Name: methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules
Uploaded: 2017-05-12T14:00:00
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Agradecemos aos membros dos laboratórios Ivanov e Anderson por sua útil discussão e feedback sobre este manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde [GM111700 e CA168872 para PA, NS094918 para PI], o National Science Centre na Polônia [concessão UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 para WS]. WS também reconhece o Ministério da Ciência e Educação Superior na Polônia (Programa Mobility Plus) ea Comissão Fulbright polonesa-americana por seu apoio financeiro de sua pesquisa nos EUA.

1. Preparação da Célula <ol><li> Adicionar lamínulas autoclavadas a 12 poços de uma placa de 24 poços, como indicado na Figura 1A ; Isso pode ser feito usando uma pipeta estéril Pasteur anexado a um vácuo para pegar cada lamínula. Toque suavemente a lamela no lado do poço para liberar a sucção, permitindo que a lamela para cair no poço. </li><li> Placa 1 x 10 5 células de osteosarcoma U-2 OS (U2OS) por poço a um volume final de 500 μL de meio. Mova a placa lado a lado e para...

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Conforme evidenciado por estudos imuno-histológicos em múltiplas doenças, o estresse crônico leva à formação de diferentes focos intracelulares. Por exemplo, a maioria das doenças neurodegenerativas é caracterizada por agregados intracelulares de proteínas insolúveis. A presença de proteínas associadas a SG nesses agregados é frequentemente a base para concluir que tais focos são SGs. Uma conclusão semelhante é também tirada quando os focos citoplasmáticos positivos para o marcador SG são observados ...

