Name: methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules
Uploaded: 2017-05-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules at JoVE.com

Vi takker medlemmer af Ivanov og Anderson labs for deres nyttige diskussion og feedback på dette manuskript. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health [GM111700 og CA168872 til PA, NS094918 til PI], National Science Center i Polen [bevilge UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 til WS]. WS anerkender også ministeriet for videnskab og videregående uddannelse i Polen (Mobility Plus Program) og den polsk-amerikanske Fulbright-kommission for deres økonomiske støtte til sin forskning i USA.

1. Cellpræparation <ol><li> Tilføj autoklaverede dækglas til 12 brønde i en 24-brønds plade, som angivet i figur 1A ; Dette kan gøres ved hjælp af en steril Pasteur pipette fastgjort til et vakuum for at hente hver dæksel. Tryk forsigtigt dækslet på siden af ​​brønden for at frigøre sugningen, så dækslet falder i brønden. </li><li> Plade 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) osteosarkomceller pr. Brønd ved et slutvolumen på 500 μl medium. Flyt pladen side til side og op og ned flere ...

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Yamasaki, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+mRNA+translation+during+stress.">Reprogramming mRNA translation during stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).</li><li>Buchan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNP+granules:+Assembly,+function,+and+connections+with+disease.">mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease.</a> RNA Biol. 11 (8), (2014).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+ternary+complex+(eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules.">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li><li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+and+cell+signaling:+more+than+just+a+passing+phase?.">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase?.</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+shuttling+of+TIA-1+accompanies+the+recruitment+of+mRNA+to+mammalian+stress+granules.">Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).</li><li>Bley, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+are+dispensable+for+mRNA+stabilization+during+cellular+stress.">Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 43 (4), e26 (2015).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP-Caprin1-USP10+complexes+mediate+stress+granule+condensation+and+associate+with+40S+subunits.">G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits.</a> J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).</li><li>Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+mammalian+stress+granule+dynamics.">Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics.</a> J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules,+P-bodies+and+cancer.">Stress granules, P-bodies and cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).</li><li>Aulas, A., Van de Velde, ., C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+stress+granule+dynamics+driven+by+TDP-43+and+FUS:+a+link+to+pathological+inclusions+in+ALS?.">Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS?.</a> Front Cell Neurosci. 9, 423 (2015).</li><li>Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulatory+networks+in+immunity.">Post-transcriptional regulatory networks in immunity.</a> Immunol Rev. 253 (1), 253-272 (2013).</li><li>Wolozin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+protein+aggregation+run+amuck:+stress+granules+and+the+genesis+of+neurodegenerative+disease.">Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease.</a> Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).</li><li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+stress+granules+and+P-bodies+during+RNA+virus+infection.">Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).</li><li>Somasekharan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YB-1+regulates+stress+granule+formation+and+tumor+progression+by+translationally+activating+G3BP1.">YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1.</a> J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).</li><li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib,+a+multikinase+inhibitor,+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells.">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. , (2015).</li><li>Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules.">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell Int. 10, 12 (2010).</li><li>Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+ubiquitin-proteasome+system+induces+stress+granule+formation.">Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation.</a> Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).</li><li>Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+activates+HIF-1+to+regulate+vascular+radiosensitivity+in+tumors:+role+of+reoxygenation,+free+radicals,+and+stress+granules.">Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules.</a> Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).</li><li>Szaflarski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vinca+alkaloid+drugs+promote+stress-induced+translational+repression+and+stress+granule+formation.">Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation.</a> Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).</li><li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1.">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li><li>Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+TIA-1+and+TIAR+link+the+phosphorylation+of+eIF-2+alpha+to+the+assembly+of+mammalian+stress+granules.">RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li><li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).</li><li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+method+for+mapping+genes+on+Drosophila+polytene+chromosomes.">Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+characterization+of+stress+granules+in+virus+infected+cells.">Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells.</a> Methods. 90, 57-64 (2015).</li><li>David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emetine+optimally+facilitates+nascent+chain+puromycylation+and+potentiates+the+ribopuromycylation+method+(RPM)+applied+to+inert+cells.">Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells.</a> Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).</li><li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+visualization+and+dynamics+of+newly+synthesized+proteins+in+rat+hippocampal+neurons.">In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).</li><li>Ruggieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+oscillation+of+translation+and+stress+granule+formation+mark+the+cellular+response+to+virus+infection.">Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).</li><li>Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+contribute+to+alpha-globin+homeostasis+in+differentiating+erythroid+cells.">Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).</li><li>Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+RNAi+screen+links+O-GlcNAc+modification+of+ribosomal+proteins+to+stress+granule+and+processing+body+assembly.">A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly.</a> Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).</li><li>Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+regulated+by+arsenate+and+arsenite.">Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite.</a> Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).</li><li>Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+binding+to+proteins.">Arsenic binding to proteins.</a> Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).</li><li>McDonald, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+(TDP-43)+regulates+stress+granule+dynamics+via+differential+regulation+of+G3BP+and+TIA-1.">TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1.</a> Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).</li><li>Aulas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP1+promotes+stress-induced+RNA+granule+interactions+to+preserve+polyadenylated+mRNA.">G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA.</a> J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).</li><li>Martin, S., Tazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+G3BP+stress+granules+dynamics+in+live+primary+cells.">Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li><li>Wippich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+specificity+kinase+DYRK3+couples+stress+granule+condensation/dissolution+to+mTORC1+signaling.">Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling.</a> Cell. 152 (4), 791-805 (2013).</li></ol>

