptive+shape+tracking.">Automated analysis of filopodial length and spatially resolved protein concentration via adaptive shape tracking.</a> Mol Biol Cell. 27 (22), 3616-3626 (2016).</li><li>Argiro, V., Bunge, M. B., Johnson, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+quantitative+study+of+growth+cone+filopodial+extension.">A quantitative study of growth cone filopodial extension.</a> J Neurosci Res. 13 (1-2), 149-162 (1985).</li><li>Mogilner, A., Rubinstein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+physics+of+filopodial+protrusion.">The physics of filopodial protrusion.</a> Biophys J. 89 (2), 782-795 (2005).</li><li>Shaner, N. C., Steinbach, P. A., Tsien, R. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+choosing+fluorescent+proteins.">A guide to choosing fluorescent proteins.</a> Nat Methods. 2 (12), 905-909 (2005).</li><li>Abramoff, M. D., Magalhaes, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Processing+with+ImageJ.">Image Processing with ImageJ.</a> Biophotonics International. 11, 36-42 (2004).</li><li>Courtney, J., Woods, E., Scholz, D., Hall, W. W., Gautier, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MATtrack:+A+MATLAB-Based+Quantitative+Image+Analysis+Platform+for+Investigating+Real-Time+Photo-Converted+Fluorescent+Signals+in+Live+Cells.">MATtrack: A MATLAB-Based Quantitative Image Analysis Platform for Investigating Real-Time Photo-Converted Fluorescent Signals in Live Cells.</a> PLoS One. 10 (10), e0140209 (2015).</li><li>Schell, M. J., Erneux, C., Irvine, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inositol+1,4,5-trisphosphate+3-kinase+A+associates+with+F-actin+and+dendritic+spines+via+its+N+terminus.">Inositol 1,4,5-trisphosphate 3-kinase A associates with F-actin and dendritic spines via its N terminus.</a> J Biol Chem. 276 (40), 37537-37546 (2001).</li><li>Korobova, F., Svitkina, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+architecture+of+synaptic+actin+cytoskeleton+in+hippocampal+neurons+reveals+a+mechanism+of+dendritic+spine+morphogenesis.">Molecular architecture of synaptic actin cytoskeleton in hippocampal neurons reveals a mechanism of dendritic spine morphogenesis.</a> Mol Biol Cell. 21 (1), 165-176 (2010).</li><li>Cheadle, L., Biederer, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+synaptogenic+protein+Farp1+links+postsynaptic+cytoskeletal+dynamics+and+transsynaptic+organization.">The novel synaptogenic protein Farp1 links postsynaptic cytoskeletal dynamics and transsynaptic organization.</a> J Cell Biol. 199 (6), 985-1001 (2012).</li><li>Tarnok, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+tool+for+the+quantitative+analysis+of+dendritic+filopodial+motility.">A new tool for the quantitative analysis of dendritic filopodial motility.</a> Cytometry A. 87 (1), 89-96 (2015).</li><li>Hendricusdottir, R., Bergmann, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=F-dynamics:+automated+quantification+of+dendrite+filopodia+dynamics+in+living+neurons.">F-dynamics: automated quantification of dendrite filopodia dynamics in living neurons.</a> J Neurosci Methods. 236, 148-156 (2014).</li><li>Fanti, Z., Martinez-Perez, M. E., De-Miguel, F. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NeuronGrowth,+a+software+for+automatic+quantification+of+neurite+and+filopodial+dynamics+from+time-lapse+sequences+of+digital+images.">NeuronGrowth, a software for automatic quantification of neurite and filopodial dynamics from time-lapse sequences of digital images.</a> Dev Neurobiol. 71 (10), 870-881 (2011).</li><li>Costantino, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semi-automated+quantification+of+filopodial+dynamics.">Semi-automated quantification of filopodial dynamics.</a> J Neurosci Methods. 171 (1), 165-173 (2008).</li><li>Nilufar, S., Morrow, A. A., Lee, J. M., Perkins, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=FiloDetect:+automatic+detection+of+filopodia+from+fluorescence+microscopy+images.">FiloDetect: automatic detection of filopodia from fluorescence microscopy images.</a> BMC Syst Biol. 7, 66 (2013).</li></ol>

Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för spårning av filopodial tillväxtdynamik och analys av relativa proteinkoncentrationer i dessa dynamiska strukturer via den konvexa skrovalgoritmen. Med hjälp av programvaran kan upp till tre kanaler jämföras parvis i en enda körning, varigenom de relativa koncentrationerna av två kanaler ( dvs. proteiner) bestämmes genom förlängnings- / återdrivningscykeln och lagras som bild- och datafiler i separata mappar. Utöver de rutinmässiga operationerna till...

Spatio-temporal kontroll av aktin-regulatoriska proteiner är associerad med filopodiumdynamik 1 , 2 . Spårning av rumsligt upplöst proteinkoncentration längs hela filopodiallängden genom tiden är således avgörande för att fördjupa vår förståelse för de mekanismer som ligger till grund för initiering, förlängning, stabilisering eller kollaps av dessa dynamiska strukturer 3 , 4 . Till skillnad från proteinanalys i cytosolen, där många cellformiga förändringar uppträder i större skala, är filopodier dynamiska mikrostrukturer som ständigt spänner 5 och böjer sig, vilket förhindrar analys med ett enkelt tillvägagångssätt, såsom en linjeskanning. Olika mjukvarulösningar för spårning av filopodial form finns tillgängliga 6 , 7 , 8 , 9 . LikewIse, mjukvara för ratiometrisk spårning av proteindynamik i cellkroppen har utvecklats 10 , 11 . För att kombinera automatiserad spårning av filopodial form och spatio-temporal proteinanalys, utvecklade vi nyligen en bildanalysprogramvara baserad på konvexskrovalgoritmen 12 . Denna nya analysmetod, som drivs via ett grafiskt användargränssnitt (GUI), kombinerar för första gången relativ proteinkoncentration längs filopodiallängden och tillväxthastigheten, vilket möjliggör en noggrann mätning av spatio-temporal proteinfördelning oberoende av rörelse av dessa Dynamiska strukturer 12 . Tanken bakom mjukvaran (källkoden är ledig, se nedan) är att en av spetsarna på det konvexa skrovet sammanfaller med filopodiumets spets ( figur 1A ). Genom att titta i efterföljande ram foR närmaste vertexen i det konvexa skrovet, kan den rörliga spetsen spåras genom hela filmen. När spetsen är detekterad i varje ram används dess position för att rita en axel genom att ansluta till spetsen med en referenspunkt vid basopodiumets botten ( Figur 1B ). Slutligen används med hjälp av ekvivalenta nodpunkter, vars positioner bestäms av medianpixeln med maximal intensitet längs linjen ortogonalt till axeln, för att bestämma en ryggrad som följer filopodialformen. Utnyttjande av denna adaptiva ryggrad genereras en kymografi för att spåra filopodial tillväxt och proteinkoncentrationer för upp till tre kanaler längs filopodiallängden ( Figur 1C ). <img alt="Figur 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig1.jpg" /> Figur 1: Princip för bildanalysprogrammet. ( A ) Algoritmen bakomMjukvaran. I steg 1 anger användaren referensen (basen) och toppunktet (spetsen) av filopodium. I steg 2-1 erhålls filopodiums ryggrad med hjälp av medianpixeln med maximalt intensitetsvärde. I steg 3 används ryggraden för spatial proteinintensitetsprofil. I steg 2-2 spårar programvaran automatiskt spetsen i den efterföljande ramen. Hela proceduren itererar. ( B ) Snapshot av algoritmen med äkta filopodium som introducerar viktiga element som det konvexa skrovet som används för spårning. ( C ) Översikt över parametrar som kan mätas med algoritmen. Denna siffra har ändrats från referens 12 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig1large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> Bildanalysprogrammet drivs i Matlab (kallad programmeringsprogram) via en grafisk användningR-gränssnittet. För att maximera flexibilitet och robusthet för den specifika experimentella inställningen kan användaren justera en rad spårningsparametrar ( t.ex. tillåten böjvinkel och rörelse mellan bilder) och göra några korrigeringar till filmerna ( t.ex. beskärning, rotation, borttagning av oönskade objekt) ( Figur 2A och Tabell 1) . <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> GUI </td><td> Nej. </td><td> Obligatorisk </td><td colspan="5"> Beskrivning </td><td> Namn (i GUI) </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Laddar staplad .tiff-fil som representerar cellkroppen (med rutan incheckad) eller skapa överlagrad cellkropp från kanaler </td><td> Cellkropp </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1b </td><td> Y </td><td colspan=&quot;5&quot;&gt; Laddar staplad bildfil som motsvarar protein 1 </td><td> Protein 1 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Laddar staplad bildfil som motsvarar protein 2 </td><td> Protein 2 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1d </td><td> Y </td><td colspan="5"> Laddar staplad bildfil som motsvarar protein 3 </td><td> Protein 3 </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 1e </td><td> N </td><td colspan="5"> Återställer allt till förinstallerade staplade bildfiler </td><td> Återställa </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Rullningsfältet för att bestämma den inledande ramen för analys i GUI-fönstret # 2 </td><td> NA </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Rullningsfältet för att bestämma den slutliga ramen för analys i GUI-fönstret # 2 </td><td> NA </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Rullningsfältet representerar curreNt-ram </td><td> NA </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2d </td><td> N </td><td colspan="5"> Det grå värdet av pixlarna nedan, där alla pixlar kommer att ställas in på noll </td><td> NA </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2e </td><td> N </td><td colspan="5"> Det grå värdet på pixlarna ovanför vilka alla pixlar kommer att ställas in till maximala värden </td><td> NA </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2f </td><td> N </td><td colspan="5"> Ställ in intensitetsvärdena för pixlarna som anges av &lt;2e&gt; &amp; &lt;2f&gt; </td><td> Uppsättning </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2g </td><td> N </td><td colspan="5"> Spela den intensitetsjusterade filmen </td><td> Spela </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2h </td><td> N </td><td colspan="5"> Beskära bild </td><td> Beskära </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2i </td><td> N </td><td colspan="5"> Rotera bild </td><td> Rotera </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 2j </td><td> N </td><td colspan="5">Ta bort regioner i hela stapeln </td><td> Ta bort regioner </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 3a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Klicka för att öppna &quot;Analysfönstret&quot; (GUI-fönstret # 2) </td><td> Spårningsfönster </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 3b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Ange storleken på en pixel i mikroner </td><td> Ange pixelstorlek </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 4 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Klicka för att generera gränsen / kantbilden på den överlagda cellkroppen </td><td> Boundary </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 5 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Klicka för att välja basopodiets bas och spets </td><td> Referernce </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6a </td><td> Y </td><td colspan="5"> Ange antal segment eller noder </td><td> Antal segment </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6b </td><td> Y </td><td colspan="5"> Ange skanlängden (vinkelrätt mot axeln) </td><td> Skanbredd </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6c </td><td> Y </td><td colspan="5"> Ange längden ovanför vilken filopodi börjar böja </td><td> Exakt Meas efter </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6d </td><td> Y </td><td colspan="5"> Ange radie av spetsdetekteringscirkeln (dvs område där vertexen kan lokaliseras i nästa ram) </td><td> Radius av spetsdetektering </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6e </td><td> Y </td><td colspan="5"> Ange maximal vinkel som filopodium kan böja från vertikalaxeln </td><td> Vinkelgräns </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6f </td><td> N </td><td colspan="5"> Lägg till referenspunkter för bas och tips för den specifika ramen </td><td> Välj referens </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6g </td><td> N </td><td colspan="5"> Ange längden ovanför vilken filopodi börjar böja för den specifika ramen </td><td> Exakt Meas efter </td></tr><tr><td> # 2 </td> &lt;td&gt; 6h </td><td> N </td><td colspan="5"> Ange radie av detekteringscirkeln för den specifika ramen </td><td> Radius av spetsdetektering </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6i </td><td> N </td><td colspan="5"> När du har angett alla parametrar för den specifika ramen klickar du för att lagra värdena till minne och fil för vidare referens </td><td> Lägg till </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6j </td><td> N </td><td colspan="5"> Klicka för att radera de manuella parametrarna för den ramen </td><td> Radera </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6k </td><td> N </td><td colspan="5"> Klicka för att radera alla parametrar som lagrats manuellt med hjälp av panelen &quot;tillvalsfunktioner&quot; för alla ramar </td><td> Återställa </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 6l </td><td> N </td><td colspan="5"> Incheckning före spårning för att lagra alla spårningsresultat i minnet för framtida referens </td><td> Historia spår </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 7 </td><td> Y </td><td colspan="5"> Klicka för att starta spårning </td><td> Spåra och analysera </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8a </td><td> N </td><td colspan="5"> Klicka för att börja spåra proteinkanalintensiteten </td><td> Analysera proteinintensiteterna </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8b </td><td> N </td><td colspan="5"> Checka in för att spåra proteinkanalintensiteten längs filopodiallängden </td><td> Hela filopodi </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8c </td><td> N </td><td colspan="5"> Checka in för att spåra referensproteinet eller proteinet A </td><td> proteína </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8d </td><td> N </td><td colspan="5"> Checka in för att spåra proteinet B </td><td> ProteinB </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8e </td><td> N </td><td colspan="5"> Checka in för att spåra proteinet C </td><td> ProteinC </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8f </td><td> N </td><td colspan="5"> Checka in för att spåra genomsnittlig proteinintensitet i thE tips </td><td> Ledande tips </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8g </td><td> N </td><td colspan="5"> Ange längden på spetsen </td><td> Tips längd </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8h </td><td> N </td><td colspan="5"> Ange det minsta avståndet från basen ovanför vilken spetsen börjar bilda </td><td> tröskel </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 8i </td><td> N </td><td colspan="5"> Klicka för att spara de ledande tipsanalysresultaten till filen </td><td> Tryckknapp </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9a </td><td> N </td><td colspan="5"> Klicka för att initiera ratiometrisk proteinanalys </td><td> Jämföra </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9b </td><td> N </td><td colspan="5"> Checka in för att jämföra protein B med avseende på A </td><td> log10 (B / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9c </td><td> N </td><td colspan="5"> Checka in för att jämföra protein C med avseende på A </td><td> log10 (C / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td> &lt;td&gt; 9d </td><td> N </td><td colspan="5"> Checka in för att jämföra protein B med avseende på A vid toppen </td><td> log10 (B / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 9e </td><td> N </td><td colspan="5"> Checka in för att jämföra protein C med avseende på A vid toppen </td><td> log10 (C / A) </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10a </td><td> N </td><td colspan="5"> Välj annan färgkarta (standard: Jetplot) </td><td> Färgkarta </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10b </td><td> N </td><td colspan="5"> Redigera colormap </td><td> Redigera colormap </td></tr></tbody></table> Tabell 1: Översikt över alla funktioner som finns i GUI Windows # 1 och # 2. När detta har uppnåtts skapar programmet ett konvext skrov och spårar automatiskt spetsen i hela filmen. Parametrar som extraheras från filmen, såsom en ratiometrisk kymografi, tillväxthastighet och filopodial längd aVisas igen och lagras även i arbetsmappen som bilder och som datafiler. Andra parametrar såsom filopodial livstid, tillväxthastighet och retraktionshastighet kan sedan extraheras och analyseras vidare från de lagrade datafilerna ( Figur 2B ). <img alt="Figur 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55653/55653fig2.jpg" /> Figur 2: Grafiskt användargränssnitt för att använda Image Analysis Software. ( A ) GUI Window # 1 används för att ladda och bearbeta bilder. Programmet kan ladda upp till 3 proteinkanaler, varigenom 2 kanaler jämförs parvis. Fönstret kommer med obligatorisk (blå) och frivilliga funktioner (grön) för att förbehandla bilderna innan spårning ( B ) GUI Window # 2 används för att spåra filopodium såväl som spatio-temporal och ratio-metrisk proteinanalys. Återigen markeras frivilliga funktioner i grönt. Denna siffra har ändratsEd från referens 12 . <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55653/55653fig2large.jpg" target="_blank">Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.</a> Här presenterar vi ett detaljerat protokoll för provberedning och programhantering. Vi börjar med detaljerade instruktioner om att odla celler och förvärva filmer optimerade för bildanalys. I detta avsnitt om datainsamling följer en detaljerad beskrivning för hur man använder bildanalysprogramvaran. Genom protokollet introducerar vi kritiska steg och valfria funktioner som bör beaktas vid insamling och bearbetning av data. Slutligen analyserar vi filopodier från olika modellsystem med bildanalysprogrammet innan de avslutas med en jämförelse av den beskrivna bildanalysprogrammet med andra program tillgängliga för filopodial kvantifiering och en diskussion om begränsningar och framtida riktning.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="816">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">DMEM</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">31966-021</td>
			<td style="width:204px;"></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">10% Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:204px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:204px;">L11-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Lipofectamine 2000</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">11668-027</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">1% penicillin/streptomycin</td>
			<td style="width:204px;">Biochrom AG</td>
			<td style="width:204px;">12212</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Neurobasal Medium</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">21103-049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">B27</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">17504-044</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">HEPES (1M stock solution)</td>
			<td style="width:204px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:204px;">15630</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Citrine-N1</td>
			<td style="width:204px;">Addgene</td>
			<td style="width:204px;">54593</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;">Labtech</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>155411</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Glutamax-I</td>
			<td>Thermo</td>
			<td>35050-061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Hela</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">COS 7</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-60</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">3T3 cells</td>
			<td>Leibniz Institute DSMZ</td>
			<td>ACC-59</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Microscope</td>
			<td>Nicon Eclipse</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Camera</td>
			<td>Andor</td>
			<td>DU888 Ultra</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Confocal Unit</td>
			<td>Yokagawa</td>
			<td>CSU-X1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:204px;">Pyruvate</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>31966-021</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a graphical user interface for software-assisted tracking of protein concentration in dynamic cellular protrusions