As células empregam muitos mecanismos para responder ao estresse. Algumas respostas ocorrem no nível pós-transcricional e envolvem a regulação da tradução e / ou estabilidade do mRNA 1 , 2 . A detenção e degradação da tradução do mRNA modulado pelo estresse estão associados com a formação de focos celulares não-membranares específicos, sendo os mais bem caracterizados os Stress Granules (SGs) 3 . As SGs são focos citoplasmáticos que concentram mRNPs não-traduzidos em células arrancadas pela tradução que respondem ao estresse ( por exemplo, oxidação, choque térmico, inanição de nutrientes e infecção viral) 4 . Para além dos mRNAs não traduzidos, os SGs contêm factores de iniciação de tradução, proteínas de ligação a RNA e várias proteínas de sinalização 5 . As SGs são biomarcadores da tradução de proteínas inibidas e do metabolismo do ARN alterado e têm sido associadas à sobrevivência celular e à apoptose, via de sinalizaçãoS e processos nucleares 5 . SGs são entidades dinâmicas, e sua formação está firmemente conectado ao status de tradução celular 6 . Apesar da sua aparência aparentemente sólida, a maioria dos componentes da proteína SG transite rapidamente para dentro e para fora, com um tempo de residência de segundos. Enquanto SGs persistem por minutos a horas, a maioria dos seus componentes estão em fluxo rápido. A inibição da iniciação da tradução ea conseqüente desmontagem dos polissomos de translação promovem a formação de SGs; Assim, as SGs estão em equilíbrio com os polissomas de translação. Este equilíbrio polissômico / SG é fundamental para distinguir SGs bona fide de outros focos induzidos pelo estresse 6,7. A interrupção da iniciação da tradução implica a conversão de complexos de pré-iniciação competentes para a tradução que contêm mRNA, factores de iniciação de tradução (eIF) e subunidades ribossómicas 40S<html> O-chamado 48S complexos) em translacionalmente stalled complexos (chamados 48S * complexos) que podem coalescer em SGs 4 , 6 . As SGs são promovidas por paragem translacional em dois passos diferentes a montante da formação do complexo 48S: interferência com as funções do complexo eIF4F de ligação de tampão ( por exemplo, direccionando a sua subunidade eIF4A) ou fosforilação da subunidade a do factor de iniciação da tradução eIF2, mediada por uma Ou mais das quatro cinases eIF2. A presença de complexos 48S bloqueados ( isto é, subunidades ribossómicas 40S e factores de iniciação de tradução seleccionados) é uma característica dos SG 8 , 9 . SGs foram ligados a vários estados patológicos, tais como infecções virais, neurodegeneração, auto-imunidade e câncer 3 , 10 , 11 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . As formas mutadas de vários componentes SG estão associadas a doenças neurodegenerativas ( por exemplo, esclerose lateral amiotrófica) nas quais os neurônios exibem inclusões patológicas intracelulares que podem desempenhar papéis ativos na morte neuronal 13 . Alguns vírus sequestrar SG componentes para inibir SG formação e para reforçar a replicação viral [ 14] . Estudos recentes também ligam SGs ao cancro 15 e à sobrevivência das células cancerígenas nos tratamentos de quimioterapia e radioterapia 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Embora tais descobertas tenham estimulado grande interesse na biologia da SG, muitos dos relatórios publicados não têm controles importantes para distinguir a formação de SGs de boa-fé de outros focos induzidos pelo estresse. As SGs foram inicialmente descritas como focos citoplasmï¿½icos nï¿½ membranosos compostos de proteï¿½as de ligaï¿½o a mRNA seleccionadas (RBPs), incluindo o antigï¿½io ntracelular de cï¿½ulas T 1 (TIA-1) e Proteï¿½a de Ligaï¿½o a Poli-A (PABP); Factores de iniciação de tradução; MARN poliadenilado; E pequenas subunidades ribossómicas 4 , 6 , 21 , 22 . Tradicionalmente, a sua composição foi determinada por técnicas como a imunocoloração e a expressão ectópica de proteínas com marcação fluorescente 23 , 24 . Devido à sua natureza altamente dinâmica, a imunolocalização de proteínas SG e / ou mRNAs continua a ser a metodologia de definição para a detecção de SGs 23 , 24 . Até à data, muitas RBP e outras proteínas (mais de 120 proteínas distintas) são descritas como SG componentes [ 11] . QuantasAs proteínas G-localizadas alteram a sua localização tanto de uma forma dependente de stress como de uma forma independente e podem acumular-se em outros compartimentos intracelulares e focos, é importante escolher marcadores SG correctos e empregar critérios funcionais para distinguir SGs de outros tipos de stress induzido Focos Bona fide SGs contêm mRNA, fatores de iniciação de tradução e pequenas subunidades ribossômicas e estão em equilíbrio dinâmico com a tradução. Esse fluxo de trabalho simples é projetado para determinar se os focos induzidos pelo estresse são SGs de boa-fé . Este fluxo de trabalho inclui várias abordagens experimentais usando células U2OS, células comumente usadas para estudar SGs. Estas células são ideais, porque têm um citoplasma grande, são relativamente lisas, e atribuem fortemente aos lamínulas de vidro. Outros tipos de células podem ser usados ​​para estudar SGs, mas é importante estar ciente de que as diferenças no tempo, na concentração de fármacos e na abundância de proteínas nucleantes de SG podem alterar a cinética e a composiçãoPosição. Alï¿½ disso, algumas cï¿½ulas respondem ï¿½fixa de paraformaldeï¿½o formando vesï¿½ulas de superfï¿½ie celular, dando, entï¿½, uma aparï¿½cia abaulada que provoca a localizaï¿½o puncata de alguns marcadores SG; Sem uma análise cuidadosa, estes podem ser classificados erroneamente como SGs. Isso destaca a necessidade de avaliar todos os critérios necessários para identificar focos induzidos pelo estresse como SGs de boa-fé . Vinorelbina (VRB), um cancro terapêutico que promove SGs 20 , bem como Sodium Arsenite (SA), um robusto e bem caracterizado SG indutor, são utilizados como stress para as experiências neste protocolo. As SGs canônicas contêm múltiplos marcadores SG (proteínas e mRNAs) que se colocalizam em focos citoplasmáticos. Este protocolo utiliza tanto a imunofluorescência como a hibridização in situ fluorescente (FISH) para detectar a localização de marcadores de proteína e ARNm poliadenilado 22 , respectivamente. Resumidamente, a