Name: methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules
Uploaded: 2017-05-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules at JoVE.com

Vi tackar medlemmarna av Ivanov och Anderson labs för deras användbara diskussion och feedback på detta manuskript. Detta arbete stöddes av National Institute of Health [GM111700 och CA168872 till PA, NS094918 till PI], National Science Center i Polen [bevilja UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054 till WS]. WS erkänner också ministeriet för vetenskap och högre utbildning i Polen (Mobility Plus Program) och den polskamerikanska Fulbright-kommissionen för deras ekonomiska stöd till sin forskning i USA.

1. Cellberedning <ol><li> Lägg till autoklaverade täckglas till 12 brunnar i en 24-brunnsplatta, såsom indikeras i Figur 1A ; Detta kan göras med en steril Pasteur pipette fäst vid ett vakuum för att plocka upp varje täckglas. Tryck försiktigt på täckglaset på sidan av brunnen för att släppa suget, så att täckglaset faller i brunnen. </li><li> Platta 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) osteosarkomceller per brunn vid en slutlig volym av 500 | il medium. Flytta plattan sida till sida och u...

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Yamasaki, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+mRNA+translation+during+stress.">Reprogramming mRNA translation during stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).</li><li>Buchan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNP+granules:+Assembly,+function,+and+connections+with+disease.">mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease.</a> RNA Biol. 11 (8), (2014).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+ternary+complex+(eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules.">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li><li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+and+cell+signaling:+more+than+just+a+passing+phase?.">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase?.</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+shuttling+of+TIA-1+accompanies+the+recruitment+of+mRNA+to+mammalian+stress+granules.">Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).</li><li>Bley, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+are+dispensable+for+mRNA+stabilization+during+cellular+stress.">Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 43 (4), e26 (2015).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP-Caprin1-USP10+complexes+mediate+stress+granule+condensation+and+associate+with+40S+subunits.">G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits.</a> J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).</li><li>Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+mammalian+stress+granule+dynamics.">Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics.</a> J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules,+P-bodies+and+cancer.">Stress granules, P-bodies and cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).</li><li>Aulas, A., Van de Velde, ., C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+stress+granule+dynamics+driven+by+TDP-43+and+FUS:+a+link+to+pathological+inclusions+in+ALS?.">Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS?.</a> Front Cell Neurosci. 9, 423 (2015).</li><li>Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulatory+networks+in+immunity.">Post-transcriptional regulatory networks in immunity.</a> Immunol Rev. 253 (1), 253-272 (2013).</li><li>Wolozin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+protein+aggregation+run+amuck:+stress+granules+and+the+genesis+of+neurodegenerative+disease.">Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease.</a> Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).</li><li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+stress+granules+and+P-bodies+during+RNA+virus+infection.">Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).</li><li>Somasekharan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YB-1+regulates+stress+granule+formation+and+tumor+progression+by+translationally+activating+G3BP1.">YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1.</a> J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).</li><li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib,+a+multikinase+inhibitor,+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells.">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. , (2015).</li><li>Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules.">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell Int. 10, 12 (2010).</li><li>Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+ubiquitin-proteasome+system+induces+stress+granule+formation.">Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation.</a> Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).</li><li>Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+activates+HIF-1+to+regulate+vascular+radiosensitivity+in+tumors:+role+of+reoxygenation,+free+radicals,+and+stress+granules.">Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules.</a> Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).</li><li>Szaflarski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vinca+alkaloid+drugs+promote+stress-induced+translational+repression+and+stress+granule+formation.">Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation.</a> Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).</li><li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1.">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li><li>Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+TIA-1+and+TIAR+link+the+phosphorylation+of+eIF-2+alpha+to+the+assembly+of+mammalian+stress+granules.">RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li><li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).</li><li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+method+for+mapping+genes+on+Drosophila+polytene+chromosomes.">Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+characterization+of+stress+granules+in+virus+infected+cells.">Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells.</a> Methods. 90, 57-64 (2015).</li><li>David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emetine+optimally+facilitates+nascent+chain+puromycylation+and+potentiates+the+ribopuromycylation+method+(RPM)+applied+to+inert+cells.">Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells.</a> Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).</li><li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+visualization+and+dynamics+of+newly+synthesized+proteins+in+rat+hippocampal+neurons.">In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).</li><li>Ruggieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+oscillation+of+translation+and+stress+granule+formation+mark+the+cellular+response+to+virus+infection.">Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).</li><li>Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+contribute+to+alpha-globin+homeostasis+in+differentiating+erythroid+cells.">Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).</li><li>Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+RNAi+screen+links+O-GlcNAc+modification+of+ribosomal+proteins+to+stress+granule+and+processing+body+assembly.">A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly.</a> Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).</li><li>Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+regulated+by+arsenate+and+arsenite.">Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite.</a> Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).</li><li>Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+binding+to+proteins.">Arsenic binding to proteins.</a> Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).</li><li>McDonald, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+(TDP-43)+regulates+stress+granule+dynamics+via+differential+regulation+of+G3BP+and+TIA-1.">TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1.</a> Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).</li><li>Aulas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP1+promotes+stress-induced+RNA+granule+interactions+to+preserve+polyadenylated+mRNA.">G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA.</a> J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).</li><li>Martin, S., Tazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+G3BP+stress+granules+dynamics+in+live+primary+cells.">Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li><li>Wippich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+specificity+kinase+DYRK3+couples+stress+granule+condensation/dissolution+to+mTORC1+signaling.">Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling.</a> Cell. 152 (4), 791-805 (2013).</li></ol>

