Name: methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules
Uploaded: 2017-05-12T14:00:00
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Wir danken den Mitgliedern der Iwanow- und Anderson-Labore für ihre hilfreiche Diskussion und Feedback zu diesem Manuskript. Diese Arbeit wurde von den National Institutes of Health [GM111700 und CA168872 bis PA, NS094918 bis PI], dem National Science Center in Polen [gewährt UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 an WS] unterstützt. WS erkennt auch das Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung in Polen (Mobility Plus-Programm) und die polnisch-amerikanische Fulbright-Kommission für ihre finanzielle Unterstützung seiner Forschung in den USA an.

1. Zellvorbereitung <ol><li> Fügen Sie autoklavierte Deckgläser zu 12 Vertiefungen einer Platte mit 24 Vertiefungen hinzu, wie in Fig. 1A gezeigt ; Dies kann mit einer sterilen Pasteurpipette erfolgen, die an einem Vakuum befestigt ist, um jedes Deckglas aufzunehmen. Vorsichtig auf das Deckglas auf der Seite des Brunnens klopfen, um das Absaugen zu lösen, so dass das Deckglas in den Brunnen fallen kann. </li><li> Platte 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) Osteosarkomzellen pro Vertiefung bei einem En...

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	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Yamasaki, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+mRNA+translation+during+stress.">Reprogramming mRNA translation during stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).</li><li>Buchan, J. 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Wie durch immunhistologische Studien bei multiplen Krankheiten belegt, führt chronischer Stress zur Bildung verschiedener intrazellulärer Herde. Zum Beispiel sind die meisten neurodegenerativen Erkrankungen durch intrazelluläre Aggregate von unlöslichen Proteinen gekennzeichnet. Die Anwesenheit von SG-assoziierten Proteinen in solchen Aggregaten ist oft die Grundlage für den Schluss, dass solche Herde SGs sind. Eine ähnliche Schlussfolgerung wird auch gezogen, wenn SG-Marker-positive zytoplasmatische Herde in Zell...

Zellen verwenden viele Mechanismen, um auf Stress zu reagieren. Einige Antworten treten auf der posttranskriptionellen Ebene auf und beinhalten die Regulierung der mRNA-Translation und / oder der Stabilität 1 , 2 . Stressmodulierte mRNA-Translationsstillstand und -abbau sind mit der Bildung spezifischer nichtmembranöser zellulärer Herde verbunden, wobei die am stärksten charakterisierten Stressgranulate (SGs) 3 sind . SGs sind zytoplasmatische Herde, die die Nicht-Translations von mRNPs in translatorisch verhafteten Zellen, die auf Stress reagieren ( z. B. Oxidation, Hitzeschock, Nährstoffhunger und Virusinfektion), konzentrieren. Zusätzlich zur Nicht-Translation von mRNAs enthalten SGs Translationsinitiierungsfaktoren, RNA-bindende Proteine ​​und verschiedene Signalproteine 5 . SGs sind Biomarker der gehemmten Protein-Translation und veränderten RNA-Metabolismus und wurden mit Zellüberleben und Apoptose, Signalweg verbundenS und nukleare Prozesse 5 . SGs sind dynamische Entitäten, und ihre Bildung ist eng mit dem Status der zellulären Übersetzung verbunden 6 . Trotz ihrer scheinbar soliden Erscheinung, die meisten SG-Protein-Komponenten schnell ein- und ausschalten, mit einer verweilzeit von Sekunden. Während SGs für Minuten bis Stunden bestehen bleiben, sind die meisten ihrer Komponenten im raschen Fluss. Die Hemmung der Translationsinitiierung und die daraus folgende Demontage von translatierenden Polysomen fördern die Bildung von SGs; So sind die SGs im Gleichgewicht mit der Übersetzung von Polysomen. Dieses Polysom ​​/ SG-Gleichgewicht ist der Schlüssel zur Unterscheidung bona fide SGs von anderen stressinduzierten Herden 6 , 7 . Die Veranlassung der Translationsinitiierung beinhaltet die Umwandlung von translation-kompetenten