Name: methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules
Uploaded: 2017-05-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules at JoVE.com

Vi takker medlemmer av Ivanov og Anderson labs for deres nyttige diskusjon og tilbakemelding på dette manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health [GM111700 og CA168872 til PA, NS094918 til PI], National Science Centre i Polen [gi UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 til WS]. WS anerkjenner også departementet for vitenskap og høyere utdanning i Polen (Mobility Plus Program) og den polsk-amerikanske Fulbright-kommisjonen for økonomisk støtte til sin forskning i USA.

1. Cellpreparat <ol><li> Legg til autoklaverte dekselplater til 12 brønner på en brønn med 24 brønner, som angitt i figur 1A ; Dette kan gjøres ved å bruke en steril Pasteur pipette festet til et vakuum for å hente hver deksel. Trykk forsiktig på dekslet på siden av brønnen for å frigjøre sugingen, slik at dekslet faller i brønnen. </li><li> Plate 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) osteosarkom celler per brønn ved et sluttvolum på 500 ul medium. Flytt platen side til side og opp og ned f...

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Yamasaki, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+mRNA+translation+during+stress.">Reprogramming mRNA translation during stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).</li><li>Buchan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNP+granules:+Assembly,+function,+and+connections+with+disease.">mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease.</a> RNA Biol. 11 (8), (2014).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+ternary+complex+(eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules.">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li><li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+and+cell+signaling:+more+than+just+a+passing+phase?.">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase?.</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+shuttling+of+TIA-1+accompanies+the+recruitment+of+mRNA+to+mammalian+stress+granules.">Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).</li><li>Bley, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+are+dispensable+for+mRNA+stabilization+during+cellular+stress.">Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 43 (4), e26 (2015).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP-Caprin1-USP10+complexes+mediate+stress+granule+condensation+and+associate+with+40S+subunits.">G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits.</a> J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).</li><li>Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+mammalian+stress+granule+dynamics.">Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics.</a> J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules,+P-bodies+and+cancer.">Stress granules, P-bodies and cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).</li><li>Aulas, A., Van de Velde, ., C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+stress+granule+dynamics+driven+by+TDP-43+and+FUS:+a+link+to+pathological+inclusions+in+ALS?.">Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS?.</a> Front Cell Neurosci. 9, 423 (2015).</li><li>Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulatory+networks+in+immunity.">Post-transcriptional regulatory networks in immunity.</a> Immunol Rev. 253 (1), 253-272 (2013).</li><li>Wolozin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+protein+aggregation+run+amuck:+stress+granules+and+the+genesis+of+neurodegenerative+disease.">Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease.</a> Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).</li><li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+stress+granules+and+P-bodies+during+RNA+virus+infection.">Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).</li><li>Somasekharan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YB-1+regulates+stress+granule+formation+and+tumor+progression+by+translationally+activating+G3BP1.">YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1.</a> J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).</li><li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib,+a+multikinase+inhibitor,+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells.">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. , (2015).</li><li>Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules.">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell Int. 10, 12 (2010).</li><li>Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+ubiquitin-proteasome+system+induces+stress+granule+formation.">Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation.</a> Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).</li><li>Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+activates+HIF-1+to+regulate+vascular+radiosensitivity+in+tumors:+role+of+reoxygenation,+free+radicals,+and+stress+granules.">Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules.</a> Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).</li><li>Szaflarski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vinca+alkaloid+drugs+promote+stress-induced+translational+repression+and+stress+granule+formation.">Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation.</a> Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).</li><li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1.">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li><li>Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+TIA-1+and+TIAR+link+the+phosphorylation+of+eIF-2+alpha+to+the+assembly+of+mammalian+stress+granules.">RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li><li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).</li><li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+method+for+mapping+genes+on+Drosophila+polytene+chromosomes.">Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+characterization+of+stress+granules+in+virus+infected+cells.">Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells.</a> Methods. 90, 57-64 (2015).</li><li>David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emetine+optimally+facilitates+nascent+chain+puromycylation+and+potentiates+the+ribopuromycylation+method+(RPM)+applied+to+inert+cells.">Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells.</a> Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).</li><li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+visualization+and+dynamics+of+newly+synthesized+proteins+in+rat+hippocampal+neurons.">In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).</li><li>Ruggieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+oscillation+of+translation+and+stress+granule+formation+mark+the+cellular+response+to+virus+infection.">Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).</li><li>Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+contribute+to+alpha-globin+homeostasis+in+differentiating+erythroid+cells.">Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).</li><li>Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+RNAi+screen+links+O-GlcNAc+modification+of+ribosomal+proteins+to+stress+granule+and+processing+body+assembly.">A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly.</a> Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).</li><li>Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+regulated+by+arsenate+and+arsenite.">Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite.</a> Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).</li><li>Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+binding+to+proteins.">Arsenic binding to proteins.</a> Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).</li><li>McDonald, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+(TDP-43)+regulates+stress+granule+dynamics+via+differential+regulation+of+G3BP+and+TIA-1.">TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1.</a> Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).</li><li>Aulas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP1+promotes+stress-induced+RNA+granule+interactions+to+preserve+polyadenylated+mRNA.">G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA.</a> J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).</li><li>Martin, S., Tazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+G3BP+stress+granules+dynamics+in+live+primary+cells.">Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li><li>Wippich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+specificity+kinase+DYRK3+couples+stress+granule+condensation/dissolution+to+mTORC1+signaling.">Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling.</a> Cell. 152 (4), 791-805 (2013).</li></ol>

