Name: methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules
Uploaded: 2017-05-12T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules at JoVE.com

Bu el yazması üzerine faydalı tartışmalar ve geribildirimler için Ivanov ve Anderson laboratuvarlarının üyelerine teşekkür ediyoruz. Bu çalışma, Ulusal Sağlık Enstitüleri tarafından desteklendi [WP için GM111700 ve CA168872, PI için NS094918], Polonya Ulusal Bilim Merkezi [WS&#39;ye hibe UMO-2012/06 / M / NZ3 / 00054]. WS ayrıca, Polonya&#39;daki Bilim ve Yüksek Öğrenim Bakanlığı (Mobility Plus Programı) ve Lehçe-Amerikalı Fulbright Komisyonu&#39;nu ABD&#39;deki araştırmasına maddi destek verdiği için onayladı.

1. Hücre Hazırlama <ol><li> Şekil 1A&#39;da belirtildiği gibi otoklavlanmış lamelleri, 24 delikli bir plakanın 12 kuyucuğuna ekleyin; Bu, her lamelleri almak için bir vakuma tutturulmuş steril bir Pasteur pipeti kullanılarak yapılabilir. Lamerlerin kuyuya düşmesine izin vermek için emmeyi serbest bırakmak için nazikçe kuyunun kenarındaki lamelleri hafifçe vurun. </li><li> Plaka 1 x 10 5 U-2 OS (U2OS) osteosarkom hücreleri, 500 ul&#39;lik bir orta hacimde oyuk başına. ...

