Name: methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules
Uploaded: 2017-05-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules at JoVE.com

Wij bedanken leden van de Ivanov en Anderson labs voor hun nuttige discussie en feedback over dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health [GM111700 en CA168872 naar PA, NS094918 naar PI], het Nationaal Wetenschapscentrum in Polen [verleen UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 naar WS]. WS erkent ook het Ministerie van Wetenschappen en Hoger Onderwijs in Polen (Mobility Plus Programma) en de Pools-Amerikaanse Fulbright Commissie voor hun financiële steun van zijn onderzoek in de VS.

1. Celbereiding <ol><li> Voeg autoklaafde deklagen toe aan 12 putjes van een 24-putjesplaat, zoals aangegeven in figuur 1A ; Dit kan gedaan worden met behulp van een steriele Pasteur pipette die aan een vacuüm is bevestigd om elke deksel op te halen. Trek de deksel aan de zijkant van de put voorzichtig aan om de zuiging los te laten, zodat de deklaag in de put kan vallen. </li><li> Plaat 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) osteosarcomacellen per put bij een eindvolume van 500 μl medium. Verplaats de p...

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Yamasaki, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+mRNA+translation+during+stress.">Reprogramming mRNA translation during stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).</li><li>Buchan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNP+granules:+Assembly,+function,+and+connections+with+disease.">mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease.</a> RNA Biol. 11 (8), (2014).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+ternary+complex+(eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules.">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li><li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+and+cell+signaling:+more+than+just+a+passing+phase?.">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase?.</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+shuttling+of+TIA-1+accompanies+the+recruitment+of+mRNA+to+mammalian+stress+granules.">Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).</li><li>Bley, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+are+dispensable+for+mRNA+stabilization+during+cellular+stress.">Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 43 (4), e26 (2015).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP-Caprin1-USP10+complexes+mediate+stress+granule+condensation+and+associate+with+40S+subunits.">G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits.</a> J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).</li><li>Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+mammalian+stress+granule+dynamics.">Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics.</a> J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules,+P-bodies+and+cancer.">Stress granules, P-bodies and cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).</li><li>Aulas, A., Van de Velde, ., C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+stress+granule+dynamics+driven+by+TDP-43+and+FUS:+a+link+to+pathological+inclusions+in+ALS?.">Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS?.</a> Front Cell Neurosci. 9, 423 (2015).</li><li>Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulatory+networks+in+immunity.">Post-transcriptional regulatory networks in immunity.</a> Immunol Rev. 253 (1), 253-272 (2013).</li><li>Wolozin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+protein+aggregation+run+amuck:+stress+granules+and+the+genesis+of+neurodegenerative+disease.">Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease.</a> Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).</li><li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+stress+granules+and+P-bodies+during+RNA+virus+infection.">Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).</li><li>Somasekharan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YB-1+regulates+stress+granule+formation+and+tumor+progression+by+translationally+activating+G3BP1.">YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1.</a> J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).</li><li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib,+a+multikinase+inhibitor,+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells.">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. , (2015).</li><li>Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules.">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell Int. 10, 12 (2010).</li><li>Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+ubiquitin-proteasome+system+induces+stress+granule+formation.">Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation.</a> Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).</li><li>Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+activates+HIF-1+to+regulate+vascular+radiosensitivity+in+tumors:+role+of+reoxygenation,+free+radicals,+and+stress+granules.">Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules.</a> Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).</li><li>Szaflarski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vinca+alkaloid+drugs+promote+stress-induced+translational+repression+and+stress+granule+formation.">Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation.</a> Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).</li><li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1.">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li><li>Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+TIA-1+and+TIAR+link+the+phosphorylation+of+eIF-2+alpha+to+the+assembly+of+mammalian+stress+granules.">RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li><li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).</li><li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+method+for+mapping+genes+on+Drosophila+polytene+chromosomes.">Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+characterization+of+stress+granules+in+virus+infected+cells.">Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells.</a> Methods. 90, 57-64 (2015).</li><li>David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emetine+optimally+facilitates+nascent+chain+puromycylation+and+potentiates+the+ribopuromycylation+method+(RPM)+applied+to+inert+cells.">Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells.</a> Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).</li><li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+visualization+and+dynamics+of+newly+synthesized+proteins+in+rat+hippocampal+neurons.">In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).</li><li>Ruggieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+oscillation+of+translation+and+stress+granule+formation+mark+the+cellular+response+to+virus+infection.">Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).</li><li>Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+contribute+to+alpha-globin+homeostasis+in+differentiating+erythroid+cells.">Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).</li><li>Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+RNAi+screen+links+O-GlcNAc+modification+of+ribosomal+proteins+to+stress+granule+and+processing+body+assembly.">A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly.</a> Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).</li><li>Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+regulated+by+arsenate+and+arsenite.">Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite.</a> Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).</li><li>Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+binding+to+proteins.">Arsenic binding to proteins.</a> Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).</li><li>McDonald, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+(TDP-43)+regulates+stress+granule+dynamics+via+differential+regulation+of+G3BP+and+TIA-1.">TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1.</a> Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).</li><li>Aulas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP1+promotes+stress-induced+RNA+granule+interactions+to+preserve+polyadenylated+mRNA.">G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA.</a> J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).</li><li>Martin, S., Tazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+G3BP+stress+granules+dynamics+in+live+primary+cells.">Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li><li>Wippich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+specificity+kinase+DYRK3+couples+stress+granule+condensation/dissolution+to+mTORC1+signaling.">Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling.</a> Cell. 152 (4), 791-805 (2013).</li></ol>