Som framgår av immunohistologiska studier i flera sjukdomar leder kronisk stress till bildandet av olika intracellulära foci. Till exempel kännetecknas de flesta neurodegenerativa sjukdomar av intracellulära aggregat av olösliga proteiner. Närvaron av SG-associerade proteiner i sådana aggregat är ofta grunden för att dra slutsatsen att sådana foci är SG. En liknande slutsats dras också när SG-markör-positiva cytoplasmatiska foci observeras i celler som behandlas med nya spänningsstimuli. Detta protokoll g...

Celler använder många mekanismer för att reagera på stress. Vissa svar uppträder på post-transkriptionsnivå och involverar reglering av mRNA-översättning och / eller stabilitet 1 , 2 . Stressmodulerad mRNA-translationell arrestering och nedbrytning är associerad med bildandet av specifika icke-membrancelliga foci, den mest välkännade som Stress Granules (SGs) 3 . SG är cytoplasmatiska foci som koncentrerar icke-translaterande mRNP i translationellt-arresterade celler som svarar på stress ( t.ex. oxidation, värmechock, näringsstörning och virusinfektion) 4 . Förutom icke-translaterande mRNA innehåller SG: s translationsinitieringsfaktorer, RNA-bindande proteiner och olika signaleringsproteiner 5 . SG är biomarkörer av inhiberad proteintranslation och förändrad RNA-metabolism och har kopplats till cellöverlevnad och apoptos, signalvägenS och kärnprocesser 5 . SG är dynamiska enheter, och deras bildning är starkt kopplad till statusen för cellulär översättning 6 . Trots sitt till synes sola utseende, transporterar de flesta SG-proteinkomponenterna snabbt in och ut, med en uppehållstid på sekunder. Medan SGs kvarstår i minuter till timmar, är de flesta av deras komponenter i snabb flöde. Inhiberingen av translationsinitiering och den därmed följande demonteringen av translerande polysomer främjar bildandet av SG; Sålunda står SG i jämvikt med översättningen av polysomer. Denna polysom ​​/ SG-jämvikt är nyckeln till att skilja bona fide SG från andra stressinducerade foci 6 , 7 . Hållande translationsinitiering innebär omvandling av översättningskompetenta förinitieringskomplex som innehåller mRNA, translationsinitieringsfaktorer (eIF) och 40S ribosomala subenheter (s<html> O-kallade 48S-komplex) till translationellt stoppade komplex (så kallade 48S * komplex) som kan samlas i SG 4 , 6 . SG s främjas genom translationell anhållning i två olika steg uppströms 48S komplexbildning: störning av funktionerna hos det kaps-bindande eIF4F-komplexet ( t.ex. inriktning på dess eIF4A-subenhet) eller fosforylering av a-underenheten för translationsinitieringsfaktor eIF2, medierad av en Eller flera av de fyra eIF2-kinaserna. Närvaron av stalled 48S-komplex ( dvs 40S ribosomala underenheter och valda translationsinitieringsfaktorer) är ett kännetecken för SGs 8 , 9 . SG har kopplats till olika patologiska tillstånd, såsom virusinfektioner, neurodegeneration, autoimmunitet och cancer 3 , 10 , 11 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . Muterade former av flera SG-komponenter är associerade med neurodegenerativa sjukdomar ( t.ex. amyotrofisk lateralskleros), i vilken neuroner uppvisar intracellulära patologiska inklusioner som kan spela aktiva roller vid neuronal död 13 . Vissa virus kapar SG-komponenter för att hämma SG-bildning och för att förbättra viral replikation 14 . Tidigare studier kopplar också SG till cancer 15 och till cancercellsöverlevnad under kemo- och strålbehandlingsterapi 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 . Även om sådana fynd har stimulerat stort intresse för SG-biologi, saknar många av de publicerade rapporterna viktiga kontroller för att särskilja bildandet av bona fide SG från andra stressinducerade foci. SGs beskrivs initialt som icke-membrantiska cytoplasmatiska foci sammansatta av utvalda mRNA-bindande proteiner (RBP), innefattande T-cell-ntracellulärt antigen 1 (TIA-1) och poly-A-bindande protein (PABP); Översättning initieringsfaktorer; Polyadenylerad mRNA; Och små ribosomala subenheter 4 , 6 , 21 , 22 . Traditionellt har deras komposition bestämts medelst tekniker såsom immunförstärkning och det ektopiska uttrycket av fluorescensmärkta proteiner 23 , 24 . På grund av sin högt dynamiska natur förblir immunokalokalisering av SG-proteiner och / eller mRNA den avgränsande metoden för detektering av SGs 23 , 24 . Hittills beskrivs många RBP och andra proteiner (över 120 distinkta proteiner) som SG-komponenter 11 . Så många SG-lokaliserade proteiner ändrar lokaliseringen både på ett stressberoende och ett oberoende sätt och kan ackumuleras vid andra intracellulära fack och foci. Det är viktigt att välja rätt SG-markörer och att använda funktionella kriterier för att skilja SG från andra typer av stressinducerad foci. Bona fide SG innehåller mRNA, translationsinitieringsfaktorer och små ribosomala subenheter och är i dynamisk jämvikt med translation. Detta enkla arbetsflöde är utformat för att bestämma huruvida stressinducerade foci är bona fide SG. Detta arbetsflöde innehåller flera experimentella tillvägagångssätt med U2OS-celler, celler som vanligtvis används för att studera SG. Dessa celler är idealiska, eftersom de har en stor cytoplasma, är relativt platta och fäster starkt på glasöverdrag. Andra celltyper kan användas för att studera SG, men det är viktigt att vara medveten om att skillnader i timing, läkemedelskoncentration och överflöd av SG-kärnbildande proteiner kan förändra kinetiken och komposition. Dessutom svarar vissa celler på paraformaldehydfixering genom att bilda cellytor, vilket ger ett ruffled utseende som orsakar punktatlokalisering av vissa SG-markörer; Utan noggrann analys kan dessa kategoriseras som SG: er. Detta belyser behovet av att bedöma alla kriterier som krävs för att identifiera stressinducerade foci som bona fide SG. Vinorelbine (VRB), en cancerterapeutisk som