Som påvist ved immunhistologiske studier i flere sykdommer, fører kronisk stress til dannelsen av forskjellige intracellulære foci. For eksempel er de fleste nevrodegenerative sykdommer preget av intracellulære aggregater av uoppløselige proteiner. Tilstedeværelsen av SG-assosierte proteiner i slike aggregater er ofte grunnlaget for å konkludere at slike foci er SG. En lignende konklusjon trekkes også når SG markør-positive cytoplasmatiske foci observeres i celler behandlet med nye stress-stimuli. Denne protok...

Cellene bruker mange mekanismer for å reagere på stress. Noen responser forekommer på post-transkripsjonsnivå og involverer regulering av mRNA-oversettelse og / eller stabilitet 1 , 2 . Stressmodulert mRNA-translasjonsarrest og nedbrytning er assosiert med dannelsen av spesifikke ikke-membrancellulære foci, den mest vel karakteriserte er Stress Granules (SGs) 3 . SG er cytoplasmatiske foci som konsentrerer ikke-translaterende mRNP i translasjonelt-arresterte celler som reagerer på stress ( f.eks. Oksidasjon, varmestokk, næringsstimulering og virusinfeksjon) 4 . I tillegg til ikke-translaterende mRNAer inneholder SGer translationsinitieringsfaktorer, RNA-bindende proteiner og forskjellige signalproteiner 5 . SG er biomarkører av inhibert proteinoversettelse og endret RNA-metabolisme og har vært knyttet til celleoverlevelse og apoptose, signalveiS og kjernekraftprosesser 5 . SG er dynamiske enheter, og deres formasjon er tett knyttet til statusen for mobil oversettelse 6 . Til tross for deres tilsynelatende solide utseende, flytter de fleste SG-proteinkomponenter raskt inn og ut, med en oppholdstid på sekunder. Mens SGs vedvarer i minutter til timer, er de fleste av komponentene i rask flux. Inhiberingen av translationsinitiering og den resulterende demontering av translatoriske polysomer fremmer dannelsen av SG&#39;er; Således er SG i likevekt med å oversette polysomer. Denne polysom ​​/ SG-likevekten er nøkkelen til å skille mellom bona fide SG&#39;er fra andre stress-inducerte foci 6 , 7 . Å arrestere oversettelsesinitiering innebærer konvertering av oversettelseskompetente pre-initieringskomplekser som inneholder mRNA, translasjonsinitieringsfaktorer (eIF) og 40S ribosomale underenheter (s<html> O-kalt 48S-komplekser) til translasjonelt stallede komplekser (såkalte 48S * komplekser) som kan samle seg inn i SG 4 , 6 . SG&#39;er fremmes ved translasjonsarrest ved to forskjellige trinn oppstrøms for 48S kompleks dannelse: interferens med funksjonene til det cap-bindende eIF4F-komplekset ( f.eks. Målrettet mot eIF4A-underenheten) eller fosforylering av a-underenheten av translationsinitieringsfaktor eIF2, formidlet av en Eller flere av de fire eIF2-kinaser. Tilstedeværelsen av stalled 48S-komplekser ( dvs. 40S ribosomale underenheter og utvalgte translationsinitieringsfaktorer) er et kjennetegn for SG 8 , 9 . SG har vært knyttet til ulike patologiske tilstander, for eksempel virusinfeksjoner, neurodegenerasjon, autoimmunitet og kreft 3 , 10 , 11 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . Muterte former av flere SG-komponenter er forbundet med nevrodegenerative sykdommer ( f.eks. Amyotrofisk lateralsklerose) der nevroner viser intracellulære patologiske inneslutninger som kan spille aktive roller i nevronedød 13 . Noen virus kapsler SG-komponenter for å hemme SG-dannelse og for å forsterke viral replikasjon 14 . Nylige studier kobler også SG til kreft 15 og til kreftcelleoverlevelse under kjemo- og strålebehandlinger 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Selv om slike funn har stimulert stor interesse for SG-biologi, mangler mange av de publiserte rapportene viktige kontroller for å skille dannelsen av bona fide SG fra andre stressfremkalte foci. SG ble først beskrevet som ikke-membraniske cytoplasmatiske foci sammensatt av utvalgte mRNA-bindende proteiner (RBPs), inkludert T-celle ntracellulært antigen 1 (TIA-1) og Poly-A-bindingsprotein (PABP); Oversettelse initieringsfaktorer; Polyadenylert mRNA; Og små ribosomale underenheter 4 , 6 , 21 , 22 . Tradisjonelt har deres sammensetning blitt bestemt ved teknikker som immunfarging og det ektopiske uttrykket av fluorescens-merkede proteiner 23 , 24 . På grunn av sin svært dynamiske natur forblir immunokalokalisering av SG-proteiner og / eller mRNAer den definerende metodikken for å detektere SGs 23 , 24 . Til dags dato er mange RBP og andre proteiner (over 120 forskjellige proteiner) beskrevet som SG-komponenter 11 . Så mange SG-lokaliserte proteiner endrer lokaliseringen i både stressavhengig og uavhengig måte og kan akkumulere ved andre intracellulære rom og foci. Det er viktig å velge riktige SG markører og å benytte funksjonelle kriterier for å skille SG fra andre typer stressfremkalt foci. Bona fide SG inneholder mRNA, oversettelse initiasjonsfaktorer og små ribosomale underenheter og er i dynamisk likevekt med oversettelse. Denne enkle arbeidsflyten er utformet for å avgjøre om stressinducerte foci er bona fide SG. Denne arbeidsflyten inkluderer flere eksperimentelle tilnærminger ved hjelp av U2OS-celler, celler som vanligvis brukes til å studere SG&#39;er. Disse cellene er ideelle, da de har en stor cytoplasma, er relativt flate og festes sterkt til glassdeksler. Andre celletyper kan brukes til å studere SG, men det er viktig å være klar over at forskjeller i timing, legemiddelkonsentrasjon og overflod av SG-kjerneproteiner kan endre kinetikken og komposisjonensammensetningen. I tillegg reagerer noen celler på paraformaldehydfiksering ved å danne celleoverflater, og gir deretter et ruffled utseende som forårsaker punktat lokalisering av noen SG markører; Uten grundig analyse kan disse kategoriseres som SG-er. Dette understreker nødvendigheten av å vurdere alle kriteriene som kreves for å identifisere stressinducerte foci som bona fide