<ol>
	<li>Holcik, M., Sonenberg, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+control+in+stress+and+apoptosis.">Translational control in stress and apoptosis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (4), 318-327 (2005).</li><li>Yamasaki, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reprogramming+mRNA+translation+during+stress.">Reprogramming mRNA translation during stress.</a> Curr Opin Cell Biol. 20 (2), 222-226 (2008).</li><li>Buchan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mRNP+granules:+Assembly,+function,+and+connections+with+disease.">mRNP granules: Assembly, function, and connections with disease.</a> RNA Biol. 11 (8), (2014).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+that+ternary+complex+(eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient+preinitiation+complexes+are+core+constituents+of+mammalian+stress+granules.">Evidence that ternary complex (eIF2-GTP-tRNA(i)(Met))-deficient preinitiation complexes are core constituents of mammalian stress granules.</a> Mol Biol Cell. 13 (1), 195-210 (2002).</li><li>Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+and+cell+signaling:+more+than+just+a+passing+phase?.">Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase?.</a> Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+shuttling+of+TIA-1+accompanies+the+recruitment+of+mRNA+to+mammalian+stress+granules.">Dynamic shuttling of TIA-1 accompanies the recruitment of mRNA to mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 151 (6), 1257-1268 (2000).</li><li>Bley, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+are+dispensable+for+mRNA+stabilization+during+cellular+stress.">Stress granules are dispensable for mRNA stabilization during cellular stress.</a> Nucleic Acids Res. 43 (4), e26 (2015).</li><li>Kedersha, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP-Caprin1-USP10+complexes+mediate+stress+granule+condensation+and+associate+with+40S+subunits.">G3BP-Caprin1-USP10 complexes mediate stress granule condensation and associate with 40S subunits.</a> J Cell Biol. 212 (7), 845-860 (2016).</li><li>Panas, M. D., Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+insights+into+mammalian+stress+granule+dynamics.">Mechanistic insights into mammalian stress granule dynamics.</a> J Cell Biol. 215 (3), 313-323 (2016).</li><li>Anderson, P., Kedersha, N., Ivanov, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules,+P-bodies+and+cancer.">Stress granules, P-bodies and cancer.</a> Biochim Biophys Acta. 1849 (7), 861-870 (2015).</li><li>Aulas, A., Van de Velde, ., C, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alterations+in+stress+granule+dynamics+driven+by+TDP-43+and+FUS:+a+link+to+pathological+inclusions+in+ALS?.">Alterations in stress granule dynamics driven by TDP-43 and FUS: a link to pathological inclusions in ALS?.</a> Front Cell Neurosci. 9, 423 (2015).</li><li>Ivanov, P., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Post-transcriptional+regulatory+networks+in+immunity.">Post-transcriptional regulatory networks in immunity.</a> Immunol Rev. 253 (1), 253-272 (2013).</li><li>Wolozin, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Physiological+protein+aggregation+run+amuck:+stress+granules+and+the+genesis+of+neurodegenerative+disease.">Physiological protein aggregation run amuck: stress granules and the genesis of neurodegenerative disease.</a> Discov Med. 17 (91), 47-52 (2014).</li><li>Lloyd, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+stress+granules+and+P-bodies+during+RNA+virus+infection.">Regulation of stress granules and P-bodies during RNA virus infection.</a> Wiley Interdiscip Rev RNA. 4 (3), 317-331 (2013).</li><li>Somasekharan, S. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=YB-1+regulates+stress+granule+formation+and+tumor+progression+by+translationally+activating+G3BP1.">YB-1 regulates stress granule formation and tumor progression by translationally activating G3BP1.</a> J Cell Biol. 208 (7), 913-929 (2015).</li><li>Adjibade, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sorafenib,+a+multikinase+inhibitor,+induces+formation+of+stress+granules+in+hepatocarcinoma+cells.">Sorafenib, a multikinase inhibitor, induces formation of stress granules in hepatocarcinoma cells.</a> Oncotarget. , (2015).</li><li>Fournier, M. J., Gareau, C., Mazroui, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemotherapeutic+agent+bortezomib+induces+the+formation+of+stress+granules.">The chemotherapeutic agent bortezomib induces the formation of stress granules.</a> Cancer Cell Int. 10, 12 (2010).</li><li>Mazroui, R., Di Marco, S., Kaufman, R. J., Gallouzi, I. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+the+ubiquitin-proteasome+system+induces+stress+granule+formation.">Inhibition of the ubiquitin-proteasome system induces stress granule formation.</a> Mol Biol Cell. 18 (7), 2603-2618 (2007).</li><li>Moeller, B. J., Cao, Y., Li, C. Y., Dewhirst, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiation+activates+HIF-1+to+regulate+vascular+radiosensitivity+in+tumors:+role+of+reoxygenation,+free+radicals,+and+stress+granules.">Radiation activates HIF-1 to regulate vascular radiosensitivity in tumors: role of reoxygenation, free radicals, and stress granules.</a> Cancer Cell. 5 (5), 429-441 (2004).</li><li>Szaflarski, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vinca+alkaloid+drugs+promote+stress-induced+translational+repression+and+stress+granule+formation.">Vinca alkaloid drugs promote stress-induced translational repression and stress granule formation.</a> Oncotarget. 7 (21), 30307-30322 (2016).</li><li>Gilks, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granule+assembly+is+mediated+by+prion-like+aggregation+of+TIA-1.">Stress granule assembly is mediated by prion-like aggregation of TIA-1.</a> Mol Biol Cell. 15 (12), 5383-5398 (2004).</li><li>Kedersha, N. L., Gupta, M., Li, W., Miller, I., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA-binding+proteins+TIA-1+and+TIAR+link+the+phosphorylation+of+eIF-2+alpha+to+the+assembly+of+mammalian+stress+granules.">RNA-binding proteins TIA-1 and TIAR link the phosphorylation of eIF-2 alpha to the assembly of mammalian stress granules.</a> J Cell Biol. 147 (7), 1431-1442 (1999).</li><li>Kedersha, N., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).</li><li>Kedersha, N., Tisdale, S., Hickman, T., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+and+quantitative+imaging+of+mammalian+stress+granules+and+processing+bodies.">Real-time and quantitative imaging of mammalian stress granules and processing bodies.</a> Methods Enzymol. 448, 521-552 (2008).</li><li>Langer-Safer, P. R., Levine, M., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunological+method+for+mapping+genes+on+Drosophila+polytene+chromosomes.">Immunological method for mapping genes on Drosophila polytene chromosomes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 79 (14), 4381-4385 (1982).</li><li>Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NIH+Image+to+ImageJ:+25+years+of+image+analysis.">NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).</li><li>David, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+translation+visualized+by+ribosome-bound+nascent+chain+puromycylation.">Nuclear translation visualized by ribosome-bound nascent chain puromycylation.</a> J Cell Biol. 197 (1), 45-57 (2012).</li><li>Panas, M. D., Kedersha, N., McInerney, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+the+characterization+of+stress+granules+in+virus+infected+cells.">Methods for the characterization of stress granules in virus infected cells.</a> Methods. 90, 57-64 (2015).</li><li>David, A., Bennink, J. R., Yewdell, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emetine+optimally+facilitates+nascent+chain+puromycylation+and+potentiates+the+ribopuromycylation+method+(RPM)+applied+to+inert+cells.">Emetine optimally facilitates nascent chain puromycylation and potentiates the ribopuromycylation method (RPM) applied to inert cells.</a> Histochem Cell Biol. 139 (3), 501-504 (2013).</li><li>Dieterich, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+visualization+and+dynamics+of+newly+synthesized+proteins+in+rat+hippocampal+neurons.">In situ visualization and dynamics of newly synthesized proteins in rat hippocampal neurons.</a> Nat Neurosci. 13 (7), 897-905 (2010).</li><li>Ruggieri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+oscillation+of+translation+and+stress+granule+formation+mark+the+cellular+response+to+virus+infection.">Dynamic oscillation of translation and stress granule formation mark the cellular response to virus infection.</a> Cell Host Microbe. 12 (1), 71-85 (2012).</li><li>Ghisolfi, L., Dutt, S., McConkey, M. E., Ebert, B. L., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+granules+contribute+to+alpha-globin+homeostasis+in+differentiating+erythroid+cells.">Stress granules contribute to alpha-globin homeostasis in differentiating erythroid cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 420 (4), 768-774 (2012).</li><li>Ohn, T., Kedersha, N., Hickman, T., Tisdale, S., Anderson, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+functional+RNAi+screen+links+O-GlcNAc+modification+of+ribosomal+proteins+to+stress+granule+and+processing+body+assembly.">A functional RNAi screen links O-GlcNAc modification of ribosomal proteins to stress granule and processing body assembly.</a> Nat Cell Biol. 10 (10), 1224-1231 (2008).</li><li>Porter, A. C., Fanger, G. R., Vaillancourt, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+pathways+regulated+by+arsenate+and+arsenite.">Signal transduction pathways regulated by arsenate and arsenite.</a> Oncogene. 18 (54), 7794-7802 (1999).</li><li>Shen, S., Li, X. F., Cullen, W. R., Weinfeld, M., Le, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arsenic+binding+to+proteins.">Arsenic binding to proteins.</a> Chem Rev. 113 (10), 7769-7792 (2013).</li><li>McDonald, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TAR+DNA-binding+protein+43+(TDP-43)+regulates+stress+granule+dynamics+via+differential+regulation+of+G3BP+and+TIA-1.">TAR DNA-binding protein 43 (TDP-43) regulates stress granule dynamics via differential regulation of G3BP and TIA-1.</a> Hum Mol Genet. 20 (7), 1400-1410 (2011).</li><li>Aulas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=G3BP1+promotes+stress-induced+RNA+granule+interactions+to+preserve+polyadenylated+mRNA.">G3BP1 promotes stress-induced RNA granule interactions to preserve polyadenylated mRNA.</a> J Cell Biol. 209 (1), 73-84 (2015).</li><li>Martin, S., Tazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+G3BP+stress+granules+dynamics+in+live+primary+cells.">Visualization of G3BP stress granules dynamics in live primary cells.</a> J Vis Exp. (87), (2014).</li><li>Wippich, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual+specificity+kinase+DYRK3+couples+stress+granule+condensation/dissolution+to+mTORC1+signaling.">Dual specificity kinase DYRK3 couples stress granule condensation/dissolution to mTORC1 signaling.</a> Cell. 152 (4), 791-805 (2013).</li></ol>