Zoals blijkt uit immunohistologische studies in meerdere ziekten, leidt chronische stress tot de vorming van verschillende intracellulaire foci. Bijvoorbeeld, de meeste neurodegeneratieve ziekten worden gekenmerkt door intracellulaire aggregaten van onoplosbare eiwitten. De aanwezigheid van SG-geassocieerde eiwitten in dergelijke aggregaten is vaak de basis om te concluderen dat dergelijke foci SG&#39;s zijn. Een soortgelijke conclusie wordt ook getekend wanneer SG-markering-positieve cytoplasmatische foci waargenomen w...

Cellen hebben veel mechanismen om te reageren op stress. Sommige reacties vinden plaats op het post-transcriptie niveau en betreffen het reguleren van mRNA translatie en / of stabiliteit 1 , 2 . Stress-gemoduleerde mRNA translatie-arrestatie en afbraak worden geassocieerd met de vorming van specifieke niet-membraancellulaire foci, de meest goed gekenmerkte Stress Granules (SGs) 3 . SG&#39;s zijn cytoplasmatische foci die nontranslaterende mRNP&#39;s concentreren op translationally-arrested cellen die reageren op stress ( bijv. Oxidatie, warmtechok, voedingshongersnood en virale infectie) 4 . Naast niet-translaterende mRNA&#39;s bevatten SG&#39;s vertaalinitiatieffactoren, RNA-bindende eiwitten en verschillende signalering eiwitten 5 . SG&#39;s zijn biomarkers van geremd eiwitvertaling en veranderd RNA-metabolisme en zijn gekoppeld aan celoverleving en apoptose, signaalwegS en nucleaire processen 5 . SG&#39;s zijn dynamische entiteiten, en hun vorming is nauw verbonden met de status van cellulaire vertaling 6 . Ondanks hun schijnbaar solide verschijning, schuiven de meeste SG-eiwitcomponenten snel in en uit, met een verblijftijd van seconden. Terwijl de SG&#39;s enkele minuten tot uren volhouden, zijn de meeste componenten in snelle flux. De remming van translatie-initiatie en de daaruit voortvloeiende demontage van translateerbare polysomen bevorderen de vorming van SG&#39;s; Dus, SG&#39;s zijn in evenwicht met het vertalen van polysomen. Dit polysoom / SG-evenwicht is de sleutel tot het onderscheiden van bona fide SG&#39;s van andere stress-geïnduceerde foci 6 , 7 . Het in stand houden van translatie-initiatie houdt in dat de omzetting van vertaalvaardige pre-initiatiecomplexen die mRNA, translatie-initiatieffactoren (eIF) en 40S ribosomale subeenheden bevatten (s<html> O-genaamde 48S complexen) in translationally stalled complexes (zogenaamde 48S * complexen) die kunnen samenvoegen in SGs 4 , 6 . SG&#39;s worden bevorderd door translatoire arrestatie in twee verschillende stappen stroomopwaarts van 48S complexe vorming: interferentie met de functies van het cap-binding eIF4F-complex ( bijv. Gericht op de eIF4A-subeenheid) of fosforylering van de a-subeenheid van translatie-initiatieffactor eIF2, gemedieerd door één Of meer van de vier eIF2 kinasen. De aanwezigheid van opgezette 48S complexen ( dwz 40S ribosomale subeenheden en geselecteerde translation initiatie factoren) is een kenmerk van SGs 8 , 9 . SG&#39;s zijn gekoppeld aan verschillende pathologische toestanden, zoals virale infecties, neurodegeneratie, auto-immuniteit en kanker 3 , 10 , 11 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . Gemuteerde vormen van verscheidene SG-componenten zijn geassocieerd met neurodegeneratieve ziekten ( bijv. Amyotrofische laterale sclerose) waarin neuronen intracellulaire pathologische inclusies laten zien die actieve rollen kunnen spelen bij de neuronale dood 13 . Sommige virussen kapen SG-componenten om SG-vorming te remmen en virale replicatie te verbeteren 14 . Recente studies koppelen ook SG&#39;s aan kanker 15 en het overleven van kankercel onder chemotherapie en radiotherapiebehandelingen 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Hoewel dergelijke bevindingen grote belangstelling hebben voor de SG-biologie, ontbreken veel van de gepubliceerde rapporten belangrijke controles om de vorming van bona fide SG&#39;s van andere stress-geïnduceerde foci te onderscheiden. SG&#39;s werden aanvankelijk beschreven als niet-membraan cytoplasmatische foci samengesteld uit geselecteerde mRNA-bindende eiwitten (RBP&#39;s), waaronder T-cel ntracellulaire antigeen 1 (TIA-1) en poly-A-bindend eiwit (PABP); Vertaling initiatief factoren; Polyadenyleerde mRNA; En kleine ribosomale subeenheden 4 , 6 , 21 , 22 . Traditioneel is hun samenstelling bepaald door technieken zoals immunostaining en de ectopische expressie van fluorescent gelabelde eiwitten 23 , 24 . Vanwege hun zeer dynamische aard blijft de immunolocalisatie van SG-eiwitten en / of mRNA&#39;s de bepalende methodologie voor het detecteren van SG&#39;s 23 , 24 . Tot op heden worden veel RBP&#39;s en andere eiwitten (meer dan 120 afzonderlijke