främjar SGs 20 , liksom natrium arsenit (SA), en robust och välkarakteriserad SG-inducerare, används som stress för experimenten i detta protokoll. Canonical SG innehåller flera SG-markörer (både proteiner och mRNA) som kolokaliserar i cytoplasmatiska foci. Detta protokoll använder både immunofluorescens och fluorescens in situ- hybridisering (FISH) för att detektera lokaliseringen av proteinmarkörer respektive polyadenylerade mRNA 22 . Kortfattat använder indirekt immunofluorescens antikroppar ( dvs.e. Primära antikroppar) specifika för ett givet protein för att detektera det i cellen. Därefter känner sekundära antikroppar (vanligtvis speciesspecifika) bundna till fluorokromer den primära antikroppen och avslöjar målproteinlokaliseringen. Fluorescerande mikroskopi används för att detektera den lokaliserade signalen i cellen. Användning av antikroppar producerade i olika arter och detektering av dem med olika färgade sekundära antikroppar möjliggör detektion av kolokalisering av flera antikroppar, vilket indikerar att deras proteinmål återfinns på samma plats 23 . Det är viktigt att välja markörer som har verifierats för att kolokalisera på bona fide SG. FISH använder en märkt sond som baspar till en specifik RNA- eller DNA-sekvens 25 . För att detektera mRNA använder detta protokoll en biotinylerad oligo (dT) 40- sond som hybridiserar (eller baspar) till polyA-svansen av mRNA ( dvs polyA FISH). Den biotinylerade proben detekteras sedan med fluorescenskonjugerad streptavidin, eftersom streptavidin har en hög affinitet för biotin. Vid bedömning av SG, är det viktigt att koppla polyA FISH med immunofluorescens som detekterar en SG-markör, som i bona fide SG, bör de båda signalerna kolokalisera. Med hjälp av detta protokoll utvärderas kolokalisering på flera sätt. I en flerkanalig ( dvs. RGB: röd, grön och blå) bild kommer kolokalisering att ändra färg på den överlappade signalen ( t.ex. kolokaliserad röd och grön blir gult) 23 . Dessutom kvantifieras kolokalisering grafiskt med hjälp av linjeskanningsanalys, där intensiteten hos varje färg mäts över en given linje 8 , 20 . Detta protokoll beskriver två linjeskanningsanalysprocedurer med hjälp av ImageJ 26 . Ett förfarande är manuellt och går igenom hela processen, whiDen andra använder ett makro eller ett enkelt program som automatiserar de manuella stegen. Det är viktigt att gå igenom det manuella programmet för att förstå makroproceduren. SG-blanketter i celler där översättning är undertryckt; Celler med SG bör därför visa minskade nivåer av global översättning jämfört med obehandlade celler. Experimentellt används ribopuromycylering. Puromycin och emetin tillsätts till celler under en kort varaktighet före fixering, vilket medger att puromycinet införlivas i aktivt bildande polypeptider, vilket orsakar avslutning 27 , 28 . Behandling med emetin krävs för att förhindra återinitiering 29 . Puromycin kan sedan detekteras med anti-puromycinantikropp, vilket ger en ögonblicksbild av aktiv översättning. Denna metod används eftersom den är snabb, kräver inte försvältande med ett medium som saknar en viss aminosyra (och potentiellt förspänner cellerna) och avslöjarSubcellulär lokalisering av proteintranslation. Andra förfaranden, särskilt med användning av modifierade aminosyraanaloger, såsom metioninanalog-L-azidohomoalain (AHA), kopplad med &quot;click-it&quot; -kemi 30 , har använts för att visa att celler innehållande SGs uppvisar mycket lägre översättning än närliggande celler 31 . Denna teknik kräver emellertid metionin-svält följt av pulsmärkning i 15-30 min. Methionin-svält utgör en extra stress, medan den långa märkningstiden ( dvs. 15-30 min) resulterar i mätning av kumulativ snarare än pågående översättning och gör det också möjligt för de nyssyntetiserade proteinerna att flytta från deras syntesplats till deras slutliga destination inom cell. I motsats härtill är ribopuromycylering mycket snabbare och är kompatibel med vilket som helst medium, såsom det glukosfria mediet som används för att inducera SG genom glukoshushållning. Canonical SGs är i dynamisk jämviktMed aktivt översättande av polysomer. Detta kan utvärderas experimentellt genom att behandla prover med de läkemedel som stabiliserar eller destabiliserar polysomer och därigenom tippar balansen mellan SG och polysomer 23 . Cykloheximid (eller emetin, som beter sig på liknande sätt) blockerar töjningen genom att &quot;frysa&quot; ribosomer på mRNA, vilket minskar poolen av tillgängliga icke-polysomala mRNP som kan bilda SG. Experimentellt kan detta användas på två sätt: genom tillsats av cykloheximid (eller emetin) före stress för att förhindra SG-bildning eller genom att tillsätta cykloheximid (eller emetin) efter det att SG har bildat, även utan att avlägsna stressmedlet, vilket orsakar SG-demontering, Preinitiationskomplex tas långsamt in i polysomfraktionen. I motsats härtill orsakar puromycin för tidig uppsägning och främjar polysomdisolering, vilket ökar poolen av initierande mRNA som kan monteras i SG. Experimentellt ökar puromycinbehandlingen antalet SG eller sänker tresolenD vid vilken de bildas som svar på graderad stress eller läkemedelsdosering. Vid bedömning av effekten av puromycin är det viktigt att använda en sub-maximal nivå av läkemedlet av intresse, eftersom puromycin förväntas öka verkan av läkemedlet och öka andelen celler som uppvisar SG - det kan inte ske om drogen / Stress orsakar SG i 100% av cellerna initialt. Detta står i kontrast till cykloheximidbehandling, som demonterar SG och fungerar bäst när ~ 95% av cellerna initialt visar SG så att den största möjliga minskningen kan observeras och kvantifieras exakt. Detta protokoll tillhandahåller en ram för att studera SG i däggdjursceller. Metoder innefattar: (1) immunofluorescerande färgning och ImageJ-analys för att utvärdera kolokaliseringen av de klassiska SG-associerade markörerna eIF4G, eIF3b och Ras GTPase-aktiverande proteinbindande protein 1 (G3BP1) i förmodade SG; (2) oligo (dT) fluorescens in situ hybridisering (polyA FISH) för att detektera polyadenylerat mRNA; (3) cykloheximid- och puromycinbehandling för att bestämma huruvida stressinducerad foci är i dynamisk jämvikt med polysomer; Och (4) ribopuromycylering för att bedöma den translationella statusen hos celler som innehåller förmodade SGs. Tillsammans kan dessa analyser avgöra om stressinducerad foci kan klassificeras som bona fide SG.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174;HTB-96&#8482;</td>