Som det fremgår af immunhistologiske studier i flere sygdomme, fører kronisk stress til dannelsen af ​​forskellige intracellulære foci. For eksempel er de fleste neurodegenerative sygdomme præget af intracellulære aggregater af uopløselige proteiner. Tilstedeværelsen af ​​SG-associerede proteiner i sådanne aggregater er ofte grundlaget for at konkludere, at sådanne foci er SG&#39;er. En lignende konklusion er også tegnet, når SG markør-positive cytoplasmiske foci observeres i celler behandlet med nye...

Celler anvender mange mekanismer til at reagere på stress. Nogle svar forekommer på post-transkriptionelt niveau og involverer regulering af mRNA-oversættelse og / eller stabilitet 1 , 2 . Stressmoduleret mRNA-translationsarrest og nedbrydning er forbundet med dannelsen af ​​specifikke ikke-membrancellulære foci, den mest velkendte karakteristiske er Stress Granules (SGs) 3 . SG&#39;er er cytoplasmatiske foci, der koncentrerer ikke-translaterende mRNP&#39;er i translationelt-arresterede celler, som reagerer på stress ( f.eks. Oxidation, varmchok, næringsstov og virusinfektion) 4 . Foruden ikke-translaterende mRNA&#39;er indeholder SG&#39;er translationsinitieringsfaktorer, RNA-bindende proteiner og forskellige signaleringsproteiner 5 . SG&#39;er er biomarkører af inhiberet proteinoversættelse og ændret RNA-metabolisme og er blevet bundet til celleoverlevelse og apoptose, signalvejeS og nukleare processer 5 . SG&#39;er er dynamiske enheder, og deres dannelse er tæt forbundet med status for cellulær oversættelse 6 . På trods af deres tilsyneladende solide udseende byder de fleste SG proteinkomponenter hurtigt ind og ud, med en opholdstid på sekunder. Mens SG&#39;er vedvarer i minutter til timer, er de fleste af deres komponenter i hurtig flux. Inhiberingen af ​​translationsinitiering og den deraf følgende disassembling af translatoriske polysomer fremmer dannelsen af ​​SG&#39;er; SG&#39;er er således i ligevægt med oversættelse af polysomer. Denne polysom ​​/ SG-ligevægt er nøglen til at skelne bona fide SG&#39;er fra andre stress-inducerede foci 6 , 7 . Arresterende translationsinitiering indebærer omdannelse af translation-kompetente præ-initieringskomplekser, der indeholder mRNA, translationsinitieringsfaktorer (eIF) og 40S ribosomale underenheder (s<html> O-kaldte 48S-komplekser) til translationelt stallede komplekser (såkaldte 48S * komplekser), som kan samle sig i SG 4 , 6 . SG&#39;er fremmes ved translationel anholdelse i to forskellige trin opstrøms for 48S kompleksdannelse: interferens med funktionerne af det cap-bindende eIF4F-kompleks ( f.eks. Målretning af dets eIF4A-underenhed) eller phosphorylering af a-underenheden af ​​translationsinitieringsfaktor eIF2 medieret af en Eller flere af de fire eIF2-kinaser. Tilstedeværelsen af ​​stablede 48S-komplekser ( dvs. 40S ribosomale underenheder og udvalgte translationsinitieringsfaktorer) er et kendetegn for SG 8 , 9 . SG&#39;er har været forbundet med forskellige patologiske tilstande, såsom virale infektioner, neurodegeneration, autoimmunitet og kræft 3 , 10 , 11 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . Muterede former af flere SG-komponenter er forbundet med neurodegenerative sygdomme ( fx amyotrofisk lateralsklerose), hvori neuroner viser intracellulære patologiske indeslutninger, der kan spille aktive roller i neuronal død 13 . Nogle vira kapsler SG komponenter til at hæmme SG dannelse og forøge viral replikation 14 . Nylige undersøgelser forbinder også SG&#39;er med cancer 15 og kræftcelleoverlevelse under kemo- og strålebehandlinger 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Mens sådanne resultater har stimuleret stor interesse for SG biologi, mangler mange af de offentliggjorte rapporter vigtige kontroller for at skelne dannelsen af bona fide SG&#39;er fra andre stress-inducerede foci. SG&#39;er blev oprindeligt beskrevet som ikke-membraniske cytoplasmiske foci sammensat af udvalgte mRNA-bindende proteiner (RBP&#39;er), herunder T-celle ntracellulært antigen 1 (TIA-1) og Poly-A-bindingsprotein (PABP); Translation initiation factors; Polyadenyleret mRNA; Og små ribosomale underenheder 4 , 6 , 21 , 22 . Traditionelt er deres sammensætning blevet bestemt ved teknikker såsom immunfarvning og det ektopiske udtryk af fluorescensmærkede proteiner 23 , 24 . På grund af deres højdynamiske karakter forbliver immunokalokalisering af SG-proteiner og / eller mRNA&#39;er den definerende metode til detektering af SGs 23 , 24 . Til dato er mange RBP&#39;er og andre proteiner (over 120 forskellige proteiner) beskrevet som SG-bestanddele 11 . Så mange SG-lokaliserede proteiner ændrer deres lokalisering både på en stressafhængig og en selvstændig måde og kan akkumulere i andre intracellulære rum og foci. Det er vigtigt at vælge korrekte SG markører og at anvende funktionelle kriterier for at skelne SG&#39;er fra andre typer stressfremkaldt brændpunkter. Bona fide SG&#39;er indeholder mRNA, translationsinitieringsfaktorer og små ribosomale underenheder og er i dynamisk ligevægt med translation. Denne simple workflow er designet til at bestemme, om stress-inducerede foci er bona fide SG&#39;er. Denne arbejdsgang indeholder flere eksperimentelle tilgange ved hjælp af U2OS-celler, celler, der almindeligvis anvendes til at studere SG&#39;er. Disse celler er ideelle, da de har en stor cytoplasma, er relativt flade og fastgøres stærkt til glasdæksler. Andre celletyper kan bruges til at studere SG&#39;er, men det er vigtigt at være opmærksom på, at forskelle i timing, lægemiddelkoncentration og overflod af SG-nucleerende proteiner kan ændre kinetikken og compomensætning. Derudover reagerer nogle celler på paraformaldehydfiksering ved dannelse af celleoverflader, hvilket giver et ruflet udseende, der forårsager punktatlokalisering af nogle SG-markører; Uden omhyggelig analyse kan disse kategoriseres som SG&#39;er. Dette understreger nødvendigheden af ​​at vurdere alle kriterier, der er nødvendige for at identificere stress-inducerede foci