Prä-Initiierungskomplexen, die mRNA, Translationsinitiationsfaktoren (eIF) und 40S ribosomale Untereinheiten enthalten (s<html> O-genannt 48S-Komplexe) in translatorisch blockierte Komplexe (sogenannte 48S * -Komplexe), die sich in SGs 4 , 6 koaleszieren können. SGs werden durch Translationsstillstand an zwei verschiedenen Schritten stromaufwärts von 48S-Komplexbildung gefördert: Interferenz mit den Funktionen des cap-bindenden eIF4F-Komplexes ( zB Targeting auf seine eIF4A-Untereinheit) oder Phosphorylierung der α-Untereinheit des Translationsinitiationsfaktors eIF2, vermittelt durch eins Oder mehr der vier eIF2-Kinasen. Die Anwesenheit von blockierten 48S-Komplexen ( dh 40S ribosomale Untereinheiten und ausgewählte Translationsinitiierungsfaktoren) ist ein Kennzeichen der SGs 8 , 9 . SGs wurden mit verschiedenen pathologischen Zuständen wie Virusinfektionen, Neurodegeneration, Autoimmunität und Krebs 3 , 10 , 11 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . Mutierte Formen von mehreren SG-Komponenten sind mit neurodegenerativen Erkrankungen ( zB amyotropher Lateralsklerose) assoziiert, bei denen Neuronen intrazelluläre pathologische Einschlüsse zeigen, die im neuronalen Tod aktive Rollen spielen können. Einige Viren entführen SG-Komponenten, um die SG-Bildung zu hemmen und die Virusreplikation zu verbessern 14 . Jüngste Studien verknüpfen auch SGs an Krebs 15 und an Krebszellüberleben unter Chemo- und Strahlentherapie-Behandlungen 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Während solche Erkenntnisse ein großes Interesse an der SG-Biologie geweckt haben, fehlen viele der veröffentlichten Berichte über wichtige Kontrollen, um die Bildung von bona fide SGs von anderen stressinduzierten Herden zu unterscheiden. SGs wurden anfänglich als nichtmembranöse zytoplasmatische Foci beschrieben, die aus ausgewählten mRNA-bindenden Proteinen (RBPs) zusammengesetzt waren, einschließlich T-Zell-ntrazelluläres Antigen 1 (TIA-1) und Poly-A-bindendes Protein (PABP); Übersetzungsinitiierungsfaktoren; Polyadenylierten mRNA; Und kleine ribosomale Untereinheiten 4 , 6 , 21 , 22 . Traditionell wurde ihre Zusammensetzung durch Techniken wie Immunfärbung und die ektopische Expression von fluoreszenzmarkierten Proteinen 23 , 24 bestimmt . Aufgrund ihrer hochdynamischen Natur bleibt die Immunolokalisierung von SG-Proteinen und / oder mRNAs die definierende Methode zur Detektion von SGs 23 , 24 . Bisher werden viele RBPs und andere Proteine ​​(über 120 verschiedene Proteine) als SG-Komponenten beschrieben 11 . So viele SG-lokalisierte Proteine ​​verändern ihre Lokalisation sowohl in einer stressabhängigen als auch in einer unabhängigen Weise und können sich an anderen intrazellulären Kompartimenten und Herden ansammeln. Es ist wichtig, korrekte SG-Marker zu wählen und funktionelle Kriterien zu verwenden, um SGs von anderen Arten von Stress-induzierten zu unterscheiden Foci Bona fide SGs enthalten mRNA, Translationsinitiationsfaktoren und kleine ribosomale Untereinheiten und befinden sich im dynamischen Gleichgewicht mit Translation. Dieser einfache Workflow ist darauf ausgelegt, festzustellen, ob Stress-induzierte Herde bona fide SGs sind. Dieser Workflow umfasst mehrere experimentelle Ansätze mit U2OS-Zellen, Zellen, die üblicherweise zur Untersuchung von SGs verwendet werden. Diese Zellen sind ideal, da sie ein großes Zytoplasma haben, sind relativ flach und haften stark an Glasdeckgläschen. Andere Zelltypen können verwendet werden, um SGs zu studieren, aber es ist wichtig, sich bewusst zu sein, dass Unterschiede in der Zeitmessung, der Arzneimittelkonzentration und der Fülle von SG-Nukleierungsproteinen die Kinetik und den Compo verändern könnenSition Zusätzlich reagieren einige Zellen auf die Paraformaldehyd-Fixierung, indem sie Zelloberflächen-Blasen bilden, was dann ein gerafftes Aussehen gibt, das die punktuelle Lokalisierung einiger