imunofluorescência indirecta utiliza anticorpos ( i.E. Anticorpos primï¿½ios) especï¿½icos para uma determinada proteï¿½a para a detectar dentro da cï¿½ula. Em seguida, os anticorpos secundários (geralmente específicos de espécies) ligados a fluorocromos reconhecem o anticorpo primário e revelam a localização da proteína alvo. A microscopia fluorescente é utilizada para detectar o sinal localizado dentro da célula. Utilizar anticorpos produzidos em diferentes espécies e detectá-los com anticorpos secundários de cor diferente permite a detecção da colocalização de múltiplos anticorpos, indicando que os alvos proteicos são encontrados no mesmo local 23 . É importante selecionar marcadores que foram verificados para co-localizar em SGs de boa-fé . FISH usa uma sonda marcada que base-pares para uma determinada RNA ou DNA seqüência [ 25] . Para detectar ARNm, este protocolo utiliza uma sonda de oligo (dT) 40 biotinilada que hibrida (ou pares de bases) com a cauda poliA de mRNA ( isto é, poliA FISH). A sonda biotinilada é então detectada utilizando estreptavidina conjugada com fluorescência, uma vez que a estreptavidina tem uma elevada afinidade para a biotina. Ao avaliar SGs, é importante acoplar poliA FISH com imunofluorescência detectando um marcador SG, como em SGs bona fide , os dois sinais devem colocalize. Usando este protocolo, colocalização é avaliada de várias maneiras. Em uma imagem multicanal ( ou seja, RGB: vermelho, verde e azul), a colocalização alterará a cor do sinal sobreposto ( por exemplo, colocalized vermelho e verde aparecem amarelo) 23 . Adicionalmente, a colocalização é quantificada graficamente usando análise de varredura de linha, onde a intensidade de cada cor é medida através de uma dada linha 8 , 20 . Este protocolo descreve dois procedimentos de análise de varredura de linha usando o ImageJ 26 . Um procedimento é manual e passa por todo o processo,O outro usa uma macro, ou um programa simples que automatiza as etapas manuais. É importante passar pelo programa manual para entender o procedimento macro. SGs formam-se em células onde a tradução é reprimida; Portanto, as células com SGs devem exibir níveis diminuídos de tradução global em comparação com células não tratadas. Experimentalmente, utiliza-se ribopuromicilação. A puromicina e a emetina são adicionadas às células durante um curto período de tempo antes da fixação, permitindo que a puromicina se incorpore aos polipéptidos que formam activamente, causando a terminação 27 , 28 . O tratamento com emetina é necessário para prevenir o re-início 29 . A puromicina pode então ser detectada utilizando anticorpo anti-puromicina, dando um instantâneo de tradução activa. Este método é usado porque é rápido, não requer pré-fome com um meio que não tem um aminoácido particular (e potencialmente pretensão das células), e revela aLocalização subcelular de tradução de proteínas. Outros mï¿½odos, nomeadamente utilizando anï¿½ogos de aminoï¿½idos modificados, tais como o anï¿½ogo de metionina L-azidohomoalaina (AHA), acoplados com a quï¿½ica &quot;click-it&quot; 30 , foram utilizados para mostrar que as cï¿½ulas contendo SG apresentam uma traduï¿½o muito mais baixa do que as cï¿½ulas vizinhas 31 . No entanto, esta técnica requer inanição de metionina seguida de marcação por impulsos durante 15-30 min. A privação de metionina constitui um estresse adicional, enquanto que o longo tempo de marcação ( isto é, 15-30 min) resulta na medição de tradução cumulativa em vez de contínua e também permite que as proteínas recém-sintetizadas se movam do seu local de síntese para o seu destino final dentro do célula. Em contraste, a ribopuromicilação é muito mais rápida e é compatível com qualquer meio, tal como o meio isento de glucose utilizado para induzir SGs através de inanição de glucose. As SGs canônicas estão em equilíbrio dinâmicoCom tradução activa de polissomas. Isto pode ser avaliado experimentalmente por tratamento de amostras com os fármacos que estabilizam ou desestabilizam polissomas, inclinando assim o equilíbrio entre SGs e polissomas 23 . A ciclo-heximida (ou emetina, que se comporta de modo semelhante) bloqueia o alongamento por &quot;congelamento&quot; de ribossomas no mRNA, diminuindo assim o conjunto de mRNPs não polissómicos disponíveis capazes de formar SGs. Experimentalmente, isto pode ser usado de duas maneiras: pela adição de cicloheximida (ou emetina) antes da tensão para prevenir a formação de SG ou pela adição de cicloheximida (ou emetina) após a formação das SGs, mesmo sem remover o agente estressante, causando a desmontagem da SG Os complexos de pré-iniciação são lentamente admitidos na fracção de polissomo. Em contraste, a puromicina provoca a terminação prematura e promove a desmontagem do polissomo, aumentando o conjunto de mRNAs iniciadores capazes de se reunirem em SGs. Experimentalmente, o tratamento com puromicina aumenta o número de SGs ou reduz oD em que se formam em resposta ao stress graduado ou dose de fármaco. Ao avaliar o efeito da puromicina, é importante utilizar um nível sub-máximo do fármaco de interesse, uma vez que se espera que a puromicina aumente o efeito do fármaco e aumente a percentagem de células apresentando SGs - isto não pode ocorrer se o fármaco / Estresse provoca SGs em 100% das células inicialmente. Isto contrasta com o tratamento com cicloheximida, que desmonta as SGs e funciona melhor quando ~ 95% das células inicialmente exibem SGs de modo que a maior diminuição possível pode ser observada e quantificada com precisão. Este protocolo proporciona uma estrutura para estudar SGs em células de mamíferos. Os métodos incluem: (1) coloraï¿½o imunofluorescente e anï¿½ise de ImageJ para avaliar a colocalizaï¿½o dos marcadores SG-associados eIF4G, eIF3b e proteï¿½a de ligaï¿½o de proteï¿½a 1 activadora de Ras GTPase (G3BP1) em SGs putativas; (2) hibridação in situ de fluorescência de oligo (dT) (poliA FISH) para detectar ARNm poliadenilado; (3) tratamento com ciclo-heximida e puromicina para determinar se os focos induzidos pelo estresse estão em equilíbrio dinâmico com polissomos; E (4) ribopuromicilação para avaliar o estado de translação de células contendo SGs putativas. Juntos, estes ensaios podem determinar se os focos induzidos pelo stress podem ser classificados como SGs de boa-fé .