som bona fide SG&#39;er. Vinorelbine (VRB), en kræftbehandling, der fremmer SGS 20 , samt Sodium Arsenite (SA), en robust og velkarakteriseret SG inducer, anvendes som stress for forsøgene i denne protokol. Canoniske SG&#39;er indeholder flere SG markører (både proteiner og mRNA&#39;er), som kolokaliseres i cytoplasmatiske foci. Denne protokol anvender både immunofluorescens og fluorescens in situ hybridisering (FISH) for at detektere lokalisering af proteinmarkører og polyadenyleret mRNA 22 . Kort sagt bruger indirekte immunofluorescens antistoffer ( dvs.e. Primære antistoffer), der er specifikke for et givet protein for at detektere det i cellen. Derefter genkender sekundære antistoffer (normalt arterespecifikke), der er knyttet til fluorochromer, det primære antistof og afslører målproteinlokaliseringen. Fluorescerende mikroskopi bruges til at detektere det lokaliserede signal i cellen. Ved anvendelse af antistoffer produceret i forskellige arter og påvisning af forskellige farvede sekundære antistoffer gør det muligt at påvise kolokalisering af flere antistoffer, hvilket indikerer, at deres proteinmål er fundet på samme sted 23 . Det er vigtigt at markere markører, der er blevet verificeret for at kolocalisere på bona fide SG&#39;er. FISH bruger en mærket probe, der baserer par til en specifik RNA- eller DNA-sekvens 25 . For at detektere mRNA bruger denne protokol en biotinyleret oligo (dT) 40 probe, som hybridiserer (eller basepar) til polyA-halen af ​​mRNA ( dvs. polyA FISH). Den biotinylerede probe detekteres derefter under anvendelse af fluorescenskonjugeret streptavidin, da streptavidin har en høj affinitet for biotin. Ved vurderingen af ​​SG&#39;er er det vigtigt at forbinde polyA FISH med immunofluorescens, der registrerer en SG-markør, som i bona fide SG&#39;er, skal de to signaler kolokalisere. Ved anvendelse af denne protokol vurderes kolokalisering på flere måder. I et flerkanalsbillede ( dvs. RGB: rødt, grønt og blåt) vil kolokalisering ændre farven på det overlappede signal ( fx colocalized rød og grøn vises gul) 23 . Derudover kvantificeres kolokalisering grafisk ved anvendelse af linjeskanningsanalyse, hvor intensiteten af ​​hver af farve måles på tværs af en given linje 8 , 20 . Denne protokol beskriver to linjens scanningsanalyseprocedurer ved hjælp af ImageJ 26 . En procedure er manuel og går igennem hele processen, hviDen anden bruger en makro eller et simpelt program, der automatiserer de manuelle trin. Det er vigtigt at gennemgå det manuelle program for at forstå makroproceduren. SG&#39;er danner i celler, hvor oversættelse er undertrykt; Derfor skal celler med SG&#39;er vise nedsat niveau af global translation sammenlignet med ubehandlede celler. Eksperimentelt anvendes ribopuromycylering. Puromycin og emetin tilsættes til celler i en kort varighed forud for fiksering, hvilket tillader puromycinet at inkorporere i aktivt dannende polypeptider, hvilket forårsager opsigelse 27 , 28 . Behandling med emetin er nødvendig for at forhindre geninitiering 29 . Puromycin kan derefter detekteres ved anvendelse af anti-puromycin-antistof, hvilket giver et øjebliksbillede af aktiv oversættelse. Denne metode anvendes, fordi den er hurtig, kræver ikke forsvulmer med et medium, der mangler en bestemt aminosyre (og potentielt forspænder cellerne) og afslørerSubcellulær lokalisering af proteinoversættelse. Andre metoder, især ved anvendelse af modificerede aminosyreanaloger, såsom methioninanalog-L-azidohomoalain (AHA), kombineret med &quot;click-it&quot; -kemi 30 , er blevet anvendt til at vise, at celler indeholdende SG&#39;er udviser meget lavere oversættelse end naboceller 31 . Denne teknik kræver imidlertid methionin-sultning efterfulgt af pulsmærkning i 15-30 minutter. Methionin-sulten udgør en ekstra stress, mens den lange mærkningstid ( dvs. 15-30 minutter) resulterer i måling af kumulativ snarere end løbende oversættelse og også gør det muligt for de nyligt syntetiserede proteiner at flytte fra deres syntese til deres endelige destination inden for celle. I modsætning hertil er ribopuromycylering meget hurtigere og er kompatibel med ethvert medium, såsom det glucosefrie medium, der anvendes til at inducere SG&#39;er via glucosesultation. Canonical SG&#39;er er i dynamisk ligevægtMed aktivt at oversætte polysomer. Dette kan vurderes eksperimentelt ved at behandle prøver med de lægemidler, der stabiliserer eller destabiliserer polysomer, og dermed tipper balancen mellem SG&#39;er og polysomer 23 . Cycloheximid (eller emetin, som opfører sig tilsvarende) blokerer forlængelse ved &quot;frysning&quot; af ribosomer på mRNA, hvilket således nedsætter puljen af ​​tilgængelige ikke-polysomale mRNP&#39;er, der er i stand til at danne SG&#39;er. Eksperimentelt kan dette anvendes på to måder: ved at tilføje cycloheximid (eller emetin) før stress for at forhindre dannelse af SG eller ved at tilføje cycloheximid (eller emetin) efter at SG&#39;erne har dannet, selv uden at fjerne stressemidlet, der forårsager SG-demontering, som standset Præinitiationskomplekser indføres langsomt i polysomfraktionen. I modsætning hertil forårsager puromycin for tidlig termination og fremmer polysom-demontering, hvilket øger puljen af ​​initierende mRNA&#39;er, der er i stand til at samle i SG&#39;er. Eksperimentelt øger puromycinbehandling antallet af SG&#39;er eller sænker thresholetD, hvor de danner som svar på graderet stress eller lægemiddeldosering. Ved vurderingen af ​​virkningen af ​​puromycin er det vigtigt at anvende et sub-maksimalt niveau af lægemidlet af interesse, idet puromycin forventes at forøge lægemidlets virkning og forøge antallet af celler, der udviser SG&#39;er - dette kan ikke ske, hvis stoffet / Stress forårsager SG&#39;er i 100% af cellerne i begyndelsen. Dette modsætter sig cycloheximidbehandling, som adskiller SG&#39;er og fungerer bedst, når ~ 95% af cellerne oprindeligt viser SG&#39;er, så det størst mulige fald kan observeres og kvantificeres nøjagtigt. Denne protokol tilvejebringer en ramme for at studere SG&#39;er i mammale celler. Metoder omfatter: (1) immunfluorescerende farvning og ImageJ analyse til vurdering af kolokaliseringen af ​​de klassiske SG-associerede markører eIF4G, eIF3b og Ras GTPase-aktiverende proteinbindende protein 1 (G3BP1) i formodede SG&#39;er; (2) oligo (dT) fluorescens in situ hybridisering (polyA FISH) til påvisning af polyadenyleret mRNA; (3) cycloheximid og puromycinbehandling til bestemmelse af, om stress-inducerede foci er i dynamisk ligevægt med polysomer; Og (4) ribopuromycylering for at vurdere translationsstatus for celler indeholdende formodede SG&#39;er. Sammen kan disse analyser bestemme, om stress-inducerede foci kan klassificeres som bona fide SG&#39;er.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174;HTB-96&#8482;</td>