eiwitten) beschreven als SG-componenten 11 . Zoveel SG-gelokaliseerde eiwitten veranderen hun lokalisatie op zowel stressafhankelijke als onafhankelijke wijze en kunnen zich ophopen bij andere intracellulaire compartimenten en foci. Het is belangrijk om juiste SG-markers te kiezen en functionele criteria te gebruiken om SG&#39;s te onderscheiden van andere soorten stress-geïnduceerde brandpunten. Bona fide SG&#39;s bevatten mRNA, translatie initiatief factoren en kleine ribosomale subeenheden en zijn in dynamisch evenwicht met vertaling. Deze eenvoudige workflow is ontworpen om te bepalen of stress-geïnduceerde foci bona fide SG&#39;s zijn. Deze workflow bevat verschillende experimentele benaderingen met behulp van U2OS-cellen, cellen die vaak gebruikt worden om SG&#39;s te studeren. Deze cellen zijn ideaal, omdat ze een groot cytoplasma hebben, zijn relatief vlak en hechten sterk aan glazen deklagen. Andere celtypen kunnen gebruikt worden om SG&#39;s te studeren, maar het is belangrijk om zich ervan bewust te zijn dat verschillen in timing, drugconcentratie en overvloed van SG-nucleerende eiwitten de kinetiek en het compo kunnen veranderensitie. Daarnaast reageren sommige cellen op paraformaldehydefixatie door het vormen van celoppervlakken te vormen, waardoor er een ruche verschijning is die de punctale lokalisatie van sommige SG markers veroorzaakt; Zonder zorgvuldige analyse kunnen deze worden gemeld als SG&#39;s. Dit wijst op de noodzaak om alle criteria die nodig zijn om stress-geïnduceerde foci te identificeren als bona fide SG&#39;s te beoordelen. Vinorelbine (VRB), een kankertherapeutisch die SGS 20 bevordert, alsmede Sodium Arsenite (SA), een robuuste en goed gekenmerkte SG-inducer, worden gebruikt als stress voor de experimenten in dit protocol. Canonische SG&#39;s bevatten meerdere SG markers (zowel eiwitten als mRNA&#39;s) die zich in cytoplasmatische foci colocaliseren. Dit protocol gebruikt zowel immunofluorescentie als fluorescentie in situ hybridisatie (FISH) om de lokalisatie van eiwitmarkers en polyadenyleerde mRNA 22 te detecteren. In het kort gebruikt indirecte immunofluorescentie antilichamen ( i.e. Primaire antilichamen) die specifiek zijn voor een bepaald eiwit om het in de cel te detecteren. Daarna herkennen secundaire antilichamen (meestal speciesspecifieke) die aan fluorochromen zijn gehecht het primaire antilichaam en onthullen de lokalisatie van de target eiwit. Fluorescerende microscopie wordt gebruikt om het gelokaliseerde signaal binnen de cel te detecteren. Door gebruik te maken van antilichamen die in verschillende soorten worden geproduceerd en ze te detecteren met anders gekleurde secundaire antilichamen, kan de detectie van de colocalisatie van meerdere antilichamen worden aangetoond, aangeeft dat hun eiwitdoelstellingen op dezelfde locatie gevonden worden 23 . Het is belangrijk om markers te selecteren die zijn geverifieerd om te colocaliseren bij bona fide SG&#39;s. FISH maakt gebruik van een gelabelde sonde die baseert op een specifieke RNA- of DNA-sequentie 25 . Om mRNA te detecteren, gebruikt dit protocol een biotinyleerde oligo (dT) 40 probe die hybridiseert (of basisparen) aan de polyA-staart van mRNA ( dat wil zeggen polyA FISH). De biotinyleerde probe wordt dan gedetecteerd met behulp van fluorescent geconjugeerde streptavidine, aangezien streptavidine een hoge affiniteit voor biotine heeft. Bij het beoordelen van SG&#39;s is het belangrijk om polyA FISH te koppelen aan immunofluorescentie die een SG-marker detecteert, zoals bij bona fide SG&#39;s, de twee signalen moeten colocaliseren. Met behulp van dit protocol wordt colocalisatie op meerdere manieren beoordeeld. In een multi-kanaal ( dwz RGB: rood, groen en blauw), zal colocalisatie de kleur van het overlappende signaal wijzigen ( bijv. Gekolokaliseerd rood en groen verschijnen geel) 23 . Daarnaast wordt colocalisatie grafisch gekwantificeerd met behulp van line scan analyse, waarbij de intensiteit van elke kleur wordt gemeten over een bepaalde lijn 8 , 20 . Dit protocol beschrijft twee line scan analyse procedures met behulp van ImageJ 26 . Eén procedure is handmatig en gaat door het hele procesDe andere maakt gebruik van een macro, of een eenvoudig programma dat de handmatige stappen automatiseert. Het is belangrijk om door de handleiding te gaan om de macroprocedure te begrijpen. SG&#39;s vormen in cellen waar de vertaling wordt onderdrukt; Daarom moeten cellen met SG&#39;s verlaagde niveaus van globale vertaling vertonen in vergelijking met onbehandelde cellen. Experimenteel wordt ribopuromycylering gebruikt. Puromycine en emetine worden gedurende een korte duur voorafgaand aan fixatie aan cellen toegevoegd, waardoor