Name: methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules
Uploaded: 2017-05-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules at JoVE.com

ونشكر أعضاء مختبري إيفانوف وأندرسون على مناقشاتهما المفيدة وردود الفعل بشأن هذه المخطوطة. وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة [GM111700 و CA168872 إلى السلطة الفلسطينية، NS094918 إلى بي]، والمركز الوطني للعلوم في بولندا [منحة أومو 2012/06 / M / NZ3 / 00054 إلى وس]. كما تعترف وزارة الصحة والتعليم العالي في بولندا (برنامج موبيليتي بلس) ولجنة فولبرايت البولندية الأمريكية لدعمهم المالي لبحوثه في الولايات المتحدة الأمريكية.

1. إعداد الخلية <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة كوفرسليبس تعقيمها إلى 12 بئرا من لوحة 24 جيدا، كما هو مبين في الشكل 1A . وهذا يمكن القيام به باستخدام ماصة باستير العقيمة تعلق على فراغ لالتقاط كل ساترة. اضغط بلطف ساترة على جانب البئر للافرا?...

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Yamasaki, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+mRNA+translation+during+stress.">Reprogramming mRNA translation during stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).</li><li>Buchan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNP+granules:+Assembly,+function,+and+connections+with+disease.">mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease.</a> RNA Biol. 11 (8), (2014).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+ternary+complex+(eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules.">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li><li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+and+cell+signaling:+more+than+just+a+passing+phase?.">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase?.</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+shuttling+of+TIA-1+accompanies+the+recruitment+of+mRNA+to+mammalian+stress+granules.">Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).</li><li>Bley, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+are+dispensable+for+mRNA+stabilization+during+cellular+stress.">Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 43 (4), e26 (2015).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP-Caprin1-USP10+complexes+mediate+stress+granule+condensation+and+associate+with+40S+subunits.">G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits.</a> J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).</li><li>Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+mammalian+stress+granule+dynamics.">Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics.</a> J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules,+P-bodies+and+cancer.">Stress granules, P-bodies and cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).</li><li>Aulas, A., Van de Velde, ., C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+stress+granule+dynamics+driven+by+TDP-43+and+FUS:+a+link+to+pathological+inclusions+in+ALS?.">Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS?.</a> Front Cell Neurosci. 9, 423 (2015).</li><li>Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulatory+networks+in+immunity.">Post-transcriptional regulatory networks in immunity.</a> Immunol Rev. 253 (1), 253-272 (2013).</li><li>Wolozin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+protein+aggregation+run+amuck:+stress+granules+and+the+genesis+of+neurodegenerative+disease.">Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease.</a> Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).</li><li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+stress+granules+and+P-bodies+during+RNA+virus+infection.">Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).</li><li>Somasekharan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YB-1+regulates+stress+granule+formation+and+tumor+progression+by+translationally+activating+G3BP1.">YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1.</a> J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).</li><li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib,+a+multikinase+inhibitor,+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells.">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. , (2015).</li><li>Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules.">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell Int. 10, 12 (2010).</li><li>Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+ubiquitin-proteasome+system+induces+stress+granule+formation.">Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation.</a> Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).</li><li>Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+activates+HIF-1+to+regulate+vascular+radiosensitivity+in+tumors:+role+of+reoxygenation,+free+radicals,+and+stress+granules.">Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules.</a> Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).</li><li>Szaflarski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vinca+alkaloid+drugs+promote+stress-induced+translational+repression+and+stress+granule+formation.">Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation.</a> Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).</li><li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1.">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li><li>Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+TIA-1+and+TIAR+link+the+phosphorylation+of+eIF-2+alpha+to+the+assembly+of+mammalian+stress+granules.">RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li><li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).</li><li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+method+for+mapping+genes+on+Drosophila+polytene+chromosomes.">Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+characterization+of+stress+granules+in+virus+infected+cells.">Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells.</a> Methods. 90, 57-64 (2015).</li><li>David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emetine+optimally+facilitates+nascent+chain+puromycylation+and+potentiates+the+ribopuromycylation+method+(RPM)+applied+to+inert+cells.">Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells.</a> Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).</li><li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+visualization+and+dynamics+of+newly+synthesized+proteins+in+rat+hippocampal+neurons.">In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).</li><li>Ruggieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+oscillation+of+translation+and+stress+granule+formation+mark+the+cellular+response+to+virus+infection.">Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).</li><li>Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+contribute+to+alpha-globin+homeostasis+in+differentiating+erythroid+cells.">Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).</li><li>Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+RNAi+screen+links+O-GlcNAc+modification+of+ribosomal+proteins+to+stress+granule+and+processing+body+assembly.">A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly.</a> Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).</li><li>Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+regulated+by+arsenate+and+arsenite.">Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite.</a> Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).</li><li>Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+binding+to+proteins.">Arsenic binding to proteins.</a> Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).</li><li>McDonald, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+(TDP-43)+regulates+stress+granule+dynamics+via+differential+regulation+of+G3BP+and+TIA-1.">TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1.</a> Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).</li><li>Aulas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP1+promotes+stress-induced+RNA+granule+interactions+to+preserve+polyadenylated+mRNA.">G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA.</a> J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).</li><li>Martin, S., Tazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+G3BP+stress+granules+dynamics+in+live+primary+cells.">Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li><li>Wippich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+specificity+kinase+DYRK3+couples+stress+granule+condensation/dissolution+to+mTORC1+signaling.">Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling.</a> Cell. 152 (4), 791-805 (2013).</li></ol>