			<td>- commonly written as &#34;U2OS&#34; 
			- culture at 37 &#176;C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>- abbreviated DMEM 
			- contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red 
			- supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin 
			- prewarm prior drug(s) dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td>- abbreviated FBS 
			- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline streptomycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tissues</td>
			<td>KIMTECH SCIENCE</td>
			<td>34120</td>
			<td>- commonly called &#34;kimwipes&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>- autoclaved before used 
			- keep sterile in the tissue culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium (meta)arsenite &#8805;90%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7400-100G</td>
			<td>- commonly called sodium arsenite and abbreviated SA 
			- dissolution in water at 1 M concentration, then dilute to 100 &#181;M as a working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>TSZ CHEM</td>
			<td>RS055</td>
			<td>- abbreviated VRB 
			- dissolve in water to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9620</td>
			<td>- used to assess translation level (ribopuromycylation) 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emetine dihydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2375</td>
			<td>- used in combination with puro to assess general translation level 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859</td>
			<td>- abbreviated CHX 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Lonza / VWR</td>
			<td>95042-486</td>
			<td>- abbreviated PBS 
			- wash buffer for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>- make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved 
			- aliquots can be stored at - 20 &#176;C for several months 
			- hazardous, use ventilation 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS</td>
			<td>BDH / VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td>- pre-chilled to -20&#176;C before use 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td>- abbreviated NHS 
			- dilute to 5% in PBS 
			- add sodium azide for storage at 4&#176;C 
			- blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td>
			<td>Decon Labs / VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>- dilute to 70% with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-81940</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- use at 1/100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti eIF4G antibody (H-300)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-11373</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti eIF3&#951; (N-20) antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-16377</td>
			<td>- eIF3&#951; is also known as eIF3b 
			- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti puromycin 12D10 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE343</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-225-150</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/2500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td>- incubate with secondary antibodies 
			-stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light 
			- Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>016-160-084</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions, then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-(dT)40x probe biotinilated</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>/</td>
			<td>- reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20&#176;C 
			- dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use 
			- custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridation box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>- make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom 
			- prewarm the box prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x SSC buffer</td>
			<td>Thermo fisher Ambion</td>
			<td>AM9763</td>
			<td>- dilute to 2X SSC using RNase Free water (DEPC treated) 
			- store at room temperature 
			- wash buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfectHybPlus Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7033-50ml</td>
			<td>- block and probe incubation buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide mounting media</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>- mix 5 g of &#8220;cold-soluble&#8221; poly(vinyl alcohol) in 20 ml of PBS 
			- mix by sonication, followed by stirring overnight at RT 
			- Add 5 ml of glycerol and 0.2 ml of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT 
			- centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet 
			- aliquot viscous liquid, long-term storage at -20&#176;C, 1 week at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>- usually referred as &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-8136-250G</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100ML</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td>- preservative agent for blocking solution and vinol 
			- make a 20 % dilution in water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules

Celler udfordres ofte af pludselige miljømæssige ændringer. Stress Granuler (SG&#39;er), cytoplasmatiske ribonukleoproteinkomplekser, der dannes i celler udsat for stressbetingelser, indgår i forskellige aspekter af celle metabolisme og overlevelse. SG&#39;er modulerer cellulære signalveje, post-transkriptionelle genekspression og stressresponsprogrammer. Dannelsen af ​​disse mRNA-holdige granulater er direkte forbundet med cellulær translation. SG-samling udløses af inhiberet translationsinitiering, og SG-disassembling fremmes ved translationaktivering eller ved inhiberet translationsforlængelse. Dette forhold fremhæves yderligere af SG-sammensætningen. Core SG-komponenter er forsinket translation pre-initieringskomplekser, mRNA og udvalgte RNA-bindende proteiner (RBP&#39;er). Formålet med SG-samling er at bevare cellulær energi ved at sekvestrere translationally stalled housekeeping mRNAs, hvilket tillader den forbedrede translation af stress-responsive proteiner. I additiPå kernekomponenterne, såsom forældede translationsforinitiationskomplekser, indeholder SG&#39;er en overflod af andre proteiner og signalmolekyler. Fejl i SG-dannelse kan forringe cellulær tilpasning til stress og kan således fremme celledød. SG&#39;er og lignende RNA-indeholdende granulater er blevet bundet til et antal humane sygdomme, herunder neurodegenerative lidelser og cancer, hvilket fører til den nylige interesse i at klassificere og definere RNA-granuletsubtyper. Denne protokol beskriver analyser for at karakterisere og kvantificere pattedyrs-SG&#39;er.

