Name: methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules
Uploaded: 2017-05-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules at JoVE.com

אנו מודים לחברי המעבדות של איבנוב ואנדרסון על הדיונים המועילים והמשוב על כתב היד. עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות [GM111700 ו- CA168872 ל- PA, NS094918 ל- PI], המרכז הלאומי למדע בפולין [הענקת UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 ל- WS]. WS גם מכיר במשרד המדע והחינוך הגבוה בפולין (Mobility Plus Program) וועדת פולברייט הפולנית-אמריקנית על תמיכתם הכספית במחקר בארצות הברית.

1. הכנת תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף coverslips Autoclaved כדי 12 בארות של צלחת 24 גם, כפי שצוין באיור 1A ; זה יכול להיעשות באמצעות פיפטה פסטר סטרילית המצורפת ואקום להרים כל coverslip. בעדינות הקשה coverslip בצד של הבאר כדי לשחרר את היניקה, המאפשר coverslip ...

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Yamasaki, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+mRNA+translation+during+stress.">Reprogramming mRNA translation during stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).</li><li>Buchan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNP+granules:+Assembly,+function,+and+connections+with+disease.">mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease.</a> RNA Biol. 11 (8), (2014).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+ternary+complex+(eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules.">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li><li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+and+cell+signaling:+more+than+just+a+passing+phase?.">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase?.</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+shuttling+of+TIA-1+accompanies+the+recruitment+of+mRNA+to+mammalian+stress+granules.">Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).</li><li>Bley, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+are+dispensable+for+mRNA+stabilization+during+cellular+stress.">Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 43 (4), e26 (2015).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP-Caprin1-USP10+complexes+mediate+stress+granule+condensation+and+associate+with+40S+subunits.">G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits.</a> J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).</li><li>Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+mammalian+stress+granule+dynamics.">Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics.</a> J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules,+P-bodies+and+cancer.">Stress granules, P-bodies and cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).</li><li>Aulas, A., Van de Velde, ., C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+stress+granule+dynamics+driven+by+TDP-43+and+FUS:+a+link+to+pathological+inclusions+in+ALS?.">Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS?.</a> Front Cell Neurosci. 9, 423 (2015).</li><li>Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulatory+networks+in+immunity.">Post-transcriptional regulatory networks in immunity.</a> Immunol Rev. 253 (1), 253-272 (2013).</li><li>Wolozin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+protein+aggregation+run+amuck:+stress+granules+and+the+genesis+of+neurodegenerative+disease.">Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease.</a> Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).</li><li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+stress+granules+and+P-bodies+during+RNA+virus+infection.">Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).</li><li>Somasekharan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YB-1+regulates+stress+granule+formation+and+tumor+progression+by+translationally+activating+G3BP1.">YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1.</a> J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).</li><li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib,+a+multikinase+inhibitor,+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells.">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. , (2015).</li><li>Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules.">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell Int. 10, 12 (2010).</li><li>Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+ubiquitin-proteasome+system+induces+stress+granule+formation.">Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation.</a> Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).</li><li>Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+activates+HIF-1+to+regulate+vascular+radiosensitivity+in+tumors:+role+of+reoxygenation,+free+radicals,+and+stress+granules.">Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules.</a> Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).</li><li>Szaflarski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vinca+alkaloid+drugs+promote+stress-induced+translational+repression+and+stress+granule+formation.">Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation.</a> Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).</li><li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1.">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li><li>Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+TIA-1+and+TIAR+link+the+phosphorylation+of+eIF-2+alpha+to+the+assembly+of+mammalian+stress+granules.">RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li><li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).</li><li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+method+for+mapping+genes+on+Drosophila+polytene+chromosomes.">Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+characterization+of+stress+granules+in+virus+infected+cells.">Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells.</a> Methods. 90, 57-64 (2015).</li><li>David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emetine+optimally+facilitates+nascent+chain+puromycylation+and+potentiates+the+ribopuromycylation+method+(RPM)+applied+to+inert+cells.">Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells.</a> Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).</li><li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+visualization+and+dynamics+of+newly+synthesized+proteins+in+rat+hippocampal+neurons.">In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).</li><li>Ruggieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+oscillation+of+translation+and+stress+granule+formation+mark+the+cellular+response+to+virus+infection.">Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).</li><li>Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+contribute+to+alpha-globin+homeostasis+in+differentiating+erythroid+cells.">Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).</li><li>Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+RNAi+screen+links+O-GlcNAc+modification+of+ribosomal+proteins+to+stress+granule+and+processing+body+assembly.">A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly.</a> Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).</li><li>Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+regulated+by+arsenate+and+arsenite.">Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite.</a> Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).</li><li>Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+binding+to+proteins.">Arsenic binding to proteins.</a> Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).</li><li>McDonald, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+(TDP-43)+regulates+stress+granule+dynamics+via+differential+regulation+of+G3BP+and+TIA-1.">TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1.</a> Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).</li><li>Aulas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP1+promotes+stress-induced+RNA+granule+interactions+to+preserve+polyadenylated+mRNA.">G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA.</a> J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).</li><li>Martin, S., Tazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+G3BP+stress+granules+dynamics+in+live+primary+cells.">Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li><li>Wippich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+specificity+kinase+DYRK3+couples+stress+granule+condensation/dissolution+to+mTORC1+signaling.">Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling.</a> Cell. 152 (4), 791-805 (2013).</li></ol>