Birden fazla hastalıkta immünhistolojik çalışmalarla kanıtlandığı üzere, kronik stres, farklı hücre içi odakların oluşumuna yol açar. Örneğin, çoğu nörodejeneratif hastalıklar, çözünmeyen proteinlerin hücre içi agregaları ile karakterizedir. Bu agregalarda SG ile ilişkili proteinlerin bulunması, bu tür odakların SG&#39;ler olduğu sonucuna varmak için temel oluşturur. Yeni stres uyarıları ile tedavi edilen hücrelerde SG belirteç pozitif sitoplazmik odağı gözlendiğinde de benzer ...

Hücreler, strese tepki vermek için birçok mekanizma kullanmaktadır. Bazı tepkiler, transkripsiyon sonrası seviyede gerçekleşir ve mRNA translasyonunu ve / veya stabilitesini düzenleyen 1 , 2&#39;yi içerir . Stres modüle mRNA translasyonel durma ve bozulma, en sık karakterize Stress Granules (SGs) 3 , özel nonmembranöz hücresel odakların oluşumu ile ilişkilidir. SG&#39;ler, strese tepki veren translasyonel olarak tutuklanmış hücrelere ( örneğin, oksidasyon, ısı şoku, besin açlığı ve viral enfeksiyon) translasyon yapmayan mRNA&#39;ları konsantre eden sitoplazmik odaklardır 4 . Sıralanmamış mRNA&#39;lara ek olarak, SG&#39;ler translasyon başlatma faktörleri, RNA-bağlayıcı proteinler ve çeşitli sinyal proteinleri içerir 5 . SG&#39;ler, inhibe edilmiş protein translasyonu ve değiştirilmiş RNA metabolizmasının biyolojik belirteçleridir ve hücre sağkalımı ve apoptoz, sinyal yolağı ile ilişkilendirilmiştirS ve nükleer süreçler 5 . SG&#39;ler dinamik varlıklardır ve oluşumu hücresel çeviri durumu ile sıkı sıkıya bağlıdır 6 . Görünüşte sağlam görünmelerine rağmen, çoğu SG proteini bileşeni saniyede bir kalış süresi ile hızlı bir şekilde içeri ve dışarı götürülür. SG&#39;ler dakikalar ila saatler sürmesine rağmen, bileşenlerinin çoğu hızlı akış halindedir. Çeviri başlangıcının engellenmesi ve bunun sonucunda translasyon polisomlarının çözülmesi SG&#39;lerin oluşumunu teşvik eder; Dolayısıyla, SG&#39;ler polisomları tercüme etmekle dengelidir. Bu polisome / SG dengesi, iyi niyetli SG&#39;leri diğer stres kaynaklı odaklardan ayıran anahtartır 6 , 7 . Çevirinin başlatılmasının durdurulması, mRNA, çeviri başlatma faktörleri (eIF) ve 40S ribozomal altbirimleri (ler) i içeren, çeviri-yetkili ön başlatma komplekslerinin dönüşümünü gerektirir<html> O-ismi 48S kompleksleri), SG&#39;ler 4 , 6&#39;ya kaynaşabilen translasyonel olarak durmuş komplekslere (48S * kompleksleri) dönüştürür. SG&#39;ler, 48S kompleks oluşumunun akış aşağısındaki iki farklı adımda translasyonel durma ile desteklenir: kapak bağlayıcı eIF4F kompleksinin işlevleriyle ( örneğin eIF4A altbirimini hedef alan) müdahale veya translasyon başlatma faktörü eIF2&#39;nin α altbiriminin fosforilasyonu, bunların biri tarafından aracılık edilir Veya dört eIF2 kinazın daha fazlasını içerir. Stabil 48S komplekslerinin ( yani, 40S ribozomal altbirimler ve seçilen translasyon başlatma faktörleri) varlığı SG 8 , 9&#39;un bir işaretidir. SG&#39;ler viral enfeksiyonlar, nörodejenerasyon, otoimmünite ve kanser gibi çeşitli patolojik durumlarla bağlantılı olmuştur 3 , 10 , 11 ,Ss = &quot;xref&quot;&gt; 12 , 13 . Birkaç SG bileşeninin mutasyona uğramış formları , nöronların nöronal ölümde etkin rol oynayabilen hücre içi patolojik kapanımları sergilediği nörodejeneratif hastalıklarla ( örn. Amiyotropik lateral skleroz) ilişkilidir 13 . Bazı virüsler, SG oluşumunu engellemek ve viral replikasyonu artırmak için SG bileşenlerini kaçırır 14 . Son çalışmalar aynı zamanda SG&#39;leri kansere 15 ve kanserli hücre sağkalımına kemo- ve radyoterapi tedavileri 10 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 bağlar. Bu bulgular SG biyolojisine büyük ilgiyi uyandırırken, yayınlanan raporların birçoğu, iyi niyetli SG&#39;lerin oluşumunu diğer stres kaynaklı odaklardan ayırmak için önemli kontrollerden yoksundur. SG&#39;ler başlangıçta, T-hücresi ntra-hücresel antijen 1 (TIA-1) ve Poli-A-bağlayıcı Protein (PABP) de dahil olmak üzere seçilen mRNA-bağlayıcı Proteinler (RBP&#39;ler) oluşan doku dışı sitoplazmik odak olarak tanımlandı; Çeviri başlatma faktörleri; Poliadenile mRNA; Ve küçük ribozomal altbirimler 4 , 6 , 21 , 22 . Geleneksel olarak, bileşimleri immün boyama ve floresan etiketli proteinlerin ektopik ekspresyonu 23 , 24 gibi tekniklerle belirlenmiştir. Son derece dinamik doğalarından dolayı, SG proteinleri ve / veya mRNA&#39;ların immüno-yerelleştirilmesi , SG&#39;leri 23 , 24 tespit etmek için tanımlayıcı metodoloji olmaya devam etmektedir. Bugüne kadar, birçok RBP ve diğer proteinler (120&#39;den fazla farklı protein) SG bileşenleri 11 olarak tanımlanmaktadır. Birçok SG lokalize proteinler, hem strese bağlı hem de bağımsız bir şekilde lokalizasyonlarını değiştirir ve diğer hücre içi bölmelerde ve odaklarda birikebilir, doğru SG belirteçlerini seçmek ve SG&#39;leri diğer stres kaynaklı streslerden ayırmak için işlevsel kriterleri kullanmak önemlidir odak. İyi niyetli SG&#39;ler mRNA, çeviri başlatma faktörleri ve küçük ribozomal altbirimleri içerir ve translasyonla dinamik denge içindedir. Bu basit iş akışı, stres kaynaklı odakların iyi niyetli SG&#39;ler olup olmadığını belirlemek