SG-Marker verursacht; Ohne sorgfältige Analyse können diese als SGs falsch klassifiziert werden. Dies unterstreicht die Notwendigkeit, alle Kriterien zu beurteilen, die erforderlich sind, um stressinduzierte Herde als bona fide SGs zu identifizieren. Vinorelbin (VRB), ein Krebs-Therapeutikum, das SGs 20 fördert, sowie Sodium Arsenite (SA), ein robuster und gut charakterisierter SG-Induktor, werden als Stress für die Experimente in diesem Protokoll verwendet. Kanonische SGs enthalten mehrere SG-Marker (sowohl Proteine ​​als auch mRNAs), die sich in zytoplasmatischen Herden kolokalisieren. Dieses Protokoll verwendet sowohl Immunfluoreszenz- als auch Fluoreszenz- in-situ- Hybridisierung (FISH), um die Lokalisierung von Proteinmarkern und polyadenylierten mRNA 22 zu detektieren. Kurz gesagt, indirekte Immunfluoreszenz verwendet Antikörper ( i.E. Primäre Antikörper), die für ein gegebenes Protein spezifisch sind, um es innerhalb der Zelle zu detektieren. Dann erkennen sekundäre Antikörper (meist speziespezifisch) an Fluorochrome den primären Antikörper und zeigen die Zielprotein-Lokalisation. Die Fluoreszenzmikroskopie wird verwendet, um das lokalisierte Signal innerhalb der Zelle zu detektieren. Die Verwendung von in verschiedenen Spezies produzierten Antikörpern und deren Nachweis mit unterschiedlich gefärbten sekundären Antikörpern ermöglicht den Nachweis der Kolokalisation mehrerer Antikörper, was darauf hinweist, dass ihre Proteinziele an der gleichen Stelle 23 gefunden werden . Es ist wichtig, Marker auszuwählen, die bei der Korruption bei bona fide SGs überprüft wurden. FISH verwendet eine markierte Sonde, die Basenpaare zu einer spezifischen RNA oder DNA-Sequenz 25 bildet . Um mRNA zu detektieren, verwendet dieses Protokoll eine biotinylierte Oligo (dT) 40- Sonde, die (oder Basenpaare) an den PolyA-Schwanz von mRNA hybridisiert ( dh PolyA FISCH). Die biotinylierte Sonde wird dann unter Verwendung von fluoreszenzkonjugiertem Streptavidin nachgewiesen, da Streptavidin eine hohe Affinität für Biotin aufweist. Bei der Beurteilung von SGs ist es wichtig, PolyA FISH mit Immunfluoreszenz zu koppeln, die einen SG-Marker detektiert, wie bei bona fide SGs, die beiden Signale sollten kolokalisieren. Mit diesem Protokoll wird die Kolokalisierung auf mehrere Arten beurteilt. In einem mehrkanaligen ( dh RGB: rot, grün und blau) Bild wird die Kolokalisierung die Farbe des überlappenden Signals verändern ( z. B. kolokalisiert rot und grün gelb) 23 . Zusätzlich wird die Kolokalisierung graphisch unter Verwendung einer Linienabtastanalyse quantifiziert, wobei die Intensität jeder der Farben über eine gegebene Linie 8 , 20 gemessen wird . Dieses Protokoll beschreibt zwei Zeilen-Scan-Analyse-Verfahren mit ImageJ 26 . Ein Verfahren ist manuell und geht durch den gesamten Prozess, whiDer andere verwendet ein Makro oder ein einfaches Programm, das die manuellen Schritte automatisiert. Es ist wichtig, durch das manuelle Programm zu gehen, um das Makroverfahren zu verstehen. SGs bilden sich in Zellen, wo die Translation unterdrückt wird; Daher sollten Zellen mit SGs verringerte Werte der globalen Translation im Vergleich zu unbehandelten Zellen zeigen. Experimentell wird Ribopuromycylierung verwendet. Puromycin und Emetin werden den Zellen für eine kurze Dauer vor der Fixierung zugesetzt, so dass das Puromycin in die aktive Bildung von Polypeptiden einbinden kann, was die Beendigung 27 , 28 verursacht. Eine Behandlung mit Emetin ist erforderlich, um eine Wiederinitiierung zu verhindern 29 . Puromycin kann dann mit Anti-Puromycin-Antikörper nachgewiesen werden, was eine Momentaufnahme der aktiven Translation ergibt. Diese Methode wird verwendet, weil es schnell ist, erfordert nicht vorhungern mit einem Medium fehlt eine bestimmte Aminosäure (und potenziell Vorspannung der Zellen), und zeigt dieSubzelluläre Lokalisation der Proteinübersetzung Andere Verfahren, insbesondere