Filopodi är dynamiska, fingerliknande cellulära utskjutningar i samband med migrering och cellcellkommunikation. För att bättre kunna förstå de komplexa signalmekanismer som ligger bakom filopodial initiering, förlängning och efterföljande stabilisering eller retraktion är det avgörande att bestämma den spatio-temporala proteinaktiviteten i dessa dynamiska strukturer. För att analysera proteinfunktionen i filopodi utvecklade vi nyligen en halvautomatiserad spårningsalgoritm som anpassar sig till filopodiella formförändringar, vilket möjliggör parallell analys av utpräglingsdynamik och relativ proteinkoncentration längs hela filopodiallängden. Här presenterar vi ett detaljerat steg för steg protokoll för optimerad cellhantering, bildköp och mjukvaruanalys. Vi tillhandahåller vidare instruktioner för användning av frivilliga funktioner under bildanalys och datarrepresentation samt felsökningsriktlinjer för alla kritiska steg under vägen. Slutligen inkluderar vi också en jämförelse av dSkriven bildanalysprogramvara med andra program som är tillgängliga för kvantifiering av filopodier. Tillsammans tillhandahåller det presenterade protokollet en ram för korrekt analys av proteindynamik i filopodiala utskjutningar med hjälp av bildanalysprogram.

Med hjälp av COS-celler transfekterade med en markör för filamentöst aktin (f-traktin 18 , röd) och en cytosolisk referens (grön) fann vi aktinrika filopodiala utskjutningar ( Figur 3A , toppanel). Tidsserier visade att filopodi snabbt sträcker sig och återträder ( Figur 3A , mittpanel). Med hjälp av bildanalysprogrammet spårade vi sedan enskilda filopodier. Jämförelse av filopodial längd m?...