için tasarlanmıştır. Bu iş akışı, SG&#39;leri incelemek için yaygın olarak kullanılan hücreler olan U2OS hücrelerini kullanan birkaç deneysel yaklaşımı içerir. Bu hücreler, büyük bir sitoplazmaya sahip oldukları için nispeten düz oldukları için idealdirler ve cam lamellerine kuvvetle bağlanırlar. SG&#39;leri incelemek için başka hücre türleri de kullanılabilir, ancak zamanlama, ilaç konsantrasyonu ve SG-çekirdeklenme proteinlerinin bolluğu arasındaki farklılıkların kinetiği ve bileşimi değiştirebileceğinin farkında olmak önemlidirsition. Ek olarak, bazı hücreler, bazı SG markerlerinin noktasal lokalizasyonuna neden olan kabarık bir görünüm veren hücre yüzeyindeki blebleri oluşturarak paraformaldehit fiksasyonuna tepki verir; Dikkatli bir analiz yapılmaksızın bunlar SG olarak yanlış sınıflandırılabilir. Bu, stres kaynaklı odakların iyi niyetli SG&#39;ler olarak tanımlanması için gerekli tüm ölçütlerin değerlendirilmesinin gerekliliğini vurgulamaktadır. SG 20&#39;yi teşvik eden bir kanser terapisi olan Vinorelbin (VRB) ve sağlam ve iyi karakterize edilmiş bir SG indüktörü olan Sodyum Arsenit (SA) bu protokoldeki deneyler için stres olarak kullanılır. Kanonik SG&#39;ler, sitoplazmik odaklarda kolokalize olan çoklu SG işaretçileri (hem proteinler hem de mRNA&#39;lar) içerir. Bu protokol sırasıyla protein markerlerinin ve poliadenile mRNA 22&#39;nin lokalizasyonunu saptamak için hem immünofloresans hem de floresan yerinde hibridizasyon (FISH) kullanır. Kısaca, dolaylı immünofloresan antikorları ( yani,e. Birincil antikorlar) belirli bir proteine ​​özeldir. Daha sonra, florokromlara bağlanan ikincil antikorlar (genellikle türe özgü) birincil antikoru tanır ve hedef protein lokalizasyonunu ortaya çıkarır. Floresan mikroskopi, hücre içindeki lokalize sinyali saptamak için kullanılır. Farklı türlerde üretilen antikorların kullanılması ve bunları farklı renkte sekonder antikorlar ile bulgulanması, çoklu antikorların kolokalizasyo- nunu saptamayı sağlar ve protein hedeflerinin aynı yerde bulunduğu- nu gösterir 23 . İyi niyetli SG&#39;lerde yerelleştirilmek üzere doğrulanmış belirteçleri seçmek önemlidir. BALIK, belirli bir RNA veya DNA sekansı 25 ile baz çiftleşen etiketli bir prob kullanır. MRNA&#39;yı tespit etmek için, bu protokol, mRNA&#39;nın poliA kuyruğuna melezleşen (veya baz çiftleri) biyotinlenmiş bir oligo (dT) 40 probu kullanır ( yani, poliA FISH). Streptavidin, biyotin için yüksek bir afiniteye sahip olduğu için, biyotinlenmiş prob, flüoresanla konjüge edilmiş streptavidin kullanılarak tespit edilir. SG&#39;leri değerlendirirken, iyi niyetli SG&#39;lerde olduğu gibi poliA FISH ile bir immünofloresansın bir SG işaretleyicisi tespit etmesi önemlidir, iki sinyal de aynı yerde bulunur. Bu protokolü kullanarak, kolokalizasyonu birden fazla yolla değerlendirilir. Çok kanallı ( yani RGB: kırmızı, yeşil ve mavi) görüntüde, kolokalizasyon, örtüşen sinyalin rengini değiştirecektir ( örn., Birleştirilmiş kırmızı ve yeşil sarı görünür) 23 . Ek olarak, kolokalizasyon, çizgi tarama analizi kullanılarak grafiksel olarak nicelenir ve burada her bir renk yoğunluğu verilen bir çizgi 8 , 20&#39;de ölçülür. Bu protokol, ImageJ 26 kullanan iki satır tarama analiz yöntemlerini tanımlamaktadır. Bir prosedür elle yapılmış ve tüm süreç boyunca devam etmektedir.Le, diğeri makroyu veya manuel adımları otomatikleştiren basit bir programı kullanır. Makro prosedürü anlamak için manuel programı incelemek önemlidir. SG&#39;ler, translasyonun bastırıldığı hücrelerde oluşur; Bu nedenle, SG&#39;li hücreler, tedavi edilmemiş hücrelere kıyasla azalmış küresel translasyon seviyeleri göstermelidir. Deneysel olarak ribopuromisilasyon kullanılır. Puromisin, fiksasyondan önce kısa bir süre boyunca hücrelere eklenir ve puromisin aktif olarak şekillenen polipeptidlere dahil olur ve böylece sonlanma 27 , 28 olur . Yeniden başlatmayı önlemek için emetine uygulanması gerekir 29 . Puromisin daha sonra anti-puromisin antikoru kullanılarak tespit edilebilmekte ve aktif translasyonun anlık görüntüsü verilmektedir. Bu yöntem hızlı olduğu için, belirli bir amino asitten yoksun (ve potansiyel olarak hücreleri ön gerilimine sokan) bir besiyeri ile öncesi aç bırakmayı gerektirmeyen veProtein translasyonunun subselüler lokalizasyonu. SG&#39;leri içeren hücrelerin komşu hücrelere 31 kıyasla çok daha düşük translasyon sergilediğini göstermek için &quot;tıklama-it&quot; kimyası 30 ile birleştirilmiş metionin analog L-azidohomoalain (AHA) gibi tadil edilmiş amino asit analoglarını kullanan diğer yöntemler kullanılmıştır. Bununla birlikte, bu teknik metionin açlığın- dan sonra 15-30 dakika süreyle nabız etiketlemesi gerektirir. Metilin açlığı ilave bir stres oluştururken, uzun etiketleme zamanı ( yani 15-30 dakika), devam etmekte olan tercümenin kümülatif olarak ölçülmesine ve aynı zamanda yeni sentezlenmiş proteinlerin sentez alanlarından son hedeflerine hücre. Buna karşılık, ribopuromisilasyon çok daha hızlıdır ve glikoz açlığı ile SG&#39;leri indüklemek için kullanılan glikozsuz ortam gibi herhangi bir ortamla uyumludur. Kanonik SG&#39;ler