de puromycine in actieve vormende polypeptiden kan worden opgenomen, waardoor terminatie 27 , 28 wordt veroorzaakt. Behandeling met emetine is nodig om herinitatie te voorkomen 29 . Puromycine kan dan worden gedetecteerd met anti-puromycine antilichaam, waardoor een momentopname van actieve vertaling wordt gegeven. Deze methode wordt gebruikt omdat het snel is, hoeft niet te verhongeren met een medium dat geen bepaald aminozuur heeft (en mogelijk de cellen voorspannen) en onthult deSubcellulaire lokalisatie van eiwitvertaling. Andere methoden, met name door gebruik te maken van gemodificeerde aminozuuranaloga, zoals het methionine-analoog L-azidohomoalaïne (AHA), gekoppeld aan &quot;click-it&quot; chemie 30 , zijn gebruikt om aan te tonen dat cellen die SG&#39;s bevatten, veel lagere vertaling vertonen dan naburige cellen 31 . Deze techniek vereist echter methionine-hongersnood gevolgd door puls-etikettering gedurende 15-30 minuten. Methionine-hongersnood vormt een extra stress, terwijl de lange etiketteringstijd ( dwz 15-30 minuten) resulteert in de meting van cumulatieve in plaats van lopende vertaling, en laat ook de nieuw gesynthetiseerde eiwitten van hun syntheseplaats verplaatsen naar hun uiteindelijke bestemming binnen de cel. Daarentegen is ribopuromycylering veel sneller en is verenigbaar met elk medium, zoals het glucosevrije medium dat wordt gebruikt om SG&#39;s te induceren via glucosestoornis. Canonische SG&#39;s zijn in dynamisch evenwichtMet het actief vertalen van polysomen. Dit kan experimenteel worden beoordeeld door monsters te behandelen met de geneesmiddelen die polysomen stabiliseren of destabiliseren, waardoor het evenwicht tussen SG en polysomen 23 wordt afgebroken. Cycloheximide (of emetine, die zich op dezelfde manier gedraagt) blokkeert verlenging door &quot;bevriezing&quot; van ribosomen op mRNA, waardoor het pool van beschikbare niet-polysomale mRNP&#39;s die SG&#39;s kunnen vormen, verminderen. Experimenteel kan dit op twee manieren worden gebruikt: door het toevoegen van cycloheximide (of emetine) vóór stress om SG-vorming te voorkomen of door cycloheximide (of emetine) toe te voegen nadat de SG&#39;s hebben gevormd, zelfs zonder het stressmiddel te verwijderen, waardoor SG-demontage wordt veroorzaakt Preinitiatie complexen worden langzaam toegelaten in de polysoomfractie. In tegenstelling hiermee veroorzaakt puromycine vroegtijdige beëindiging en bevordert polysoom demontage, waardoor het pool van initiërende mRNA&#39;s die in staat zijn om in SG&#39;s te assembleren, verhogen. Experimenteel verhoogt de behandeling met puromycine het aantal SG&#39;s of verlaagt de thresolD waarbij ze vormen in reactie op gegradeerde stress of drugs dosering. Bij het beoordelen van het effect van puromycine is het belangrijk om een ​​submaximaal niveau van het geneesmiddel van belang te gebruiken, aangezien puromycine naar verwachting het effect van het geneesmiddel verhoogt en het percentage cellen dat SG&#39;s toont, verhoogt - dit kan niet optreden als het geneesmiddel / Stress veroorzaakt in eerste instantie SG&#39;s in 100% van de cellen. Dit komt in tegenstelling tot cycloheximide behandeling, die SG&#39;s demontert en het beste werkt wanneer ~ 95% van de cellen SG&#39;s eerst laat zien, zodat de grootste mogelijke daling waargenomen en nauwkeurig gekwantificeerd kan worden. Dit protocol biedt een kader om SG&#39;s in zoogdiercellen te bestuderen. Methoden omvatten: (1) immunofluorescente kleuring en ImageJ analyse om de colocalisatie van de klassieke SG-geassocieerde markers eIF4G, eIF3b en Ras GTPase-activerend eiwitbindend eiwit 1 (G3BP1) in vermoedelijke SG&#39;s te beoordelen; (2) oligo (dT) fluorescentie in situ hybridisatie (polyA FISH) om polyadenyleerde mRNA te detecteren; (3) cycloheximide en puromycine behandeling om te bepalen of stress-geïnduceerde foci in dynamisch evenwicht met polysomen zijn; En (4) ribopuromycylering om de translatorische status van cellen die putatieve SG&#39;s bevatten te beoordelen. Samen kunnen deze analyses bepalen of stress-geïnduceerde foci kan worden ingedeeld als bona fide SG&#39;s.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174;HTB-96&#8482;</td>
			<td>- commonly written as &#34;U2OS&#34; 
			- culture at 37 &#176;C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>- abbreviated DMEM 
			- contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red 
			- supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin 
			- prewarm prior drug(s) dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td>- abbreviated FBS 
			- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline streptomycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tissues</td>