כפי שמעידים מחקרים immunohistological במחלות רבות, מתח כרוני מוביל להיווצרות של מוקדים תאיים שונים. לדוגמה, רוב מחלות נוירודגנרטיבית מאופיינים אגרגטים תאיים של חלבונים מסיסים. נוכחותם של חלבונים הקשורים ל- SG באגרגטים כאלה היא לעתים קרובות הבסיס למסקנה כי מוקדים כאלה הם SGs. מס...

תאים מפעילים מנגנונים רבים כדי להגיב ללחץ. כמה תגובות להתרחש ברמה שלאחר תמלול כרוך הרגולציה mRNA תרגום ו / או יציבות 1 , 2 . מתח מאופנן mRNA translational מעצר והשפלה קשורות עם היווצרות של ספציפי foci הסלולר הלא ממברנות, המאופיינים היטב להיות גרגרי מתח (SGs) 3 . SGS הם foci cytoplasmic כי ריכוז mRNPs nonnransls בתאי transransly- נעצר להגיב ללחץ ( למשל, חמצון, הלם חום, רעב מזין, זיהום ויראלי) 4 . בנוסף mRNAs nontranslating, SGS מכילים גורמים חניכה התרגום, RNA מחייב חלבונים, וחלבונים איתות שונים 5 . SGS הם ביומרקרים של חלבון inhibited תרגום ושינו את חילוף החומרים RNA ו נקשרו הישרדות התא אפופטוזיס, איתות המסלולותהליכים גרעיניים 5 . SGS הם ישויות דינמיות, והיווצרותם קשורה קשר הדוק למעמד התרגום הסלולר 6 . למרות המראה המוצק לכאורה שלהם, רוב רכיבי החלב SG במהירות מעבורת פנימה והחוצה, עם זמן מגורים של שניות. בעוד SGs להתמיד במשך דקות עד שעות, רוב הרכיבים שלהם הם שטף מהיר. עיכוב התחלת התרגום והפירוק הנוסף של תרגום פוליסומות מקדמים את היווצרותם של SGS; לפיכך, SGs נמצאים שיווי משקל עם תרגום polysomes. זה שיווי משקל polysome / SG הוא המפתח להבדיל SGs בתום לב מ מתח אחר המושרה מוקדים 6 , 7 . עיכוב התחלת התרגום כרוך בהמרה של מתחמי טרום-חניכה מוכשרים לתרגום, המכילים mRNA, גורמי ייזום התרגום (eIF) ומקטעי 40S ריבוזומליים (s)<html> O-48S מתחמי 48) לתוך מתחמי stallened translationally (שנקרא 48S * קומפלקסים) שיכולים להתמזג לתוך SGs 4 , 6 . SGS מקודמים על ידי מעצר translational בשני שלבים שונים במעלה של 48S היווצרות מורכבת: הפרעה עם פונקציות של כובע מחייב eIF4F מורכבים ( למשל, מיקוד eF4A שלה יחידת משנה) או זרחון של יחידת משנה α של גורם ייזום התרגום eIF2, בתיווך אחד או יותר של ארבעת eIF2 קינאזות. נוכחותם של מתחמי 48S נתקע ( כלומר 40S יחידות משנה ribosomal ו נבחר גורמים התחלת התרגום) הוא סימן ההיכר של SGS 8 , 9 . SGS נקשרו למצבים פתולוגיים שונים, כגון זיהומים ויראליים, ניוון מוחי, אוטואימוניות וסרטן 3 , 10 , 11 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . צורות מוטציה של כמה מרכיבי SG קשורים למחלות נוירודגנרטיביות ( למשל, טרשת לרוחב אמיוטרופית), שבה נוירונים מציגים תכלילים פתולוגיים תאיים העשויים לשחק תפקידים פעילים במוות העצבית 13 . וירוסים מסוימים לחטוף רכיבי SG לעכב היווצרות SG כדי לשפר את שכפול ויראלי 14 . מחקרים שנעשו לאחרונה מקשרים בין SGS לבין סרטן 15 לבין הישרדות תאי סרטן תחת טיפולי כימותרפיה ורדיותרפיה 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . בעוד ממצאים אלה עוררו עניין רב בביולוגיה של SG, רבים מהדו&quot;חות שפורסמו חסרים בקרות חשובות על מנת להבחין בין היווצרותם של SGS בתום לב לבין מוקדי מתח נוספים. SGs תוארו בתחילה כמו foci cytoplasmic לא ממורכבים המורכבים mRNA מחייב חלבונים מחייב (RBPs), כולל T- תא תאיים אנטיגן 1 (TIA-1) ו Poly-A מחייב חלבון (PABP); גורמי ייזום התרגום; MRNA polyadenylated; ו קטן ribosomal יחידות 4 , 6 , 21 , 22 . באופן מסורתי, הרכב שלהם נקבע על ידי טכניקות כגון immunostaining ואת הביטוי ectopic של חלבונים מתויגים fluorescently 23 , 24 . בשל אופי דינמי מאוד שלהם, immunolocalization של חלבונים SG ו / או mRNAs נשאר המתודולוגיה הגדרת לאיתור SGs 23 , 24 . עד כה, RBPs רבים חלבונים אחרים (מעל 120 חלבונים שונים) מתוארים רכיבי SG 11 . כמו רבים Sחלבונים מבוססי G משנים את הלוקליזציה שלהם בתלות בלחץ ובצורה עצמאית ויכולים לצבור בתאים תאיים ופוצ&#39;י אחרים, חשוב לבחור סמני SG מתאימים ולהשתמש בקריטריונים פונקציונליים כדי להבדיל בין SGS לבין סוגים אחרים של מתח המושרה מוקדים. SGS בתום לב מכילים mRNA, גורמים ייזום התרגום, ו קטן יחידות משנה ribosomal והם שיווי משקל דינמי עם תרגום. תהליך עבודה פשוט זה נועד לקבוע אם פוקוס המושרה מתח הוא SGS בתום לב . זרימת עבודה זו כוללת כמה גישות ניסיוניות באמצעות תאים U2OS, תאים נפוץ ללמוד SGS. תאים אלה הם אידיאליים, שכן יש להם ציטופלסמה גדולה, שטוחים יחסית, וצרף חזק coverslips זכוכית. סוגי תאים אחרים יכולים לשמש ללימוד SGS, אך חשוב להיות מודעים לכך שההבדלים בעיתוי, ריכוז התרופה, ושפע של חלבונים מסוג SG-nucleating יכולים לשנות את הקינטיקה והקומפו. בנוסף, תאים מסוימים מגיבים קיבוע paraformaldehyde על ידי יצירת משטח blebs תא, נותן לאחר מכן הופעה פרועה שגורמת לוקליזציה לנקב של כמה סמנים SG; ללא ניתוח זהיר, אלה יכולים להיות מסווגים כמו SGs. זה מדגיש את הצורך להעריך את כל הקריטריונים הנדרשים כדי לזהות מתח מובנה foci כמו SGs בתום לב . Vinorelbine (VRB), טיפול סרטני המקדם SGs 20 , כמו גם סודיום ארסניט (SA), חזק ומובחן SG inducer, משמשים מדגיש את הניסויים בפרוטוקול זה. SGs קנוניקל להכיל מספר סמנים SG (הן חלבונים mRNAs) כי colocalize ב מוקדים cytoplasmic. פרוטוקול זה משתמש הן immunofluorescence ו פלואורסצנציה באתרו באתרו (דגים) כדי לזהות את לוקליזציה של סמנים חלבון ו mRNA polyadenylated 22 , בהתאמה. בקצרה, immunofluorescence עקיף משתמש נוגדנים ( i.