Stressinducerede foci er ikke nødvendigvis SG&#39;er. SG&#39;er klassificeres som cytoplasmatiske foci, der indeholder mRNA&#39;er, translationsinitieringsfaktorer og RNA-bindende proteiner og er i ligevægt med aktiv translation. Ovennævnte protokol kan anvendes som en skabelon for at karakterisere, om en given stress inducerer bona fide SG&#39;er. SG&#39;er kolokalisere med andre kendte SG markører, herunder båd...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules at JoVE.com

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Stress Granuler (SG&#39;er) er ikke-membraniske cytoplasmatiske strukturer, der dannes i celler udsat for en række stress. SG&#39;er indeholder mRNA&#39;er, RNA-bindende proteiner, små ribosomale underenheder, translationsrelaterede faktorer og forskellige cellesignalproteiner. Denne protokol beskriver en workflow, der bruger flere eksperimentelle metoder til at detektere, karakterisere og kvantificere bona fide SG&#39;er.

Metoder til klassificering af cytoplasmatiske foci som spædbørn

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Visualisering af G3BP Stress Granulat Dynamics i Live primære celler

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulering af Cytoplasmatiske DNA Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Metoder til at vurdere subcellulære afsnit af muskler i<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Comet assay som et indirekte mål for Systemisk oxidativt stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...