			<td>KIMTECH SCIENCE</td>
			<td>34120</td>
			<td>- commonly called &#34;kimwipes&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>- autoclaved before used 
			- keep sterile in the tissue culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium (meta)arsenite &#8805;90%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7400-100G</td>
			<td>- commonly called sodium arsenite and abbreviated SA 
			- dissolution in water at 1 M concentration, then dilute to 100 &#181;M as a working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>TSZ CHEM</td>
			<td>RS055</td>
			<td>- abbreviated VRB 
			- dissolve in water to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9620</td>
			<td>- used to assess translation level (ribopuromycylation) 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emetine dihydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2375</td>
			<td>- used in combination with puro to assess general translation level 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859</td>
			<td>- abbreviated CHX 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Lonza / VWR</td>
			<td>95042-486</td>
			<td>- abbreviated PBS 
			- wash buffer for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>- make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved 
			- aliquots can be stored at - 20 &#176;C for several months 
			- hazardous, use ventilation 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS</td>
			<td>BDH / VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td>- pre-chilled to -20&#176;C before use 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td>- abbreviated NHS 
			- dilute to 5% in PBS 
			- add sodium azide for storage at 4&#176;C 
			- blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td>
			<td>Decon Labs / VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>- dilute to 70% with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-81940</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- use at 1/100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti eIF4G antibody (H-300)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-11373</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti eIF3&#951; (N-20) antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-16377</td>
			<td>- eIF3&#951; is also known as eIF3b 
			- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti puromycin 12D10 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE343</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-225-150</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/2500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td>- incubate with secondary antibodies 
			-stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light 
			- Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>016-160-084</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions, then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-(dT)40x probe biotinilated</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>/</td>
			<td>- reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20&#176;C 
			- dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use 
			- custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridation box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>- make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom 
			- prewarm the box prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x SSC buffer</td>
			<td>Thermo fisher Ambion</td>
			<td>AM9763</td>
			<td>- dilute to 2X SSC using RNase Free water (DEPC treated) 
			- store at room temperature 
			- wash buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfectHybPlus Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7033-50ml</td>
			<td>- block and probe incubation buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide mounting media</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>- mix 5 g of &#8220;cold-soluble&#8221; poly(vinyl alcohol) in 20 ml of PBS 
			- mix by sonication, followed by stirring overnight at RT 
			- Add 5 ml of glycerol and 0.2 ml of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT 
			- centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet 
			- aliquot viscous liquid, long-term storage at -20&#176;C, 1 week at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>- usually referred as &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-8136-250G</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100ML</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td>- preservative agent for blocking solution and vinol 
			- make a 20 % dilution in water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules

Cellen worden vaak uitgedaagd door plotselinge omgevingsveranderingen. Stress Granules (SG&#39;s), cytoplasmatische ribonucleoproteïne complexen die zich vormen in cellen blootgesteld aan stressomstandigheden, zijn betrokken bij diverse aspecten van celmetabolisme en overleving. SG&#39;s moduleren cellulaire signalering pathways, post-transcriptie gene expressie en stress response programma&#39;s. De vorming van deze mRNA bevattende korrels is direct verbonden met cellulaire vertaling. SG-montage wordt geactiveerd door geïnhibeerde translatie-initiatie, en SG-demontage wordt bevorderd door translatieactivering of door geïnhibeerde translatieverlenging. Deze relatie wordt verder onderstreept door de SG-samenstelling. Core SG componenten zijn vertraagde translation pre-initiation complexes, mRNA en geselecteerde RNA-bindende eiwitten (RBP&#39;s). Het doel van SG-assemblage is om cellulaire energie te behouden door translationally stalled housekeeping mRNAs te sequesteren, waardoor de versterkt translatie van stress-responsieve eiwitten mogelijk is. In additiOp de kerncomponenten, zoals vertraagde translation preinitiation complexes, bevatten SG&#39;s een overvloed aan andere eiwitten en signaalmoleculen. Defecten in de SG-vorming kunnen de cellulaire aanpassing aan stress verminderen en kunnen dus de celsterfte bevorderen. SG&#39;s en soortgelijke RNA bevattende granules zijn gekoppeld aan een aantal humane ziekten, waaronder neurodegeneratieve stoornissen en kanker, wat leidt tot de recente interesse in het classificeren en definiëren van RNA-granulatubtypen. Dit protocol beschrijft analyses om zoogdieren SG&#39;s te karakteriseren en te kwantificeren.