modifizierte Aminosäureanaloga, wie das Methionin-Analog-L-Azidohomoalain (AHA), gekoppelt mit der &quot;Klick-it&quot; -Aryge 30 , wurden verwendet, um zu zeigen, dass Zellen, die SGs enthalten, eine viel geringere Translation aufweisen als die benachbarten Zellen 31 . Diese Technik erfordert jedoch einen Methionin-Hunger, gefolgt von einer Puls-Markierung für 15-30 min. Der Methionin-Hunger stellt einen zusätzlichen Stress dar, während die lange Etikettierzeit ( dh 15-30 min) zur Messung der kumulativen und nicht fortlaufenden Translation führt und es den neu synthetisierten Proteinen ermöglicht, sich von ihrem Syntheseort zu ihrem endgültigen Ziel innerhalb der Zelle. Im Gegensatz dazu ist die Ribopuromycylierung viel schneller und kompatibel mit jedem Medium, wie dem glucosefreien Medium, das verwendet wird, um SGs durch Glucoseverhungern zu induzieren. Die kanonischen SGs befinden sich im dynamischen GleichgewichtMit aktiv übersetzenden Polysomen. Dies kann experimentell beurteilt werden, indem man Proben mit den Medikamenten behandelt, die Polysomen stabilisieren oder destabilisieren, wodurch das Gleichgewicht zwischen SGs und Polysomen gekippt wird 23 . Cycloheximid (oder Emetin, das sich ähnlich verhält) blockiert die Dehnung durch &quot;Einfrieren&quot; von Ribosomen auf mRNA, wodurch der Pool der verfügbaren nicht-polysomalen mRNPs, die SGs bilden können, verringert. Experimentell kann dies auf zwei Arten verwendet werden: durch Zugabe von Cycloheximid (oder Emetin) vor Stress, um eine SG-Bildung zu verhindern, oder durch Zugabe von Cycloheximid (oder Emetin), nachdem die SGs gebildet worden sind, auch ohne das Stressmittel zu entfernen, was eine SG-Demontage verursacht, wie es blockiert ist Präinitiierungskomplexe werden langsam in die Polysomfraktion eingelassen. Im Gegensatz dazu verursacht Puromycin eine vorzeitige Beendigung und fördert die Polysom-Demontage, wodurch der Pool von initiierenden mRNAs erhöht wird, die in der Lage sind, in SGs zusammenzusetzen. Experimentell erhöht die Puromycin-Behandlung die Anzahl der SGs oder senkt den SchwellenwertD, bei denen sie sich als Reaktion auf abgestuften Stress oder Arzneimitteldosierung bilden. Bei der Beurteilung der Wirkung von Puromycin ist es wichtig, ein submaximales Niveau des Medikaments von Interesse zu verwenden, da Puromycin erwartet wird, die Wirkung des Arzneimittels zu erhöhen und den Prozentsatz der Zellen, die SGs zeigen, zu erhöhen - dies kann nicht auftreten, wenn das Medikament / Stress verursacht SGs in 100% der Zellen anfangs. Dies steht im Gegensatz zu der Cycloheximid-Behandlung, die SGs zerlegt und am besten funktioniert, wenn ~ 95% der Zellen anfänglich SGs zeigen, so dass die größtmögliche Abnahme beobachtet und genau quantifiziert werden kann. Dieses Protokoll bietet einen Rahmen für die Untersuchung von SGs in Säugetierzellen. Zu den Methoden gehören: (1) Immunfluoreszenzfärbung und ImageJ-Analyse zur Beurteilung der Kolokalisierung der klassischen SG-assoziierten Marker eIF4G, eIF3b und Ras GTPase-aktivierenden Proteinbindungsprotein 1 (G3BP1) in putativen SGs; (2) Oligo (dT) Fluoreszenz in situ Hybridisierung (PolyA FISH) zur Detektion polyadenylierter mRNA; (3) Cycloheximid- und Puromycin-Behandlung, um zu bestimmen, ob stressinduzierte Herde im dynamischen Gleichgewicht mit Polysomen sind; Und (4) Ribopuromycylierung zur Beurteilung des Translationsstatus von Zellen, die putative SGs enthalten. Zusammen können diese Assays bestimmen, ob Stress-induzierte Herde als bona fide SGs eingestuft werden können.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174;HTB-96&#8482;</td>
			<td>- commonly written as &#34;U2OS&#34; 
			- culture at 37 &#176;C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>- abbreviated DMEM 
			- contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red 
			- supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin 