SG. Vinorelbin (VRB), en kreftbehandling som fremmer SGS 20 , samt Sodium Arsenite (SA), en robust og velkarakterisert SG-induktor, brukes som stress for forsøkene i denne protokollen. Canonical SG inneholder flere SG markører (både proteiner og mRNAer) som kolokaliseres i cytoplasmatiske foci. Denne protokollen bruker både immunofluorescens og fluorescens in situ- hybridisering (FISH) for å detektere lokalisering av proteinmarkører og polyadenylert mRNA 22 . Kort fortalt bruker indirekte immunofluorescens antistoffer ( dvs.e. Primære antistoffer) som er spesifikke for et gitt protein for å oppdage det i cellen. Deretter gjenkjenner sekundære antistoffer (vanligvis artsspesifikke) knyttet til fluorokrom det primære antistoffet og avslører målproteinlokaliseringen. Fluorescerende mikroskopi brukes til å detektere det lokaliserte signalet i cellen. Ved å bruke antistoffer produsert i forskjellige arter og detektere dem med forskjellige farget sekundære antistoffer, muliggjør deteksjon av kolokalisering av flere antistoffer, hvilket indikerer at deres proteinmål er funnet på samme sted 23 . Det er viktig å velge markører som er verifisert for å kolokalisere på bona fide SG. FISH bruker en merket probe som baserer seg til en bestemt RNA- eller DNA-sekvens 25 . For å oppdage mRNA bruker denne protokollen en biotinylert oligo (dT) 40- probe som hybridiserer (eller basepar) til polyA-halen av mRNA ( dvs. polyA FISH). Den biotinylerte sonden blir så detektert ved bruk av fluorescenskonjugert streptavidin, da streptavidin har en høy affinitet for biotin. Ved vurdering av SG er det viktig å koble polyA FISH med immunfluorescens som oppdager en SG-markør, som i bona fide SG, skal de to signalene kolokalisere. Ved hjelp av denne protokollen blir kolokalisering vurdert på flere måter. I et flerkanalsbilde ( dvs. RGB: rødt, grønt og blått) vil kolokalisering endre fargen på det overlappede signalet ( f.eks. Kolokalisert rød og grønn blir gul) 23 . I tillegg kvantifiseres kolokalisering grafisk ved hjelp av linjeskanningsanalyse, hvor intensiteten av hver av fargene måles over en gitt linje 8 , 20 . Denne protokollen beskriver to linjeskanneanalyseprosedyrer ved hjelp av ImageJ 26 . En prosedyre er manuell og går gjennom hele prosessen, hvemDen andre bruker en makro, eller et enkelt program som automatiserer de manuelle trinnene. Det er viktig å gå gjennom det manuelle programmet for å forstå makroprosedyren. SG-skjemaer i celler der oversettelsen er undertrykt; Derfor skal celler med SG-enheter vise reduserte nivåer av global oversettelse sammenlignet med ubehandlede celler. Eksperimentelt brukes ribopuromycylering. Puromycin og emetin blir tilsatt til celler i en kort varighet før fiksering, slik at puromycinet innlemmes i aktivt dannende polypeptider og forårsaker avslutning 27 , 28 . Behandling med emetin er nødvendig for å forhindre re-initiering 29 . Puromycin kan da detekteres ved bruk av anti-puromycin-antistoff, noe som gir et øyeblikksbilde av aktiv oversettelse. Denne metoden brukes fordi den er rask, krever ikke for sulting med et medium som mangler en bestemt aminosyre (og potensielt forspenner cellene), og avslørerSubcellulær lokalisering av protein oversettelse. Andre metoder, spesielt ved bruk av modifiserte aminosyreanaloger, så som metioninanalog-L-azidohomoalain (AHA), kombinert med &quot;click-it&quot; -kjemi 30 , har blitt brukt til å vise at celler som inneholder SG&#39;er, har meget lavere oversettelse enn nærliggende celler 31 . Denne teknikken krever imidlertid metionin sult etterfulgt av pulsmerking i 15-30 minutter. Methionin sult utgjør en ekstra stress, mens den lange merketiden ( dvs. 15-30 min) resulterer i måling av kumulativ snarere enn pågående oversettelse, og tillater også at de nylig syntetiserte proteinene beveger seg fra deres syntese til deres endelige destinasjon innenfor celle. I motsetning er ribopuromycylering mye raskere og er kompatibel med hvilket som helst medium, for eksempel glukosefritt medium som brukes til å indusere SG via glukosestørrelse. Canonical SG er i dynamisk likevektMed aktivt oversette polysomer. Dette kan vurderes eksperimentelt ved å behandle prøver med stoffene som stabiliserer eller destabiliserer polysomer, og dermed tippe balansen mellom SG og polysomer 23 . Sykloheximid (eller emetin, som oppfører seg på samme måte) blokkerer forlengelse ved å &quot;fryse&quot; ribosomer på mRNA, og dermed redusere bassenget av tilgjengelige ikke-polysomale mRNPer som er i stand til å danne SG. Eksperimentelt kan dette brukes på to måter: Ved å legge til cycloheximid (eller emetin) før spenning for å hindre dannelse av SG eller ved å tilsette cykloheximid (eller emetin) etter at SG har dannet, selv uten å fjerne spenningsmiddelet, forårsaker SG-demontering, som stoppet Preinitiasjonskomplekser blir langsomt inntatt i polysomfraksjonen. I motsetning til dette forårsaker puromycin for tidlig avslutning og fremmer polysom-demontering, og øker puljen av initierende mRNAer som er i stand til å samle seg inn i SG. Eksperimentelt øker puromycinbehandlingen antall SG eller senker tresolD hvor de dannes som svar på gradert stress eller legemiddeldosering. Når man vurderer effekten av puromycin, er det viktig å bruke et sub-maksimal nivå av legemiddelet av interesse, da puromycin forventes å øke effekten av legemidlet og øke prosentandelen av celler som viser SG - dette kan ikke skje hvis stoffet / Stress forårsaker SG i 100% av cellene i utgangspunktet. Dette kontrasterer med cycloheximidbehandling, som adskiller SG og fungerer best når ~ 95% av cellene først viser SG, slik at størst mulig reduksjon kan observeres og nøyaktig kvantifiseres. Denne protokollen gir et rammeverk for å studere SG i pattedyrceller. Metoder inkluderer: (1) immunfluorescerende farging og ImageJ analyse for å vurdere kolokaliseringen de klassiske SG-assosierte markørene eIF4G, eIF3b og Ras GTPase-aktiverende proteinbindende protein 1 (G3BP1) i formodede SG&#39;er; (2) oligo (dT) fluorescens in situ hybridisering (polyA FISH) for å detektere polyadenylert mRNA; (3) cykloheximid og puromycinbehandling for å bestemme hvorvidt stressinducerte foci er i dynamisk likevekt med polysomer; Og (4) ribopuromycylering for å vurdere translasjonsstatusen til celler som inneholder formodede SG&#39;er. Sammen kan disse analysene avgjøre om stressinducerte foci kan klassifiseres som bona fide SG.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174;HTB-96&#8482;</td>