كما يتضح من الدراسات المناعية في أمراض متعددة، والإجهاد المزمن يؤدي إلى تشكيل بؤر الخلايا المختلفة. على سبيل المثال، وتتميز معظم الأمراض العصبية من المجاميع داخل الخلايا من البروتينات غير قابلة للذوبان. وجود البروتينات المرتبطة سغ في مثل هذه المجاميع غالبا ما يكون ...

الخلايا توظف العديد من الآليات للرد على الإجهاد. تحدث بعض الردود على مستوى ما بعد النسخي وتشمل تنظيم ترجمة مرنا و / أو الاستقرار 1 ، 2 . يرتبط ترانزلاتد مرنا اعتقال متعدية وتدهور مع تشكيل بؤر الخلوية غير الغشائية محددة، والأكثر تميزا كونها حبيبات الإجهاد (سغس) 3 . سغس هي البؤر السيتوبلازمية التي تركز ترانزلاتس نونترانزلاتينغ في ترانزلاتيونالي-القبض على خلايا الاستجابة للضغط (على سبيل المثال، الأكسدة، صدمة الحرارة، المغاعة المغذية، والعدوى الفيروسية) 4 . بالإضافة إلى مرناس نونترانزلاتينغ، سغس تحتوي على عوامل بدء الترجمة، والبروتينات ملزمة رنا، والبروتينات التشوير المختلفة 5 . سغس هي المؤشرات الحيوية لترجمة البروتين تحولت وتغيير الأيض رنا وتم ربطها إلى بقاء الخلية وموت الخلايا المبرمج، مسار إشارةs، والعمليات النووية 5 . سغس هي الكيانات الحيوية، وتشكيلها يرتبط ارتباطا وثيقا بحالة الترجمة الخلوية 6 . على الرغم من مظهرها على ما يبدو الصلبة، معظم مكونات البروتين سغ المكوك بسرعة داخل وخارج، مع وقت الإقامة ثانية. في حين تستمر سغس لمدة دقائق إلى ساعات، معظم مكوناتها في التدفق السريع. تثبيط بدء الترجمة وما يترتب على ذلك من تفكيك بوليسوميس ترجمة تعزيز تشكيل لجان الدراسات؛ وبالتالي، سغس هي في حالة توازن مع ترجمة بوليسوميس. هذا التوازن بوليسوم / سغ هو المفتاح لتمييز سغس حسن النية من غيرها من بؤر التوتر الناجم 6 ، 7 . ويستتبع توقيف بدء الترجمة تحويل مجمعات ما قبل الشروع في الترجمة المؤهلة التي تحتوي على مرنا، وعوامل بدء الترجمة (إيف)، و 40 S وحدات فرعية ريبوسومية<html> س يسمى المجمعات 48S) في المجمعات المتوقفة ترانزلاتيونالي (ما يسمى 48S * المجمعات) التي يمكن أن تتجمع في سغس 4 ، 6 . يتم تشجيع سغس عن طريق الاعتقال متعدية في خطوتين مختلفتين المنبع من تشكيل 48S معقدة: التدخل مع وظائف مجمع EIF4F ملزمة ملزمة (على سبيل المثال، استهداف الوحدة الفرعية eIF4A) أو فسفرة من وحدة α من عامل بدء الترجمة eIF2، بوساطة واحدة أو أكثر من كيناسيس eIF2 الأربعة. وجود المجمعات 48S المتوقفة ( أي 40S الوحدات الفرعية الريباسي وعوامل بدء الترجمة المختارة) هي سمة من سغس 8 ، 9 . وقد تم ربط سغس إلى حالات المرضية المختلفة، مثل العدوى الفيروسية، التنكس العصبي، المناعة الذاتية، والسرطان 3 ، 10 ، 11 ،سس = &quot;كريف&quot;&gt; 12 ، 13 . وترتبط أشكال متغيرة من العديد من مكونات سغ مع الأمراض العصبية التناسلية (على سبيل المثال، التصلب الجانبي الضموري) التي الخلايا العصبية عرض الإدخالات المرضية داخل الخلايا التي قد تلعب أدوارا نشطة في وفاة الخلايا العصبية 13 . بعض الفيروسات خطف مكونات سغ لتمنع تشكيل سغ وتعزيز تكاثر الفيروس 14 . وتربط الدراسات الحديثة أيضا بين سغس والسرطان 15 وبقاء الخلايا السرطانية تحت العلاج الكيميائي والعلاج الإشعاعي 10 و 16 و 17 و 18 و 19 و 20 . في حين أن هذه النتائج قد أثارت اهتماما كبيرا في علم الأحياء سغ، العديد من التقارير المنشورة تفتقر إلى ضوابط هامة للتمييز بين تشكيل لجان الدراسات النية الحسنة من بؤر أخرى الناجم عن الإجهاد. وقد وصفت سغس في البداية على أنها بؤر السيتوبلازمية غير الغشائية تتألف من البروتينات مرنا ملزم مختارة (ربس)، بما في ذلك مستضد الخلايا التائية الخلايا التائية 1 (تيا-1) والبولي ملزم A- البروتين (باب). عوامل بدء الترجمة؛ مرنا بوليادينيلاتد؛ ووحدات صغيرة ريبوسومية 4 ، 6 ، 21 ، 22 . تقليديا، وقد تم تحديد تكوينها من خلال تقنيات مثل إمونوستينينغ والتعبير خارج الرحم من البروتينات الموسومة فلورزنتلي 23 ، 24 . نظرا لطبيعة دينامية للغاية، و إمونولوكاليزاشيون من البروتينات سغ و / أو مرناس لا تزال منهجية تحديد للكشف عن سغس 23 ، 24 . حتى الآن، يتم وصف العديد من الممارسات التجارية التقييدية والبروتينات الأخرى (أكثر من 120 بروتينات متميزة) كمكونات سغ 11 . كما العديد من Sالبروتينات G محلية تغيير توطينها في كل من تعتمد على الإجهاد ومستقلة ويمكن أن تتراكم في مقصورات داخل الخلايا والبؤر الأخرى، فمن المهم اختيار علامات سغ الصحيح وتوظيف معايير وظيفية للتمييز سغس من أنواع أخرى من الإجهاد الناجم عن البؤر. تحتوي سغس حسن النية