Name: isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications
Uploaded: 2017-05-18T13:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications at JoVE.com

Bu çalışma, NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] ve P30 DK034987 [UNC-Chapel Hill&#39;e] tarafından desteklenmiştir. Yazarlar, qPCR ve batı leke deneyleriyle ilgili yardım için Deekshita Ramanarayanan&#39;a teşekkür ederler.

Protokol, Kuzey Carolina Üniversitesi&#39;nde Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi&#39;ne (IACUC) uygun olarak onaylandı ve gerçekleştirildi. 1. Preparatlar <ol><li> Triton-X tamponu (% 1 Triton X-100, 5 mM etilendiamintetraasetik asit (EDTA) hazırlayın, fosfat tamponlu salin (PBS), pH 7.4 içinde hacim getirin). 500 mL yapmak için: Triton X-100 ve 500 mM EDTA&#39;dan her biri 5 mL, 490 mL PBS&#39;ye, pH 7.4&#39;e karıştırın. Triton-X tampon çözeltisini 4 ° C&#39;de saklayın. </li><li>...

IF proteinlerinin biyokimyasal olarak tanımlanmasını sağlayan yöntemler, IF proteinleri hem hücresel hem de doku stresinin belirteçleri ve modülatörleri olduğu için, memeli sistemlerinde çok sayıda patofizyolojik olayı anlamak için yararlı olabilir. Mevcut yöntemin arkasındaki ilke, IF proteinlerini hücrelerden ve dokulardan izole etmek, ayırmak ve yeniden oluşturmak için 1970&#39;lerde ve 1980&#39;lerde geliştirilen başlangıç ​​prosedürlerine dayanmaktadır, bunlar genellikle düşük ve ...