dinamik dengedeAktif olarak polisomları çevirirken. Bu deneysel olarak polisomları stabilize eden veya bozucu ilaçlarla örneklerle tedavi ederek değerlendirilebilir, böylece SG&#39;ler ile polisomlar arasındaki dengeyi de yükseltir 23 . Sikloheksimid (veya benzer şekilde davranan emetin) ribozomları mRNA üzerine &quot;dondurarak&quot; uzamayı engeller, böylece SG&#39;leri oluşturabilen mevcut polisomal olmayan mRNP&#39;lerin havuzunu düşürür. Deneysel olarak, bu iki şekilde kullanılabilir: SG oluşumunu önlemek için stres öncesi sikloheksimid (veya emetin) ekleyerek veya SG&#39;ler oluştuktan sonra sikloheksimit (veya emetin) ekleyerek, gerilme maddesini çıkarmadan, SG&#39;nin bozulmasına neden olan durmuş gibi Preinitiasyon kompleksleri yavaş yavaş polisom fraksiyonuna kabul edilir. Buna karşılık, puromisin, prematüre terminasyona neden olur ve polisome ayrışmasını teşvik eder ve SG&#39;lere montaj yapabilen başlatıcı mRNA&#39;ların havuzunu arttırır. Deneysel olarak, puromisin tedavisi, SG sayısını arttırır veya thresholü düşürürD olarak derecelendirilmiş stres veya ilaç dozajına tepki olarak form verdiklerini göstermektedir. Puromisin&#39;in etkisini değerlendirirken, puromisin&#39;in ilacın etkisini arttırması ve SG&#39;leri gösteren hücrelerin yüzdesini arttırması beklendiğinden ilâçın maksimal bir alt seviyesinin kullanılması önemlidir; ilaç görülmezse bu gerçekleşemez / Stres başlangıçta hücrelerin% 100&#39;ünde SG oluşturur. Bu, SG&#39;leri parçalara ayıran ve hücrelerin ~% 95&#39;inde başlangıçta SG&#39;leri görüntülediğinde, mümkün olan en büyük düşüşün gözlenebileceği ve doğru şekilde nicelleştirilebileceği siklooksit tedavisi ile çelişir. Bu protokol memelilerdeki SG&#39;leri incelemek için bir çerçeve sağlar. Yöntemler şunları içerir: (1) varsayılan SG&#39;lerdeki klasik SG ile ilişkili belirteçler eIF4G, eIF3b ve Ras GTPaz aktive edici protein bağlama proteini 1 (G3BP1) arasındaki kolokalizasyonu değerlendirmek için immünofloresan boyama ve ImageJ analizi; (2) oligo (dT) floresan in situ hibridizasyon (polyA FISH) poliadenile mRNA tespit etmek için; (3) stres kaynaklı odakların polisomlarla dinamik denge içerisinde olup olmadığını belirlemek için sikloheksid ve puromisin tedavisi; Ve (4) varsayılan SG&#39;leri içeren hücrelerin translasyonel durumunu değerlendirmek için ribopuromisilasyon. Birlikte, bu tahliller, stres kaynaklı odakların iyi niyetli SG&#39;ler olarak sınıflandırılabileceğini belirleyebilir.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>U-2 OS</td>
			<td>ATCC</td>
			<td>ATCC&#174;HTB-96&#8482;</td>
			<td>- commonly written as &#34;U2OS&#34; 
			- culture at 37 &#176;C under 5% CO2 in 10% FBS/DMEM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s Modification of Eagle&#39;s Medium</td>
			<td>Corning</td>
			<td>10-013-CV</td>
			<td>- abbreviated DMEM 
			- contains 4.5 g/L glucose, pyruvate, and phenol red 
			- supplemented with 10% FBS, 10 mM HEPES, and penicillin/steptomycin 
			- prewarm prior drug(s) dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal Bovine Serum</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F2442-500ml</td>
			<td>- abbreviated FBS 
			- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES (1 M)</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>15630-080</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>penicilline streptomycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P0781-100ml</td>
			<td>- used to supplement media</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24 well plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3524</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>lab tissues</td>
			<td>KIMTECH SCIENCE</td>
			<td>34120</td>
			<td>- commonly called &#34;kimwipes&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Coverglass for Growth Cover Glasses</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-545-82</td>
			<td>- autoclaved before used 
			- keep sterile in the tissue culture hood</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium (meta)arsenite &#8805;90%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S7400-100G</td>
			<td>- commonly called sodium arsenite and abbreviated SA 
			- dissolution in water at 1 M concentration, then dilute to 100 &#181;M as a working stock</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vinorelbine</td>
			<td>TSZ CHEM</td>
			<td>RS055</td>
			<td>- abbreviated VRB 
			- dissolve in water to 10 mM</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Puromycin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9620</td>
			<td>- used to assess translation level (ribopuromycylation) 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Emetine dihydrochloride hydrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>E2375</td>
			<td>- used in combination with puro to assess general translation level 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cycloheximide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C4859</td>
			<td>- abbreviated CHX 
			- used to assess SG connection with active translation 