على مرنا، عوامل بدء الترجمة، وحدات فرعية ريبوسومية صغيرة وهي في توازن ديناميكي مع الترجمة. تم تصميم هذا سير العمل البسيط لتحديد ما إذا كانت بؤر التوتر الناجم عن سغس حسن النية . ويشمل هذا العمل عدة نهج تجريبية باستخدام خلايا U2OS، والخلايا التي تستخدم عادة لدراسة لجان الدراسات. هذه الخلايا مثالية، كما أن لديها السيتوبلازم كبير، هي مسطحة نسبيا، ونعلق بقوة على كوفرسليبس الزجاج. أنواع الخلايا الأخرى يمكن استخدامها لدراسة سغس، ولكن من المهم أن ندرك أن الاختلافات في توقيت وتركيز الدواء، وفرة من البروتينات سغ نواة يمكن أن يغير حركية و كومبوsition. بالإضافة إلى ذلك، بعض الخلايا تستجيب لتثبيت بارافورمالدهيد من خلال تشكيل بقايا سطح الخلية، وإعطاء ثم مظهر تكدرت أن يسبب توطين منقط بعض علامات سغ. دون تحليل دقيق، وهذه يمكن أن تصنف على أنها سغس. وهذا يسلط الضوء على ضرورة تقييم جميع المعايير المطلوبة لتحديد البؤر التي يسببها التوتر كما سغس حسن النية . يستخدم فينورلبين (فرب)، والعلاج السرطان الذي يعزز سغس 20 ، فضلا عن أرسينايت الصوديوم (سا)، قوية ومميزة سغ محرض، كضغوط للتجارب في هذا البروتوكول. سغس الكنسي تحتوي على علامات سغ متعددة (كل من البروتينات و مرناس) أن كولوكاليز في البؤر السيتوبلازم. يستخدم هذا البروتوكول على حد سواء المناعي والمضان في التهجين الموضعي (فيش) للكشف عن توطين علامات البروتين و مرنا بوليادينيلاتد 22 ، على التوالي. باختصار، المناعي غير المباشر يستخدم الأجسام المضادة ( ط.ه. الأجسام المضادة الأولية) محددة لبروتين معين للكشف عن ذلك داخل الخلية. ثم، الأجسام المضادة الثانوية (عادة الأنواع محددة) تعلق على فلوروكروميس التعرف على الأجسام المضادة الأولية وتكشف عن توطين البروتين المستهدف. يستخدم الفلورسنت المجهري للكشف عن إشارة مترجمة داخل الخلية. استخدام الأجسام المضادة المنتجة في أنواع مختلفة والكشف عنها مع الأجسام المضادة الثانوية الملونة بشكل مختلف يسمح للكشف عن كولوكاليزاتيون من الأجسام المضادة متعددة، مشيرا إلى أن أهداف البروتين وجدت في نفس الموقع 23 . من المهم تحديد علامات التي تم التحقق منها إلى كولوكاليز في سغس حسن النية . يستخدم فيش مسبار المسمى أن قاعدة أزواج لتسلسل الحمض النووي الريبي أو الحمض النووي محددة 25 . للكشف عن مرنا، يستخدم هذا البروتوكول قليل البيروكسيديز (دت) 40 التحقيق التي تهجين (أو قاعدة أزواج) إلى ذيل بوليا من مرنا ( أي بوليا فيSH). ثم يتم الكشف عن التحقيق البيروكسيديز باستخدام ستريبتافيدين مترافق فلورزنتلي، كما ستريبتافيدين لديه تقارب عالية لالبيوتين. عند تقييم سغس، من المهم للزوجين بوليا فيش مع المناعي الكشف عن علامة سغ، كما هو الحال في سغس حسن النية ، يجب أن إشارات اثنين كولوكاليز. باستخدام هذا البروتوكول، يتم تقييم كولوكاليزاشيون بطرق متعددة. في صورة متعددة القنوات ( أي رغب: الأحمر والأخضر والأزرق)، سوف كولوكاليزاتيون تغيير لون إشارة متداخلة (على سبيل المثال كولوكاليزد الأحمر والأخضر تظهر الصفراء) 23 . بالإضافة إلى ذلك، يتم قياس كولوكاليزاتيون بيانيا باستخدام تحليل المسح خط، حيث يتم قياس كثافة كل لون عبر خط معين 8 ، 20 . يصف هذا البروتوكول خطين إجراءات تحليل المسح الضوئي باستخدام إيماجيج 26 . إجراء واحد هو دليل ويذهب من خلال العملية برمتها، ويلو الآخر يستخدم ماكرو، أو برنامج بسيط أن أتمتة الخطوات اليدوية. من المهم أن تذهب من خلال البرنامج اليدوي لفهم الإجراء الكلي. سغس تشكل في الخلايا حيث يتم قمع الترجمة؛ وبالتالي، يجب أن الخلايا مع سغس عرض مستويات منخفضة من الترجمة العالمية مقارنة مع الخلايا غير المعالجة. تجريبيا، يتم استخدام ريبوبوروميسلاتيون. ويضاف بوروميسين و إميتين إلى خلايا لفترة قصيرة قبل التثبيت، والسماح لل بوروميسين لدمج في بولي ببتيدس تشكيل بنشاط، مما تسبب في إنهاء 27 ، 28 . العلاج مع إميتين مطلوب لمنع إعادة بدء 29 . يمكن بعد ذلك الكشف عن بوروميسين باستخدام الأجسام المضادة لمكافحة بوروميسين، وإعطاء لقطة من الترجمة النشطة. يستخدم هذا الأسلوب لأنه سريع، لا يتطلب ما قبل الجوع مع وسط تفتقر إلى حمض أميني معين (ويحتمل أن تكون مسبقة الخلايا)، ويكشف عنالتوطين تحت الخلوية للترجمة البروتين. وقد استخدمت طرق أخرى، لا سيما باستخدام النظير الأحماض الأمينية المعدلة، مثل الميثيونين التناظرية L-أزيدوهوموالين (أها)، إلى جانب &quot;كليك-إيت&quot; الكيمياء 30 ، لإظهار أن الخلايا التي تحتوي على سغس تظهر ترجمة أقل بكثير من الخلايا المجاورة 31 . ومع ذلك، يتطلب هذا الأسلوب جوعا ميثيونين تليها النبض العلامات لمدة 15-30 دقيقة. يشكل المجاعة ميثيونين ضغوطا إضافية، في حين أن الوقت الطويل وضع العلامات ( أي 15-30 دقيقة) يؤدي إلى قياس الترجمة التراكمية بدلا من الترجمة الجارية ويسمح أيضا البروتينات حديثا توليفها للانتقال من موقع تخليق إلى وجهتهم النهائية داخل خلية - زنزانة. في المقابل، ريبوبوروميسيلاتيون هو أسرع بكثير ومتوافق مع أي وسيلة، مثل المتوسطة الخالية من الجلوكوز المستخدمة للحث على سغس عن طريق المجاعة الجلوكوز. سغس الكنسي هي في التوازن الديناميكيمع ترجمة نشطة بوليسوميس. ويمكن تقييم هذا تجريبيا من خلال علاج العينات مع الأدوية التي استقرار أو زعزعة بوليسوميس، وبالتالي تحريك التوازن بين سغس و بوليسوميس 23 . سيكلوهكسيميد (أو إميتين، الذي يتصرف على نحو مماثل) كتل استطالة عن طريق &quot;تجميد&quot; ريبوسوم على مرنا، وبالتالي تقليل مجموعة من مرنبس غير بوليسومال قادرة على تشكيل سغس. من الناحية التجريبية، يمكن استخدام ذلك بطريقتين: عن طريق إضافة سيكلوهيكسيميد (أو إميتين) قبل الإجهاد لمنع تشكيل سغ أو بإضافة سيكلوهيكسيميد (أو إميتين) بعد تشكيل سغس، حتى من دون إزالة عامل تشديد، مما تسبب في تفكيك سغ، كما توقف يتم إدخال مجمعات برينيتياتيون ببطء في جزء بوليسوم. في المقابل، بوروميسين يسبب إنهاء سابق لأوانه ويعزز التفكيك بوليسوم، وزيادة مجموعة من مرناس بدء قادرة على تجميع في سغس. من الناحية التجريبية، والعلاج بوروميسين يزيد من عدد سغس أو يخفض ثريشولد التي تشكل في استجابة للضغط متدرج أو جرعة الدواء. عند تقييم تأثير البوروميسين، فمن المهم استخدام مستوى دون الحد الأقصى للدواء من الفائدة، كما من المتوقع بوروميسين لزيادة تأثير الدواء وزيادة النسبة المئوية للخلايا عرض سغس - وهذا لا يمكن أن يحدث إذا كان الدواء / الإجهاد يسبب سغس في 100٪ من الخلايا في البداية. هذا يتناقض مع العلاج سيكلوهكسيميد، الذي يفكك سغس ويعمل بشكل أفضل عندما ~ 95٪ من الخلايا في البداية عرض سغس بحيث يمكن ملاحظة أكبر انخفاض ممكن وكمية بدقة. يوفر هذا البروتوكول إطارا لدراسة سغس في خلايا الثدييات. وتشمل الطرق: (1) تلطيخ إمونوفلورزنت وتحليل إيماجيج لتقييم كولوكاليزاتيون الكلاسيكية سغ المرتبطة علامات eIF4G، eIF3b، و راس غتباز تفعيل البروتين ملزمة البروتين 1 (G3BP1) في سغس المفترضة. (2) أوليغو (دت) مضان في الموقع التهجين (بوليا فيش) للكشف عن مرنا بوليادنيلاتد. (3) سيكلوهيكسيميد والعلاج بوروميسين لتحديد ما إذا كان البؤر الناجم عن التوتر في التوازن الديناميكي مع بوليسوميس. و (4) ريبوبوروميلاتيون لتقييم الوضع متعدية من الخلايا التي تحتوي على سغس المفترض. معا، يمكن لهذه المقايسات تحديد ما إذا كان يمكن أن تصنف بؤر التوتر الناجم عن سغس حسن النية .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174;HTB-96&#8482;</td>
			<td>- commonly written as &#34;U2OS&#34; 
			- culture at 37 &#176;C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>- abbreviated DMEM 
			- contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red 
			- supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin 
			- prewarm prior drug(s) dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td>- abbreviated FBS 
			- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline streptomycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tissues</td>
			<td>KIMTECH SCIENCE</td>
			<td>34120</td>
			<td>- commonly called &#34;kimwipes&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>- autoclaved before used 
			- keep sterile in the tissue culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium (meta)arsenite &#8805;90%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7400-100G</td>
			<td>- commonly called sodium arsenite and abbreviated SA 
			- dissolution in water at 1 M concentration, then dilute to 100 &#181;M as a working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>TSZ CHEM</td>
			<td>RS055</td>
			<td>- abbreviated VRB 
			- dissolve in water to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9620</td>
			<td>- used to assess translation level (ribopuromycylation) 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emetine dihydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2375</td>