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174;HTB-96&#8482;</td>
			<td>- commonly written as &#34;U2OS&#34; 
			- culture at 37 &#176;C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>- abbreviated DMEM 
			- contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red 
			- supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin 
			- prewarm prior drug(s) dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td>- abbreviated FBS 
			- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline streptomycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tissues</td>
			<td>KIMTECH SCIENCE</td>
			<td>34120</td>
			<td>- commonly called &#34;kimwipes&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>- autoclaved before used 
			- keep sterile in the tissue culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium (meta)arsenite &#8805;90%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7400-100G</td>
			<td>- commonly called sodium arsenite and abbreviated SA 
			- dissolution in water at 1 M concentration, then dilute to 100 &#181;M as a working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>TSZ CHEM</td>
			<td>RS055</td>
			<td>- abbreviated VRB 
			- dissolve in water to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9620</td>
			<td>- used to assess translation level (ribopuromycylation) 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emetine dihydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2375</td>
			<td>- used in combination with puro to assess general translation level 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859</td>
			<td>- abbreviated CHX 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Lonza / VWR</td>
			<td>95042-486</td>
			<td>- abbreviated PBS 
			- wash buffer for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>- make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved 
			- aliquots can be stored at - 20 &#176;C for several months 
			- hazardous, use ventilation 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS</td>
			<td>BDH / VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td>- pre-chilled to -20&#176;C before use 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td>- abbreviated NHS 
			- dilute to 5% in PBS 
			- add sodium azide for storage at 4&#176;C 
			- blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td>
			<td>Decon Labs / VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>- dilute to 70% with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-81940</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- use at 1/100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti eIF4G antibody (H-300)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-11373</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti eIF3&#951; (N-20) antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-16377</td>
			<td>- eIF3&#951; is also known as eIF3b 
			- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti puromycin 12D10 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE343</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-225-150</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/2500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td>- incubate with secondary antibodies 
			-stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light 
			- Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>016-160-084</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions, then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-(dT)40x probe biotinilated</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>/</td>
			<td>- reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20&#176;C 
			- dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use 
			- custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridation box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>- make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom 
			- prewarm the box prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x SSC buffer</td>
			<td>Thermo fisher Ambion</td>
			<td>AM9763</td>
			<td>- dilute to 2X SSC using RNase Free water (DEPC treated) 
			- store at room temperature 
			- wash buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfectHybPlus Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7033-50ml</td>
			<td>- block and probe incubation buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide mounting media</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>- mix 5 g of &#8220;cold-soluble&#8221; poly(vinyl alcohol) in 20 ml of PBS 
			- mix by sonication, followed by stirring overnight at RT 
			- Add 5 ml of glycerol and 0.2 ml of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT 
			- centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet 
			- aliquot viscous liquid, long-term storage at -20&#176;C, 1 week at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>- usually referred as &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-8136-250G</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100ML</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td>- preservative agent for blocking solution and vinol 
			- make a 20 % dilution in water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules

As células são muitas vezes desafiadas por mudanças ambientais súbitas. Os grï¿½ulos de stress (SGs), complexos de ribonucleoproteï¿½a citoplasmï¿½icos que se formam em cï¿½ulas expostas a condiï¿½es de stress, estï¿½ implicados em vï¿½ios aspectos do metabolismo celular e sobrevivï¿½cia. As SGs modulam as vias de sinalização celular, expressão de genes pós-transcricionais e programas de resposta ao estresse. A formação destes grânulos contendo mRNA está directamente ligada à tradução celular. SG é desencadeada por inibição da iniciação da tradução e a desmontagem SG é promovida por ativação da tradução ou por alongamento da tradução inibida. Esta relação é ainda mais realçada pela composição da SG. Os componentes Core SG são complexos de pré-iniciação de tradução paralisados, ARNm e proteínas de ligação a RNA seleccionadas (RBPs). A finalidade da montagem do SG é conservar a energia celular sequestrando mRNAs arranjados da manutenção da tradução, permitindo a tradução realçada de proteínas stress-responsivas. Em additiSobre os constituintes do núcleo, tais como complexos de pré-iniciação de tradução paralisada, as SGs contêm uma multiplicidade de outras proteínas e moléculas de sinalização. Defeitos na formação de SG podem prejudicar a adaptação celular ao estresse e, assim, podem promover a morte celular. SGs e grï¿½ulos contendo ARN semelhantes foram ligados a vï¿½ias doenï¿½s humanas, incluindo distï¿½bios neurodegenerativos e cancro, levando ao interesse recente na classificaï¿½o e definiï¿½o de subtipos de grï¿½ulos de ARN. Este protocolo descreve ensaios para caracterizar e quantificar SGs de mamíferos.

Os focos induzidos pelo estresse não são necessariamente SGs. As SGs são classificadas como focos citoplasmáticos que contêm mRNAs, factores de iniciação de tradução e proteínas de ligação ao ARN e estão em equilíbrio com a tradução activa. O protocolo acima pode ser usado como um modelo para caracterizar se um determinado estresse induz SGs bona fide . SGs colocalize com outros marcadores SG conhecido...

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Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Os grânulos de estresse (SGs) são estruturas citoplasmáticas não-membranosas que se formam em células expostas a uma variedade de tensões. As SGs contêm mRNAs, proteínas de ligação a RNA, subunidades ribossómicas pequenas, factores relacionados com a tradução e várias proteínas de sinalização celular. Este protocolo descreve um fluxo de trabalho que utiliza várias abordagens experimentais para detectar, caracterizar e quantificar SGs de boa-fé .

Métodos para classificar os focos citoplasmáticos como grânulos de estresse de mamíferos

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Research

JoVE Journal

Biology

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