			- dilute in water to 10 mg/mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline</td>
			<td>Lonza / VWR</td>
			<td>95042-486</td>
			<td>- abbreviated PBS 
			- wash buffer for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde reagent grade, crystalline</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148-500G</td>
			<td>- make a 4% solution in hot PBS in fume hood, stir until dissolved 
			- aliquots can be stored at - 20 &#176;C for several months 
			- hazardous, use ventilation 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Methanol, ACS</td>
			<td>BDH / VWR</td>
			<td>BDH1135-4LP</td>
			<td>- pre-chilled to -20&#176;C before use 
			- discard in special waste</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Horse Serum</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>31874</td>
			<td>- abbreviated NHS 
			- dilute to 5% in PBS 
			- add sodium azide for storage at 4&#176;C 
			- blocking solution for immunofluorescence</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol, Pure, 200 Proof (100%),USP, KOPTEC</td>
			<td>Decon Labs / VWR</td>
			<td>89125-188</td>
			<td>- dilute to 70% with water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>12-550-15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti G3BP1 antibody (TT-Y)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-81940</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- use at 1/100 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>rabbit anti eIF4G antibody (H-300)</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-11373</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>goat anti eIF3&#951; (N-20) antibody</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>sc-16377</td>
			<td>- eIF3&#951; is also known as eIF3b 
			- store at 4 &#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse anti puromycin 12D10 antibody</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>MABE343</td>
			<td>- store at 4 &#176;C 
			- 1/1000 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy2 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>715-225-150</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>711-165-152</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/2500 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L)</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>705-175-147</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hoechst 33258 solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>94403-1ML</td>
			<td>- incubate with secondary antibodies 
			-stock solution 0.5 mg/mL in dH20, protect from light 
			- Store at 4 &#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cy3 Streptavidin</td>
			<td>Jackson Immunoresearch</td>
			<td>016-160-084</td>
			<td>- reconstitute in water as per manufacturer&#8217;s instructions, then store at 4&#176;C 
			- 1/250 dilution</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>oligo-(dT)40x probe biotinilated</td>
			<td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td>
			<td>/</td>
			<td>- reconstitute in water to 100 ng/mL, aliquot and store at -20&#176;C 
			- dilute in hybridation buffer 1/50 prior to use 
			- custom order</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hybridation box</td>
			<td>/</td>
			<td>/</td>
			<td>- make a moisture chamber with any storing slide box by adding humidified paper on the bottom 
			- prewarm the box prior use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 x SSC buffer</td>
			<td>Thermo fisher Ambion</td>
			<td>AM9763</td>
			<td>- dilute to 2X SSC using RNase Free water (DEPC treated) 
			- store at room temperature 
			- wash buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PerfectHybPlus Hybridization Buffer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>H7033-50ml</td>
			<td>- block and probe incubation buffer for FISH</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>slide mounting media</td>
			<td>home made</td>
			<td>/</td>
			<td>- mix 5 g of &#8220;cold-soluble&#8221; poly(vinyl alcohol) in 20 ml of PBS 
			- mix by sonication, followed by stirring overnight at RT 
			- Add 5 ml of glycerol and 0.2 ml of 20 % sodium azide, and stir for 16 h at RT 
			- centrifugation at 20,000 g for 20 min, discard large pellet 
			- aliquot viscous liquid, long-term storage at -20&#176;C, 1 week at 4&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Parafilm &#34;M&#34;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P7793-1EA</td>
			<td>- usually referred as &#34;parafilm&#34;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Poly(vinyl alcohol)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P-8136-250G</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516-100ML</td>
			<td>- reagent to make vinol</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium azide</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>S2002-5G</td>
			<td>- preservative agent for blocking solution and vinol 
			- make a 20 % dilution in water</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