<html> IF&#39;ler, insanlarda 73 gen ile kodlanan ve altı ana tipte sınıflandırılan protein ailesidir: I-IV tipleri sitoplazmiktir ( örn., Epitelyal ve saç keratinleri (K), miyosit desmin, nevrofilamentler, glial fibriler asidik protein (GFAP) ve diğerleri); V tipi nükleer lamindir; Ve tip VI, göz mercekinde 1 IF&#39;lerdir. Moleküler organizasyonları bakımından, IF proteinleri üç ortak alana sahiptir: yüksek oranda korunmuş sargılı bobin çubuk alanı ve küresel &quot;baş&quot; ve &quot;kuyruk&quot; alanları. IF protein tetramers, mekanik koruma 2 , stres algılama 3 , 4 , transkripsiyon regülasyonu 5 ve büyüme ve diğer kritik hücresel fonksiyonlarla ilgili olan dinamik sitoskelet ve nükleoskelet yapılarını şekillendiren olgun filamentlere dahil olan kısa filament öncüleri oluşturmak üzere bir araya gelir.&quot;1 , 6 , 7 . IF sisteminin işlevsel önemi, nöropatiler, miyopati, cilt kırılganlık bozuklukları, metabolik işlev bozuklukları ve erken yaşlanma sendromları gibi IF genlerinde missense mutasyonlarının yol açtığı birçok insan hastalıklarının varlığı ile vurgulanır. Bazı IF geni mutasyonları neden olmaz, ancak taşıyıcılarını karaciğer hastalığında basit epitel keratin gibi hastalığın ilerlemesine yatkın hale getirir. İkincisi, epitelde IFN&#39;lerin kritik stres koruyucu işlevlerinden kaynaklanmaktadır. Genel olarak IF&#39;ler bazal koşullar altında en bol hücresel proteinler arasındadır, ancak çeşitli stres türleri boyunca daha da kuvvetle uyarılırlar10. Örneğin, nematod C. elegans&#39;daki proteom çapındaki değişiklikleri değerlendiren son çalışmalar, çoklu IF&#39;lerin yüksek şekilde düzenlendiğini ve aga eğilimli olduğunu ortaya koymuşturOrganizmal yaşlanma sırasında 11 , 12 . Uygun bir IF yapısının idame ettirilmesi, çeşitli stres biçimlerine karşı hücresel direnç için zorunlu olduğu için, IF agregasyonu yaşlanma sırasında işlevsel düşüşe katkıda bulunabilir. Bununla birlikte, stres yaşayan farklı dokularda birden fazla memeli IF proteinini inceleyen organizma düzeyinde çalışmalar bulunmamaktadır. IF&#39;ler, hücresel talepleri karşılamak için adapte olmuş dinamik yapılardır. Örneğin, Keratinler, çözünebilir (lifsiz) ve çözünmeyen (lifli) protein havuzu 13 arasında biyosentezden bağımsız bir şekilde geçiş yapmaktadır. Normal fizyolojik koşullar altında, toplam K8 / K18 havuzunun deterjan içermeyen tamponda yaklaşık% 5 oranında ekstrakte edilebileceği, non-iyonik deterjan Nonidet P-40&#39;da çözünür hale getirilebilecek yaklaşık% 20&#39;ye kıyasla biyokimyasal olarak Triton- X100 14 , </s15 yaş üstü. Mitoz sırasında basit tip epitelyal K8 ve K18 14&#39;ün çözünürlüğünde dikkate değer bir artış vardır; bu, epidermal keratinlerde daha az belirgindir, ancak vimentin ve diğer tip III IF proteinleri 15 , 16&#39;da daha belirgindir. IF proteinlerinin çözünürlük özellikleri, filament yeniden düzenlenmesi ve çözünürlüğü için anahtar post-translasyonel modifikasyon (PTM) olan fosforilasyon ile sıkıca düzenlenir 17 , 18 , 19 , 20 . Çoğu İE, korunan alanlarda bir dizi PTM tarafından kapsamlı bir düzenleme altına girer ve işlevsel değişikliklerle sonuçlanır 17 . Bu yöntemin amacı IF alanında yeni araştırmacılar ile IF fare dokularında IF proteinlerinin çalışılması için biyokimyasal ekstraksiyon ve analitik yöntemler getirmektir. ÖzelMüttefik olarak, yüksek tuz ekstraksiyon yöntemiyle IF proteinlerinin izole edilmesine ve kütle spektrometresi ve PTM hedefleyen antikorlar vasıtasıyla PTM&#39;lerin değişimlerinin değerlendirilmesine odaklanıyoruz. Bu yöntemler, önceden yayınlanmış prosedürleri 21 üzerine inşa etmekte ancak IF ailesinde düzenleme için ortak mekanizma ortaya çıkarmak için farklı IF protein tiplerini çıkarmak için değişiklikler içermektedir. Örneğin, belirli bir lisin kalıntısındaki K8 asetilasyonu filament organizasyonunu düzenlerken, hiperazetillenme K8 çözünmezliğini ve agregat oluşumunu teşvik eder 22 . Yakın zamanda yapılan küresel proteomik profil çalışmaları, dokuya özgü IF proteinlerinin çoğunun aynı zamanda asetilasyon hedefi olduğunu ve çoğu IF asetilasyon sahasının yüksek oranda korunmuş çubuk alanıyla sınırlandırıldığını ortaya koymuştur. Bu, IF sisteminin küresel profillemesi için uygun yöntemlere duyulan ihtiyacın altını çizer. Opti&#39;de otomatik homojenizasyon kullanarak çok sayıda dokudan IF proteinlerini izole etmek için hızlı bir yöntem de sunuyoruzMized lysing matrisi. Elde edilen müstahzarlar, kütle spektrometrisi ve diğer metotlar ile aşağı akım PTM analizi için uygundur.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10009</td>
			<td>immunoprecipitation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>for buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA mini kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12183018</td>
			<td>RNA extraction from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNAse set</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12185010A</td>
			<td>on column DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamag-2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>magnet for use with dynabeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24592</td>
			<td>mass spectrometry-compatible gel stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td>for use in western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA reverse transcription kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4368813</td>
			<td>for use in gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proflex 3x32-well PCR System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4484073</td>
			<td>PCR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF transfer membrane&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88520</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Up SYBR master mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A25778</td>
			<td>for qPCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td>solution for tissue storage prior to RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 4-20% Tris Glycine Gel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>Precast protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Keratin 8 antibody (TS1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA514428</td>
			<td>for western blot detection of K8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA511883</td>
			<td>for western blot detection of vimentin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine Transfer Buffer (25X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC3675</td>
			<td>for wet transfer of protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SDS Sample Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>for preparing protein gel samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine SDS Running Buffer (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC26755</td>
			<td>for running protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix SS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116921100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
			<td>measurement of protein and nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>EQ03119</td>
			<td>Automated tissue homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications

Orta filamentler (IF), aktin filamentleri ve mikrotübüller ile birlikte, her hücrenin kritik bir yapısal öğesi olan hücre iskeletini oluştururlar. Normal işleyen IF&#39;ler mekanik ve stres direnci hücrelere neden olurken, işlevsiz bir IF sitoskeletonu hücresel sağlığa zarar verir ve birçok insan hastalıklarıyla ilişkilendirilmiştir. Translasyon sonrası modifikasyon (PTM), fizyolojik değişikliklere ve stres koşullarına bağlı olarak IF dinamiklerini eleştirel olarak düzenler. Bu nedenle, IF&#39;lerin PTM imzasındaki değişiklikleri izleyebilme özelliği, IF sisteminin hücresel yaralanma sırasında bir stres tepkisi olarak daha iyi bir fonksiyonel anlayışa ve nihai olarak şartlandırılmasına katkıda bulunabilir. Bununla birlikte, 70&#39;den fazla bireysel gen tarafından kodlanan ve dokuya bağlı bir şekilde ifade edilen çok sayıda IF proteini, farklı PTM&#39;lerin göreli önemini belirlemede önemli bir zorluktur. Bu amaçla IF proteinleri üzerinde PTM&#39;lerin izlenmesini sağlayan yöntemlerAilenin izole edilmiş üyeleri yerine bir organizma genelinde bu alanda araştırma ilerlemesini hızlandırabilir. Burada, 9 değişik fare dokusundan (beyin, kalp, akciğer, karaciğer, ince bağırsak, kalın bağırsak, pankreas, böbrek ve protein) IF proteinlerinin toplam, deterjana özülebilir ve deterjana dirençli fraksiyonunun izolasyonu için biyokimyasal yöntemler sunuyoruz. dalak). Ayrı bir fare dokusunun lizing matrisi ve otomatik homojenizasyonunu kullanarak IF proteinlerinin hızlı izolasyonu için optimize edilmiş bir protokol daha ortaya koyduk. Otomatik protokol, yüksek numune hacmi olan deneylerde (birden çok hayvanı ve deney grubu içeren hastalık modellerinde olduğu gibi) IF&#39;leri profillemek için kullanışlıdır. Ortaya çıkan numuneler, kütle spektrometresi tabanlı PTM profillemesi de dahil olmak üzere çeşitli aşağı akım analizleri için kullanılabilir. Bu yöntemleri kullanarak, farklı fare dokularındaki (beyin ve karaciğer) IF proteinlerinin ekspresyonlarına paralel olarak değiştiğini gösteren yeni veriler sunmaktayızYaşlanma esnasında serum düzeyleri ve PTM&#39;ler.

Lizing matrisi kullanarak birden çok fare dokusundan IF proteinlerinin yüksek tuz esaslı ekstraksiyonu için yeni hızlı bir yöntem. Orta fılamat protein fraksiyonunun hacmini epitel dokudan izole etmek için kullanılan geleneksel yöntem 25,26 burada dokuz farklı organı ve doku lizisi için daha hızlı bir prosedürü içerecek şekilde değiştirildi. Geleneks...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications at JoVE.com

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

Bu yöntemde, birden fazla fare dokusundan ara fılaman (IF) proteinlerinin hızlı ve etkin izolasyonu için biyokimyasal prosedürler sunulmaktadır. İzole edilmiş IF&#39;ler, kütle spektrometresi ve diğer biyokimyasal testlerle translasyon sonrası modifikasyon değişikliklerini incelemek için kullanılabilir.

Yaşlanmaya Bağlı Translasyon Sonrası Değişiklikleri İncelemek İçin Birden Fazla Fare Dokusundan Ara Filament Proteinlerinin İzolasyonu

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

RNA ölçülmesi için bir yöntem<em&gt; K</em<sup&gt; 6</supHücre ve dokularda&gt; -methyladenosine Değişiklikler

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Özünde Düzensiz Proteinlerin Çoklu fosforilasyon Saptanma Nükleer Manyetik Rezonans Spektroskopisi

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

Bir endojen translasyonel modifikasyon profil hedef proteinler için tanımlamak için bir kapsamlı Immunoprecipitation zenginleştirme sistemi kullanan

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Yalıtım Glomeruli ve Glomerular hücre yüzey proteinleri Vivo etiketleme

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Dışa bakıyor: Siyanobacterial serbest karbonhidrat polimerleri ve proteinleri Izolasyonu

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin ve Ubiquitin benzeri Bağımlı Post-translational Modifikasyonlar ve Önemli Değişikliklerin Belirlenmesi Profilleme

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Olgun Pirincin Enine Kesiti (Oryza sativa L.) Hareketsizleştirme Desteği Olarak Pipet İpuçlarını Kullanarak Elektron Mikroskopi Görüntülemesini Taramak için Çekirdekler

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

Tubulin'in Kontrollü Posttranslational Modifikasyonlar ve Sınırlı Kaynaklardan İzotiplerle Polimerizasyon-Depolimerizasyon Döngüleri ile Saflaştırılması

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Memeli Hücrelerinden Ubikitinlenmiş p53 Proteinlerinin Saflaştırılması

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...

High-Resolution Neutron Spectroscopy to Study Picosecond-Nanosecond Dynamics of Proteins and Hydration Water

Proteinlerin ve hidrasyon suyunun pikosaniye-nanosaniye dinamiklerini incelemek için yüksek çözünürlüklü nötron spektroskopisi

Neutron scattering offers the possibility to probe the dynamics within samples for a wide range of energies in a nondestructive manner and without ...