			- prewarm prior drug(s) dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td>- abbreviated FBS 
			- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline streptomycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tissues</td>
			<td>KIMTECH SCIENCE</td>
			<td>34120</td>
			<td>- commonly called &#34;kimwipes&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>- autoclaved before used 
			- keep sterile in the tissue culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium (meta)arsenite &#8805;90%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7400-100G</td>
			<td>- commonly called sodium arsenite and abbreviated SA 
			- dissolution in water at 1 M concentration, then dilute to 100 &#181;M as a working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>TSZ CHEM</td>
			<td>RS055</td>
			<td>- abbreviated VRB 
			- dissolve in water to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9620</td>
			<td>- used to assess translation level (ribopuromycylation) 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emetine dihydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2375</td>
			<td>- used in combination with puro to assess general translation level 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859</td>
			<td>- abbreviated CHX 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Lonza / VWR</td>
			<td>95042-486</td>
			<td>- abbreviated PBS 
			- wash buffer for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>- make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved 
			- aliquots can be stored at - 20 &#176;C for several months 
			- hazardous, use ventilation 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS</td>
			<td>BDH / VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td>- pre-chilled to -20&#176;C before use 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td>- abbreviated NHS 
			- dilute to 5% in PBS 
			- add sodium azide for storage at 4&#176;C 
			- blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td>
			<td>Decon Labs / VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>- dilute to 70% with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-81940</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- use at 1/100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti eIF4G antibody (H-300)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-11373</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti eIF3&#951; (N-20) antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-16377</td>
			<td>- eIF3&#951; is also known as eIF3b 
			- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti puromycin 12D10 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE343</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-225-150</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/2500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td>- incubate with secondary antibodies 
			-stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light 
			- Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>016-160-084</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions, then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-(dT)40x probe biotinilated</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>/</td>
			<td>- reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20&#176;C 
			- dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use 
			- custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridation box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>- make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom 
			- prewarm the box prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x SSC buffer</td>
			<td>Thermo fisher Ambion</td>
			<td>AM9763</td>
			<td>- dilute to 2X SSC using RNase Free water (DEPC treated) 
			- store at room temperature 