methods to classify cytoplasmic foci as mammalian stress granules

Hücrelere genellikle ani çevresel değişikliklerle meydan okunur. Stres koşullarına maruz kalan hücrelerde oluşan stres granülleri (SG), hücre içi metabolizma ve sağkalımın çeşitli yönleriyle ilişkilendirilir. SG&#39;ler, hücresel sinyal yollarını, transkripsiyon sonrası gen ifadesini ve stres tepki programlarını modüle eder. Bu mRNA içeren granüllerin oluşumu doğrudan hücresel translasyona bağlıdır. SG birleşimi, inhibe edilen translasyon başlatma tarafından tetiklenir ve SG ayrılması, translasyon aktivasyonu veya inhibe edilmiş translasyon uzamayla desteklenir. Bu ilişki SG kompozisyonu ile daha da vurgulanır. Çekirdek SG bileşenleri, başlatma öncesi kompleksler, mRNA ve seçilen RNA bağlayıcı Proteinler (RBP&#39;ler) durdu. SG montajının amacı, translasyonel olarak duran oda temizleme mRNA&#39;larını saptayarak hücresel enerjiyi muhafaza etmek ve strese duyarlı proteinlerin geliştirilmiş translasyonuna izin vermektir. Additi&#39;deDurgun çeviri preinitiation kompleksleri gibi temel bileşenlere, SG&#39;ler diğer proteinlerin ve sinyal moleküllerinin bolluğunu içerir. SG oluşumundaki bozukluklar hücresel stres uyarlamasını bozabilir ve böylece hücre ölümünü hızlandırabilir. SG&#39;ler ve benzeri RNA içeren granüller nörodejeneratif bozukluklar ve kanser dahil bir dizi insan hastalığına bağlıdır ve son zamanlarda RNA granül alt tiplerinin sınıflandırılmasına ve tanımlanmasına ilgi uyandırmaktadır. Bu protokol, memeli SG&#39;leri karakterize etmek ve ölçmek için yapılan tahlilleri açıklamaktadır.