			<td>- used in combination with puro to assess general translation level 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859</td>
			<td>- abbreviated CHX 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Lonza / VWR</td>
			<td>95042-486</td>
			<td>- abbreviated PBS 
			- wash buffer for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>- make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved 
			- aliquots can be stored at - 20 &#176;C for several months 
			- hazardous, use ventilation 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS</td>
			<td>BDH / VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td>- pre-chilled to -20&#176;C before use 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td>- abbreviated NHS 
			- dilute to 5% in PBS 
			- add sodium azide for storage at 4&#176;C 
			- blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td>
			<td>Decon Labs / VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>- dilute to 70% with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-81940</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- use at 1/100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti eIF4G antibody (H-300)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-11373</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti eIF3&#951; (N-20) antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-16377</td>
			<td>- eIF3&#951; is also known as eIF3b 
			- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti puromycin 12D10 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE343</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-225-150</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/2500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td>- incubate with secondary antibodies 
			-stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light 
			- Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>016-160-084</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions, then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-(dT)40x probe biotinilated</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>/</td>
			<td>- reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20&#176;C 
			- dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use 
			- custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridation box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>- make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom 
			- prewarm the box prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x SSC buffer</td>
			<td>Thermo fisher Ambion</td>
			<td>AM9763</td>
			<td>- dilute to 2X SSC using RNase Free water (DEPC treated) 
			- store at room temperature 
			- wash buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfectHybPlus Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7033-50ml</td>
			<td>- block and probe incubation buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide mounting media</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>- mix 5 g of &#8220;cold-soluble&#8221; poly(vinyl alcohol) in 20 ml of PBS 
			- mix by sonication, followed by stirring overnight at RT 
			- Add 5 ml of glycerol and 0.2 ml of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT 
			- centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet 
			- aliquot viscous liquid, long-term storage at -20&#176;C, 1 week at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>- usually referred as &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-8136-250G</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100ML</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td>- preservative agent for blocking solution and vinol 
			- make a 20 % dilution in water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules

وغالبا ما تتحدى الخلايا التغيرات البيئية المفاجئة. حبيبات الإجهاد (سغس)، المجمعات ريبونوكلوبروتين السيتوبلازمية التي تشكل في الخلايا المعرضة لظروف الإجهاد، متورطة في جوانب مختلفة من استقلاب الخلية والبقاء على قيد الحياة. تقوم سغس بتعديل مسارات الإشارات الخلوية، التعبير الجيني بعد النسخي، وبرامج الاستجابة للإجهاد. تشكيل هذه الحبيبات التي تحتوي على مرنا يرتبط مباشرة إلى الترجمة الخلوية. يتم تشغيل الجمعية سغ من قبل بدء الترجمة المثبطة، ويتم تشجيع التفكيك سغ عن طريق تفعيل الترجمة أو عن طريق استطالة الترجمة المثبطة. ويبرز تكوين لجنة الدراسات هذه العلاقة. مكونات سغ الأساسية توقفت مجمعات ما قبل البدء في الترجمة، مرنا، والبروتينات ملزمة رنا مختارة (ربس). والغرض من الجمعية سغ هو الحفاظ على الطاقة الخلوية عن طريق عزل مرناس التدبير المنزلي المتوقفة ترانزلاتيونالي، مما يسمح للترجمة المحسنة للبروتينات تستجيب للضغط. في أديتيعلى المكونات الأساسية، مثل المجمعات الترجمة الأولية المتوقفة، سغس تحتوي على عدد كبير من البروتينات الأخرى وجزيئات الإشارة. العيوب في تشكيل سغ يمكن أن يضعف التكيف الخلوي إلى الإجهاد، وبالتالي يمكن أن تعزز موت الخلايا. وقد ربطت سغس والحبيبات التي تحتوي على الحمض النووي الريبي مماثلة لعدد من الأمراض البشرية، بما في ذلك الاضطرابات العصبية والسرطان، مما أدى إلى الاهتمام الأخير في تصنيف وتعريف الأنواع الفرعية الحبيبية الحمض النووي الريبي. يصف هذا البروتوكول فحوصات لتوصيف وتحديد سغس الثدييات.