			- wash buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfectHybPlus Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7033-50ml</td>
			<td>- block and probe incubation buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide mounting media</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>- mix 5 g of &#8220;cold-soluble&#8221; poly(vinyl alcohol) in 20 ml of PBS 
			- mix by sonication, followed by stirring overnight at RT 
			- Add 5 ml of glycerol and 0.2 ml of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT 
			- centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet 
			- aliquot viscous liquid, long-term storage at -20&#176;C, 1 week at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>- usually referred as &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-8136-250G</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100ML</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td>- preservative agent for blocking solution and vinol 
			- make a 20 % dilution in water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules

Zellen werden oft durch plötzliche Umweltveränderungen herausgefordert. Stressgranulate (SGs), zytoplasmatische Ribonukleoproteinkomplexe, die sich in Zellen bilden, die Stressbedingungen ausgesetzt sind, sind in verschiedenen Aspekten des Zellstoffwechsels und des Überlebens verwickelt. SGs modulieren zelluläre Signalwege, post-transkriptionale Genexpression und Stress-Response-Programme. Die Bildung dieser mRNA-haltigen Granulate ist direkt mit der zellulären Translation verbunden. SG-Assembly wird durch gehemmte Translationsinitiation ausgelöst, und die SG-Demontage wird durch Translationsaktivierung oder durch gehemmte Translationsdehnung gefördert. Diese Beziehung wird durch SG-Komposition weiter hervorgehoben. Core-SG-Komponenten sind gestoppte Translationsvorinitiierungskomplexe, mRNA und ausgewählte RNA-bindende Proteine ​​(RBPs). Der Zweck der SG-Versammlung besteht darin, zelluläre Energie durch Sequestrierung von translatorisch blockierten Housekeeping-mRNAs zu erhalten, was die verbesserte Translation von stressempfindlichen Proteinen ermöglicht. In additivAuf die Kernbestandteile, wie z. B. gestoppte Translationsvorbereitungskomplexe, enthalten SGs eine Fülle von anderen Proteinen und Signalmolekülen. Defekte in der SG-Bildung können die zelluläre Anpassung an Stress beeinträchtigen und so den Zelltod fördern. SGs und ähnliche RNA-haltige Granulate wurden mit einer Reihe von menschlichen Krankheiten, einschließlich neurodegenerativen Erkrankungen und Krebs, verbunden, was zu dem jüngsten Interesse an der Klassifizierung und Definition von RNA-Granulat-Subtypen führte. Dieses Protokoll beschreibt Assays zur Charakterisierung und Quantifizierung von Säugetier-SGs.

Stress-induzierte Herde sind nicht unbedingt SGs. SGs werden als zytoplasmatische Foci klassifiziert, die mRNAs, Translationsinitiationsfaktoren und RNA-bindende Proteine ​​enthalten und im Gleichgewicht mit aktiver Translation stehen. Das obige Protokoll kann als Vorlage verwendet werden, um zu charakterisieren, ob eine gegebene Spannung bona fide SGs induziert. SGs kolokalisieren mit anderen bekannten SG-Markern...

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Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Stressgranulate (SGs) sind nichtmembranöse zytoplasmatische Strukturen, die sich in Zellen bilden, die einer Vielzahl von Spannungen ausgesetzt sind. SGs enthalten mRNAs, RNA-bindende Proteine, kleine ribosomale Untereinheiten, Translations-bezogene Faktoren und verschiedene Zell-Signal-Proteine. Dieses Protokoll beschreibt einen Workflow, der mehrere experimentelle Ansätze verwendet, um bona fide SGs zu erkennen, zu charakterisieren und zu quantifizieren.

Methoden zur Klassifizierung von zytoplasmatischen Foci als Säugetier-Stressgranulat

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

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