			<td>- commonly written as &#34;U2OS&#34; 
			- culture at 37 &#176;C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>- abbreviated DMEM 
			- contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red 
			- supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin 
			- prewarm prior drug(s) dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td>- abbreviated FBS 
			- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline streptomycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tissues</td>
			<td>KIMTECH SCIENCE</td>
			<td>34120</td>
			<td>- commonly called &#34;kimwipes&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>- autoclaved before used 
			- keep sterile in the tissue culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium (meta)arsenite &#8805;90%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7400-100G</td>
			<td>- commonly called sodium arsenite and abbreviated SA 
			- dissolution in water at 1 M concentration, then dilute to 100 &#181;M as a working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>TSZ CHEM</td>
			<td>RS055</td>
			<td>- abbreviated VRB 
			- dissolve in water to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9620</td>
			<td>- used to assess translation level (ribopuromycylation) 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emetine dihydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2375</td>
			<td>- used in combination with puro to assess general translation level 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859</td>
			<td>- abbreviated CHX 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Lonza / VWR</td>
			<td>95042-486</td>
			<td>- abbreviated PBS 
			- wash buffer for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>- make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved 
			- aliquots can be stored at - 20 &#176;C for several months 
			- hazardous, use ventilation 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS</td>
			<td>BDH / VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td>- pre-chilled to -20&#176;C before use 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td>- abbreviated NHS 
			- dilute to 5% in PBS 
			- add sodium azide for storage at 4&#176;C 
			- blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td>
			<td>Decon Labs / VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>- dilute to 70% with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-81940</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- use at 1/100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti eIF4G antibody (H-300)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-11373</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti eIF3&#951; (N-20) antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-16377</td>
			<td>- eIF3&#951; is also known as eIF3b 
			- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti puromycin 12D10 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE343</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-225-150</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/2500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td>- incubate with secondary antibodies 
			-stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light 
			- Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>016-160-084</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions, then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-(dT)40x probe biotinilated</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>/</td>
			<td>- reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20&#176;C 
			- dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use 
			- custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridation box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>- make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom 
			- prewarm the box prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x SSC buffer</td>
			<td>Thermo fisher Ambion</td>
			<td>AM9763</td>
			<td>- dilute to 2X SSC using RNase Free water (DEPC treated) 
			- store at room temperature 
			- wash buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfectHybPlus Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7033-50ml</td>
			<td>- block and probe incubation buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide mounting media</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>- mix 5 g of &#8220;cold-soluble&#8221; poly(vinyl alcohol) in 20 ml of PBS 
			- mix by sonication, followed by stirring overnight at RT 
			- Add 5 ml of glycerol and 0.2 ml of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT 
			- centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet 
			- aliquot viscous liquid, long-term storage at -20&#176;C, 1 week at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>- usually referred as &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-8136-250G</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100ML</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td>- preservative agent for blocking solution and vinol 
			- make a 20 % dilution in water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules

Celler utmanas ofta av plötsliga miljöförändringar. Stresskorn (SG), cytoplasmatiska ribonukleoproteinkomplex som bildar sig i celler utsatta för stressförhållanden, är inblandade i olika aspekter av cellmetabolism och överlevnad. SG: er modulerar cellulära signaleringsvägar, post-transkriptionella genuttryck och stressresponsprogram. Bildningen av dessa mRNA-innehållande granuler är direkt kopplad till cellulär translation. SG-sammansättningen utlöses genom inhiberad translationsinitiering och SG-demontering promoteras genom translationaktivering eller genom inhiberad translationsöjning. Detta förhållande framhävs ytterligare av SG-sammansättningen. Core SG-komponenter är stallade translationsförinitieringskomplex, mRNA och utvalda RNA-bindande proteiner (RBP). Syftet med SG-montering är att bevara cellulär energi genom att sekvestrera translationellt stalled hushålls-mRNA, vilket möjliggör förhöjd översättning av stress-responsiva proteiner. I additiPå kärnkomponenterna, såsom stalled translation preinitiation complexes, innehåller SGs en uppsjö av andra proteiner och signalmolekyler. Defekter i SG-bildning kan försämra cellulär anpassning till stress och kan därmed främja celldöd. SG och liknande RNA-innehållande granuler har kopplats till ett antal humana sjukdomar, inklusive neurodegenerativa störningar och cancer, vilket leder till den senaste intressen att klassificera och definiera RNA-granulatsubtyper. Detta protokoll beskriver analyser för att karakterisera och kvantifiera däggdjurs SGs.