ה. נוגדנים ראשוניים) ספציפיים עבור חלבון נתון כדי לזהות אותו בתוך התא. לאחר מכן, נוגדנים משניים (בדרך כלל מינים ספציפיים) המצורפת fluorochromes לזהות את הנוגדן העיקרי לחשוף את הלוקליזציה היעד חלבון. מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש כדי לזהות את האות המקומי בתוך התא. שימוש נוגדנים המיוצרים במינים שונים וגילוי אותם עם נוגדנים משני צבע שונה מאפשר זיהוי של colocalization של נוגדנים מרובים, המציין כי מטרות החלבון שלהם נמצאים באותו מיקום 23 . חשוב לבחור סמנים אשר אומתו כדי colocalize ב SGs בתום לב . FISH משתמש בדיקה שכותרתו כי בסיס זוגות לרנ&quot;א מסוים או רצף DNA 25 . כדי לזהות mRNA, פרוטוקול זה משתמש oligo biotinylated (dT) 40 בדיקה כי הכלאה (או זוגות זוג) לזנב polyA של mRNA ( כלומר polyA FISH). בדיקה biotinylated מזוהה אז באמצעות streptavidin מצומדות fluorescently, כמו streptavidin יש זיקה גבוהה לביוטין. כאשר מעריכים SGS, חשוב כמה דגים polyA עם immunofluorescence גילוי סמן SG, כמו בתום לב SGS, שני האותות צריך colocalize. באמצעות פרוטוקול זה, colocalization מוערך במספר דרכים. ב רב ערוצי ( כלומר RGB: אדום, ירוק וכחול) התמונה, colocalization ישנה את הצבע של האות חופפים ( למשל colocalized אדום וירוק מופיעים צהוב) 23 . בנוסף, colocalization הוא לכמת בצורה גרפית באמצעות ניתוח סריקה קו, שבו את העוצמה של כל צבע נמדדת על פני שורה 8 , 20 . פרוטוקול זה מתאר שני שורת סריקה הליכי ניתוח באמצעות ImageJ 26 . הליך אחד הוא ידני ועובר את כל התהליך, whiהשני משתמש מאקרו, או תוכנית פשוטה אשר ממכן את השלבים הידניים. חשוב לעבור את התוכנית ידנית כדי להבין את הליך מאקרו. SGS בתאים שבהם התרגום מודחק; לכן, תאים עם SGs צריך להציג ירידה ברמות של התרגום העולמי לעומת תאים מטופלים. ניסויי, ribopuromycylation משמש. Puromycin ו emetine מתווספים לתאים למשך זמן קצר לפני קיבעון, המאפשר puromycin לשלב לתוך פוליפפטידים להרכיב באופן פעיל, גרימת סיום 27 , 28 . טיפול באמטין נדרש כדי למנוע את התחלת הטיפול מחדש. Puromycin אז ניתן לזהות באמצעות נוגדן אנטי puroycin, נותן תמונה של תרגום פעיל. שיטה זו משמשת משום שהיא מהירה, אינה דורשת מראש רעב עם מדיום חסר חומצת אמינו מסוימת (פוטנציאלית ו prressing התאים), ומגלה אתלוקליזציה תת - תאית של תרגום חלבונים. שיטות אחרות, בעיקר באמצעות אנלוגים חומצה אמינו שונה, כגון methionine אנלוגי L-azidohomoalaine (AHA), יחד עם &quot;לחץ על זה&quot; כימיה 30 , שימשו כדי להראות כי תאים המכילים SGs התערוכה תרגום הרבה יותר נמוך מאשר תאים סמוכים 31 . עם זאת, טכניקה זו דורשת רעב מתיוני ואחריו דופק תיוג של 15-30 דקות. הרעב של מתיונין מהווה לחץ נוסף, בעוד שזמן התיוג הארוך ( כלומר 15-30 דק &#39;) גורם למדידה של התרגום המצטבר ולא לתרגום מתמשך וגם מאפשר לחלבונים המסונתזים החדשים לעבור מאתר הסינתזה שלהם ליעד הסופי שלהם בתוך תָא. לעומת זאת, ribopuromycylation הוא הרבה יותר מהר והוא תואם לכל מדיום, כגון המדיום חופשי גלוקוז המשמש לייצור SGs דרך רעב גלוקוז. קנוניקל SGs הם שיווי משקל דינמיעם תרגום פעיל polysomes. ניתן להעריך זאת באופן ניסיוני על ידי טיפול בדגימות עם תרופות המייצבות או מערערות את הפוליזומים, ובכך מפזזות את האיזון בין SGs לבין פוליסומות 23 . Cycloheximide (או emetine, אשר מתנהג באופן דומה) חוסם התארכות על ידי ריבוזומים &quot;מקפיא&quot; על mRNA, ובכך להקטין את הבריכה של mRNPs הלא polysomal זמין מסוגל להקים SGs. ניסוי זה יכול לשמש בשתי דרכים: על ידי הוספת cycloheximide (או emetine) לפני מתח כדי למנוע היווצרות SG או על ידי הוספת cycloheximide (או emetine) לאחר SGs יצרו, גם מבלי להסיר את הדגיש סוכן, גרימת SG dis disembly, כמו תקוע מתחמי preinitiation הם הודה אט אט לתוך החלק polysome. לעומת זאת, puromycin גורם לסיום מוקדם ומקדם פירוק polysome, להגדיל את הבריכה של mRNAs ייזום מסוגל להרכיב SGS. באופן ניסיוני, טיפול puromycin מגדיל את מספר ה- SG או מוריד את הטרשולד שבו הם נוצרים בתגובה ללחץ מדורג או מינון סמים. כאשר בוחנים את ההשפעה של puromycin, חשוב להשתמש ברמה תת-מקסימלית של התרופה המעניינת, מכיוון שפרומיצין צפוי להגדיל את השפעת התרופה ולהגדיל את אחוז התאים המציגים SGS - זה לא יכול להתרחש אם התרופה / מתח גורם SGs ב 100% של התאים בתחילה. זה מנוגד לטיפול cycloheximide, אשר מפרק SGs ועובד הכי טוב כאשר ~ 95% מהתאים בתחילה להציג SGS כך הירידה הגדולה ביותר ניתן לצפות ו לכמת במדויק. פרוטוקול זה מספק מסגרת ללמוד SGs בתאי יונקים. השיטות כוללות: (1) מכתים immunofluorescent וניתוח ImageJ כדי להעריך את colocalization קלאסי SG- הקשורים סמנים eIF4G, eIF3b, ואת ראס GTPase- הפעלת חלבון מחייב חלבון 1 (G3BP1) ב SGs משוערת; (2) אוליגו (dT) פלואורסצנציה בהכלאה באתרו (polyA FISH) כדי לזהות polyrenylated mRNA; (3) cycloheximide ו puromycin טיפול כדי לקבוע אם הלחץ- Induced foci הם שיווי משקל דינמי עם polysomes; ו (4) ribopuromycylation להעריך את המצב translational של תאים המכילים SG SG. ביחד, מבחני אלה יכולים לקבוע אם foci מתח המושרה יכול להיות מסווגת כמו SGs בתום לב .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174;HTB-96&#8482;</td>
			<td>- commonly written as &#34;U2OS&#34; 
			- culture at 37 &#176;C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>- abbreviated DMEM 
			- contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red 
			- supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin 
			- prewarm prior drug(s) dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td>- abbreviated FBS 
			- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline streptomycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tissues</td>
			<td>KIMTECH SCIENCE</td>
			<td>34120</td>
			<td>- commonly called &#34;kimwipes&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>- autoclaved before used 
			- keep sterile in the tissue culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium (meta)arsenite &#8805;90%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7400-100G</td>
			<td>- commonly called sodium arsenite and abbreviated SA 
			- dissolution in water at 1 M concentration, then dilute to 100 &#181;M as a working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>TSZ CHEM</td>
			<td>RS055</td>
			<td>- abbreviated VRB 
			- dissolve in water to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9620</td>
			<td>- used to assess translation level (ribopuromycylation) 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emetine dihydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2375</td>
			<td>- used in combination with puro to assess general translation level 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859</td>
			<td>- abbreviated CHX 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Lonza / VWR</td>
			<td>95042-486</td>
			<td>- abbreviated PBS 
			- wash buffer for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>- make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved 
			- aliquots can be stored at - 20 &#176;C for several months 
			- hazardous, use ventilation 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS</td>
			<td>BDH / VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td>- pre-chilled to -20&#176;C before use 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td>- abbreviated NHS 
			- dilute to 5% in PBS 
			- add sodium azide for storage at 4&#176;C 
			- blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td>
			<td>Decon Labs / VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>- dilute to 70% with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-81940</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- use at 1/100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti eIF4G antibody (H-300)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-11373</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti eIF3&#951; (N-20) antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-16377</td>
			<td>- eIF3&#951; is also known as eIF3b 
			- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti puromycin 12D10 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE343</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-225-150</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/2500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td>- incubate with secondary antibodies 
			-stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light 
			- Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>016-160-084</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions, then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-(dT)40x probe biotinilated</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>/</td>
			<td>- reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20&#176;C 
			- dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use 
			- custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridation box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>- make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom 
			- prewarm the box prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x SSC buffer</td>
			<td>Thermo fisher Ambion</td>
			<td>AM9763</td>
			<td>- dilute to 2X SSC using RNase Free water (DEPC treated) 
			- store at room temperature 
			- wash buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfectHybPlus Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7033-50ml</td>
			<td>- block and probe incubation buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide mounting media</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>- mix 5 g of &#8220;cold-soluble&#8221; poly(vinyl alcohol) in 20 ml of PBS 
			- mix by sonication, followed by stirring overnight at RT 
			- Add 5 ml of glycerol and 0.2 ml of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT 
			- centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet 
			- aliquot viscous liquid, long-term storage at -20&#176;C, 1 week at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>- usually referred as &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-8136-250G</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100ML</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td>- preservative agent for blocking solution and vinol 
			- make a 20 % dilution in water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules

תאים לעתים קרובות לערער על ידי שינויים סביבתיים פתאומיים. גרגרי מתח (SGS), קומפלקסים ריבנוקלאופרוטין cytoplasmic כי הטופס בתאים חשופים לתנאי מתח, מעורבים בהיבטים שונים של חילוף החומרים התא הישרדות. SGS לווסת מסלולים איתות הסלולר, שלאחר תעתיק ביטוי גנים, ותגובות תגובה. היווצרות של גרגרים אלה המכילים mRNA מחובר ישירות לתרגום הסלולר. הרכבה SG מופעלת על ידי ייזום התרגום inhibited, ו- SS dis disembly הוא מקודם על ידי הפעלת התרגום או על ידי התארכות התרגום מעכב. מערכת יחסים זו מודגשת עוד יותר על ידי הרכב SG. Core רכיבי SG הם נעצר תרגום מראש מתחמי ייזום, mRNA, ובחירה RNA מחייב חלבונים (RBPs). מטרת הרכבה SG היא לשמר את האנרגיה הסלולרית על ידי השמירה translationally mNANA הרדוקציה translationally, המאפשר לתרגום משופר של חלבונים מגיב ללחץ. בנוסףעל מרכיבי הליבה, כגון מתחמי preinitiation תרגום נתקע, SGS מכילים שפע של חלבונים אחרים ומולקולות איתות. פגמים במבנה SG עלולים לפגוע בהסתגלות תאית ללחץ ולכן יכולים לקדם מוות של תאים. SGs ו דומה RNA המכילים גרגרי היו מקושרים למספר מחלות אנושיות, כולל הפרעות ניווניות וסרטן, מה שמוביל את העניין האחרון סיווג והגדרת תת סוג RNA גרגר. פרוטוקול זה מתאר מבחני לאפיין לכמת SGS יונקים.