البؤر الناجم عن الإجهاد ليست بالضرورة سغس. وتصنف سغس على أنها بؤر السيتوبلازمية التي تحتوي على مرناس، عوامل بدء الترجمة، والبروتينات ملزمة رنا وتكون في حالة توازن مع الترجمة النشطة. يمكن استخدام البروتوكول أعلاه كقالب لتوصيف ما إذا كان الإجهاد معي...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules at JoVE.com

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

حبيبات الإجهاد (سغس) هي الهياكل السيتوبلازمية غير الغشائية التي تشكل في الخلايا المعرضة لمجموعة متنوعة من الضغوط. سغس تحتوي على مرناس، والبروتينات ملزم رنا، الوحدات الفرعية الريباسي الصغيرة، العوامل المرتبطة الترجمة، والبروتينات خلية إشارة مختلفة. يصف هذا البروتوكول سير العمل الذي يستخدم العديد من النهج التجريبية للكشف عن، وتحديد، وتحديد الكميات سغس حسن النية .

طرق لتصنيف البؤر السيتوبلازمية كما حبيبات الإجهاد الثدييات

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Trypsinizing Subculturing وخلايا الثدييات

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

الكمي بؤر γH2AX في الاستجابة للإشعاع المؤين

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

الكميات بؤر γH2AX في عينات الأنسجة

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

تفعيل موت الخلايا المبرمج من قبل Microinjection هيولي من السيتوكروم ج</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

تصور G3BP الإجهاد حبيبات حيوية في الخلايا الأولية لايف

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

تحفيز حشوية DNA الاستشعار عن مسارات<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

طرق لتقييم التحت خلوية من المقصورات في العضلات<em&gt; C. ايليجانس</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

المذنب الفحص كتدبير غير مباشر من الجهازية الاكسدة

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...