			<td>- commonly written as &#34;U2OS&#34; 
			- culture at 37 &#176;C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>- abbreviated DMEM 
			- contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red 
			- supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin 
			- prewarm prior drug(s) dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td>- abbreviated FBS 
			- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline streptomycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tissues</td>
			<td>KIMTECH SCIENCE</td>
			<td>34120</td>
			<td>- commonly called &#34;kimwipes&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>- autoclaved before used 
			- keep sterile in the tissue culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium (meta)arsenite &#8805;90%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7400-100G</td>
			<td>- commonly called sodium arsenite and abbreviated SA 
			- dissolution in water at 1 M concentration, then dilute to 100 &#181;M as a working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>TSZ CHEM</td>
			<td>RS055</td>
			<td>- abbreviated VRB 
			- dissolve in water to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9620</td>
			<td>- used to assess translation level (ribopuromycylation) 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emetine dihydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2375</td>
			<td>- used in combination with puro to assess general translation level 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859</td>
			<td>- abbreviated CHX 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Lonza / VWR</td>
			<td>95042-486</td>
			<td>- abbreviated PBS 
			- wash buffer for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>- make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved 
			- aliquots can be stored at - 20 &#176;C for several months 
			- hazardous, use ventilation 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS</td>
			<td>BDH / VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td>- pre-chilled to -20&#176;C before use 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td>- abbreviated NHS 
			- dilute to 5% in PBS 
			- add sodium azide for storage at 4&#176;C 
			- blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td>
			<td>Decon Labs / VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>- dilute to 70% with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-81940</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- use at 1/100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti eIF4G antibody (H-300)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-11373</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti eIF3&#951; (N-20) antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-16377</td>
			<td>- eIF3&#951; is also known as eIF3b 
			- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti puromycin 12D10 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE343</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-225-150</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/2500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td>- incubate with secondary antibodies 
			-stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light 
			- Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>016-160-084</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions, then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-(dT)40x probe biotinilated</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>/</td>
			<td>- reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20&#176;C 
			- dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use 
			- custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridation box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>- make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom 
			- prewarm the box prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x SSC buffer</td>
			<td>Thermo fisher Ambion</td>
			<td>AM9763</td>
			<td>- dilute to 2X SSC using RNase Free water (DEPC treated) 
			- store at room temperature 
			- wash buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfectHybPlus Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7033-50ml</td>
			<td>- block and probe incubation buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide mounting media</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>- mix 5 g of &#8220;cold-soluble&#8221; poly(vinyl alcohol) in 20 ml of PBS 
			- mix by sonication, followed by stirring overnight at RT 
			- Add 5 ml of glycerol and 0.2 ml of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT 
			- centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet 
			- aliquot viscous liquid, long-term storage at -20&#176;C, 1 week at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>- usually referred as &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-8136-250G</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100ML</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td>- preservative agent for blocking solution and vinol 
			- make a 20 % dilution in water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules

Cellene utfordres ofte av plutselige miljøforandringer. Stresskorn (SG), cytoplasmatiske ribonukleoproteinkomplekser som dannes i celler utsatt for stressforhold, er involvert i ulike aspekter ved cellemetabolisme og overlevelse. SG&#39;er modulerer cellulære signalveier, post-transkripsjonelle genuttrykk og stressresponsprogrammer. Dannelsen av disse mRNA-holdige granulatene er direkte forbundet med cellulær oversettelse. SG-samling utløses av inhibert oversettelse-initiering, og SG-demontering fremmes ved translasjonsaktivering eller ved inhibert translationsforlenging. Dette forholdet blir ytterligere fremhevet av SG-sammensetningen. Core SG-komponenter er stalled-pre-initieringskomplekser, mRNA, og utvalgte RNA-bindende proteiner (RBPs). Formålet med SG-samlingen er å bevare cellulær energi ved å sekvestrere translasjonelt stalled housekeeping mRNAs, slik at den forbedrede translasjonen av stress-responsive proteiner blir mulig. I tilleggPå kjernebestanddelene, som for eksempel stalled translation preinitiation komplekser, inneholder SGer en mengde andre proteiner og signalmolekyler. Defekter i SG-formasjon kan forringe cellulær tilpasning til stress og kan dermed fremme celledød. SG og lignende RNA-holdige granulater har vært knyttet til en rekke humane sykdommer, inkludert nevrodegenerative forstyrrelser og kreft, som fører til den siste interessen for å klassifisere og definere RNA-granulertubtyper. Denne protokollen beskriver analyser for å karakterisere og kvantifisere pattedyr SG.