Stres kaynaklı odaklanma alanları mutlaka SG değildir. SG&#39;ler, mRNA&#39;lar, translasyon başlatma faktörleri ve RNA-bağlayıcı proteinleri içeren sitoplazmik odaklar olarak sınıflandırılır ve aktif translasyon ile denge halindedir. Yukarıdaki protokol, belirli bir stresin iyi niyetli SG&#39;ler oluşturup oluşturmadığını karakterize etmek için bir kalıp olarak kullanılabilir. SG&#39;ler, hem ...

Watch this Scientific Journal Video about Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules at JoVE.com

Methods to Classify Cytoplasmic Foci as Mammalian Stress Granules

Stres Granülleri (SG), çeşitli streslere maruz kalan hücrelerde oluşan doku dışı yapısal sitoplazmik yapılardır. SG&#39;ler mRNA&#39;lar, RNA-bağlayıcı proteinler, küçük ribozomal altbirimler, translasyona bağlı faktörler ve çeşitli hücre sinyal proteinlerini içerir. Bu protokol, iyi niyetli SG&#39;leri tespit etmek, karakterize etmek ve ölçmek için çeşitli deneysel yaklaşımlar kullanan bir iş akışını tanımlamaktadır.

Sitoplazmik Odakları Memeli Stres Granülleri Olarak Sınıflandırma Yöntemleri

Cells are often challenged by sudden environmental changes. Stress Granules (SGs), cytoplasmic ribonucleoprotein complexes that form in cells exposed to ...

Research

JoVE Journal

Biology

Trypsinizing and Subculturing Mammalian Cells

Memeli Hücreleri Trypsinizing ve alt kültüre

As cells reach confluency, they must be subcultured or passaged. Failure to subculture confluent cells results in reduced mitotic index and eventually in ...

Quantification of &gamma;H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

Quantification of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Response to Ionising Radiation

İyonlaştırıcı Radyasyon Cevabı γH2AX Foci Kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs), which are induced by either endogenous metabolic processes or by exogenous sources, are one of the most critical DNA ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of ÃƒÅ½Ã‚Â³H2AX Foci in Tissue Samples

Doku Örnekleri γH2AX Foci kantitasyonu

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Activation of Apoptosis by Cytoplasmic Microinjection of Cytochrome c

Sitokrom Sitoplazmik Mikroenjeksiyon Apoptoz aktivasyonu C</em

Apoptosis, or programmed cell death, is a conserved and highly regulated pathway by which cells die1.  Apoptosis can be triggered when cells encounter a ...

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Visualizing Cytoplasmic Flow During Single-cell Wound Healing in Stentor coeruleus

Tek hücreli Yara Şifa sırasında Sitoplazmik Akışı görselleştirme<em&gt; Stentor coeruleus</em

Although wound-healing is often addressed at the level of whole tissues, in many cases individual cells are able to heal wounds within themselves, ...

Visualization of G3BP Stress Granules Dynamics in Live Primary Cells

Canlı İlköğretim Hücrelerde G3BP Stres Granül Dinamiği Görselleştirme

SGs can be visualized in cells by immunostaining of specific protein components or polyA+ mRNAs. SGs are highly dynamic and the study of their assembly ...

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Stimulation of Cytoplasmic DNA Sensing Pathways In Vitro and In Vivo

Sitoplazmik DNA Algılama Pathways uyarılması<em&gt; İn Vitro</em&gt; Ve<em&gt; In Vivo</em

In order to efficiently stimulate an innate immune response, DNA must be of sufficient length and purity. We present a method where double stranded DNA ...

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Methods to Assess Subcellular Compartments of Muscle in C. elegans

Yöntemler içinde Muscle hücrealtı Kompartmanları DeğerlendirecekÜSKÜP<em&gt; ° C. elegans</em

Muscle is a dynamic tissue that responds to changes in nutrition, exercise, and disease state. The loss of muscle mass and function with disease and age ...

Comet Assay as an Indirect Measure of Systemic Oxidative Stress

Sistemik Oksidatif Stresin bir Dolaylı Tedbir olarak Comet Assay

Higher eukaryotic organisms cannot live without oxygen; yet, paradoxically, oxygen can be harmful to them. The oxygen molecule is chemically relatively ...

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Xenopus laevis Egg Extract Preparation and Live Imaging Methods for Visualizing Dynamic Cytoplasmic Organization

Xenopus laevis Dinamik Sitoplazmik Organizasyonu Görselleştirmek için Yumurta Ekstresi Hazırlama ve Canlı Görüntüleme Yöntemleri

Traditionally used for bulk biochemical assays, Xenopus laevis egg extracts have emerged as a powerful imaging-based tool for studying cytoplasmic ...