Stress-geïnduceerde foci zijn niet noodzakelijkerwijs SG&#39;s. SG&#39;s zijn geclassificeerd als cytoplasmatische foci die mRNAs, translatie-initiatieffactoren en RNA-bindende eiwitten bevatten en in evenwicht zijn met actieve vertaling. Bovenstaande protocol kan gebruikt worden als een sjabloon om te karakteriseren of een bepaalde spanning bona fide SG&#39;s induceert. SG&#39;s colocaliseren met andere bekende SG m...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules at JoVE.com

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Stress Granules (SG&#39;s) zijn niet-membraan cytoplasmatische structuren die in cellen vormen die blootstaan ​​aan een verscheidenheid aan stressen. SG&#39;s bevatten mRNA&#39;s, RNA-bindende eiwitten, kleine ribosomale subeenheden, vertaalgerelateerde factoren en diverse cel signalerende eiwitten. Dit protocol beschrijft een workflow die gebruik maakt van verschillende experimentele benaderingen om bona fide SG&#39;s te detecteren, karakteriseren en kwantificeren.

Methoden om Cytoplasmatische Foci te classificeren als Mammalian Stress Granules

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Trypsinizing en Steekenting zoogdiercellen

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Kwantificering van γH2AX Foci in reactie op ioniserende straling

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

Kwantificatie van γH2AX Foci in weefselmonsters

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activering van apoptose door Cytoplasmatische micro-injectie van Cytochroom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Visualisatie van G3BP Stress Korrels Dynamics Live primaire cellen

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulatie van Cytoplasmatische DNA Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; En<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methoden om subcellulaire compartimenten van Muscle beoordelen<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Comet Assay als een indirecte maat van Systemische oxidatieve stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...