Stressinducerte foci er ikke nødvendigvis SG. SG er klassifisert som cytoplasmatiske foci som inneholder mRNAer, translationsinitieringsfaktorer og RNA-bindende proteiner og er i likevekt med aktiv oversettelse. Ovennevnte protokoll kan brukes som en mal for å karakterisere om en gitt stress induserer bona fide SG. SG&#39;er kolokaliseres med andre kjente SG markører, inkludert både proteiner og mRNA. SA og VRB in...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules at JoVE.com

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Stress Granuler (SG) er ikke-membraniske cytoplasmatiske strukturer som dannes i celler utsatt for en rekke spenninger. SG inneholder mRNAer, RNA-bindende proteiner, små ribosomale underenheter, translationsrelaterte faktorer og forskjellige cellesignalproteiner. Denne protokollen beskriver en arbeidsflyt som bruker flere eksperimentelle tilnærminger for å oppdage, karakterisere og kvantifisere bona fide SG-er.

Metoder for klassifisering av cytoplasmisk foci som mammalstresskorn

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Visualisering av G3BP Stress Granulat Dynamics i Levende primære celler

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulering av cytoplasmatiske DNA Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; Og<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Metoder for å vurdere subcellulære avdelinger av muskel i<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Comet Assay som et indirekte mål på Systemisk Oksidativt stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...