Watch this Scientific Journal Video about A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions at JoVE.com

A Graphical User Interface for Software-assisted Tracking of Protein Concentration in Dynamic Cellular Protrusions

Vi presenterar en mjukvarulösning för halvautomatisk spårning av relativ proteinkoncentration längs längden av dynamiska cellulära utskjutningar.

En grafisk användargränssnitt för programvaruassisterad spårning av proteinkoncentration i dynamiska cellulära protrusioner

Filopodia are dynamic, finger-like cellular protrusions associated with migration and cell-cell communication. In order to better understand the complex ...

Research

JoVE Journal

Biology

Application of Light-cured Dental Adhesive Resin for Mounting Electrodes or Microdialysis Probes in Chronic Experiments

Tillämpning av Ljus cured Dental Lim Resin för montering Elektroder eller sonder Mikrodialys vid kronisk Experiment

In chronic recording experiments, self-curing dental acrylic resins have been used as a mounting base of electrodes or microdialysis-probes. Since these ...

Visually Mediated Odor Tracking During Flight in Drosophila

Visuellt Medierad Lukt Tracking under Flygning i Drosophila

Flying insects use visual cues to stabilize their heading in a wind stream. Many animals additionally track odors carried in the wind. As such, visual ...

Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer

Microvolume proteinkoncentration Fastställande med NanoDrop 2000C Spektrofotometer

Traditional spectrophotometry requires placing samples into cuvettes or capillaries. This is often impractical due to the limited sample volumes often ...

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid (MYTH) System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-Ubiquitin Based Membrane Yeast Two-Hybrid MYTH System: A Powerful Tool For Identifying Protein-Protein Interactions

Split-ubiquitin Baserat Membrane Jäst Två Hybrid (MYT) System: ett kraftfullt verktyg för att identifiera Protein-protein interaktioner

The fundamental biological and clinical importance of integral membrane proteins prompted the development of a yeast-based system for the high-throughput ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

Betydelsen av korrekt proteinkoncentration för kinetik och affinitet Bestämning i struktur och funktion Analys

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

A Microfluidic Device for Quantifying Bacterial Chemotaxis in Stable Concentration Gradients

Ett mikroflödessystem enhet för att kvantifiera Bakteriella chemotaxis i stabila koncentrationsgradienter

Chemotaxis allows bacteria to approach sources of attractant chemicals or to avoid sources of repellent chemicals. Bacteria constantly monitor the ...

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolation of Labile Multi-protein Complexes by in vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Immuno-magnetic Affinity Chromatography

Isolering av labil Multi-proteinkomplex av In vivo Kontrollerad Cellular tvärbindning och Immuno-magnetiska affinitetskromatografi

The dynamic nature of cellular machineries is frequently built on transient and/or weak protein associations. These low affinity interactions preclude ...

Analysis of the Development of a Morphological Phenotype as a Function of Protein Concentration in Budding Yeast

Analys av utveckling av en morfologisk Fenotyp som en funktion av proteinkoncentration i Budding Jäst

Gene deletion and protein overexpression are common methods for studying functions of proteins. In this article, we describe a protocol for analysis of ...

Tracking Morphogenetic Tissue Deformations in the Early Chick Embryo

Spårning Deformationer Morphogenetic Tissue i tidig Chick Embryo

Embryonic epithelia undergo complex deformations (e.g. bending, twisting, folding, and stretching) to form the primitive organs of the early embryo. ...

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studying Mitotic Checkpoint by Illustrating Dynamic Kinetochore Protein Behavior and Chromosome Motion in Living Drosophila Syncytial Embryos

Studera Mitotisk Checkpoint genom att illustrera Dynamic kinetochore Protein beteende och kromosomer Motion i levande<em&gt; Drosophila</em&gt; Syncytiala Embryon