מתח- Induced foci לא בהכרח SGs. SGs מסווגים foci cytoplasmic המכילים mRNAs, גורמים ייזום התרגום, ו- RNA מחייב חלבונים נמצאים שיווי משקל עם תרגום פעיל. פרוטוקול לעיל ניתן להשתמש כתבנית כדי לאפיין אם הלחץ נתון גורם SGS בתום לב . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules at JoVE.com

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

גרגרי מתח (SGs) הם מבנים cytoplasmic לא ממברנות אשר יוצרים בתאים חשופים למגוון של לחצים. SGS מכילים mRNAs, RNA מחייב חלבונים, יחידות קטנות ריבוזומליות, גורמים הקשורים לתרגום, וחלבונים שונים איתות איתות. פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה המשתמשת במספר גישות ניסיוניות כדי לזהות, לאפיין, לכמת SGs בתום לב .

שיטות לסיווג מוקדים Cytoplasmic כמו גרגרי מתח יונקים

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Trypsinizing ו Subculturing בתאי יונקים

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

כימות γH2AX מוקדים בתגובה קרינה Ionising

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

הפעלה של אפופטוזיס על ידי Microinjection cytoplasmic של ציטוכרום ג</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

ויזואליזציה של מתח G3BP גרגרי Dynamics בראשי תאים בשידור חי

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

גירוי של cytoplasmic מסלולי חישה DNA<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; בVivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

שיטות להערכת subcellular תאים של שריר ב<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

שביט Assay כאמצעי עקיף של מתח מערכתי חמצוני

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...