Stressinducerad foci är inte nödvändigtvis SGs. SGs klassificeras som cytoplasmatiska foci som innehåller mRNA, translationinitieringsfaktorer och RNA-bindande proteiner och är i jämvikt med aktiv översättning. Ovanstående protokoll kan användas som en mall för att karakterisera huruvida en given stress inducerar bona fide SG. SG-koalokaliserar med andra kända SG-markörer, innefattande både proteiner och...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules at JoVE.com

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Stress Granuler (SGs) är icke-membranformiga cytoplasmatiska strukturer som bildas i celler utsatta för en mängd stress. SG innehåller mRNA, RNA-bindande proteiner, små ribosomala subenheter, translationsrelaterade faktorer och olika cellsignalproteiner. I det här protokollet beskrivs ett arbetsflöde som använder flera experimentella metoder för att upptäcka, karakterisera och kvantifiera bona fide SG.

Metoder för att klassificera cytoplasmiska foci som däggdjursstresskorn

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Trypsinizing och Odling däggdjursceller

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Kvantifiering av γH2AX Foci som svar på joniserande strålning

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

Kvantifiering av γH2AX foci i vävnadsprover

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Aktivering av apoptos genom cytoplasmiska mikroinjektion av cytokrom C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Visualisering av G3BP Stress Granulat Dynamics i Live Primärceller

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulering av Cytoplasmatiska DNA Sensing Pathways<em&gt; In Vitro</em&gt; Och<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Metoder för att bedöma Subcellulära Fack för Muscle in<em&gt; C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Comet analys som ett indirekt mått på system oxidativ stress

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...