Name: determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms
Uploaded: 2017-04-17T15:00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms at JoVE.com

الكتاب أشكر نواه ديتو وآدم مايلز للحصول على المساعدة الفنية على IBIS MX96.

<ol>
	<li>Cooper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+biosensors+in+drug+discovery.">Optical biosensors in drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).</li><li>Van Regenmortel, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+antigen-antibody+interactions+with+biosensors.">Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors.</a> J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).</li><li>Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+screening+of+antibodies+from+crude+hybridoma+samples+using+Biacore.">Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore.</a> Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).</li><li>Katsamba, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+a+high-affinity+antibody/antigen+interaction+performed+by+multiple+Biacore+users.">Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users.</a> Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).</li><li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+blocking+assays+using+Octet,+ProteOn,+and+Biacore+biosensors.">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).</li><li>Abdiche, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Epitope+Binning+Assays+on+Label-Free+Array-Based+Biosensors+Can+Yield+Exquisite+Epitope+Discrimination+That+Facilitates+the+Selection+of+Monoclonal+Antibodies+with+Functional+Activity.">High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity.</a> PLoS ONE. 9 (3), e92451 (2014).</li><li>Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+monoclonal+antibody+market.">The therapeutic monoclonal antibody market.</a> mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-throughput,+label-free,+real-time+molecular+interaction+analysis.">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li><li>Keighley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+need+for+high+throughput+kinetics+early+in+the+drug+discovery+process.">The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process.</a> Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).</li><li>Lad, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+kinetic+screening+of+hybridomas+to+identify+high-affinity+antibodies+using+bio-layer+interferometry.">High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry.</a> J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).</li><li>Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ProteOn+XPR36TM+Array+System-High+Throughput+Kinetic+Binding+Analysis+of+Biomolecular+Interactions.">The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions.</a> Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).</li><li>Eddings, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+continuous-flow+print+head+for+micro-array+deposition.">Improved continuous-flow print head for micro-array deposition.</a> Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet.</a> Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+ProteOn+XPR36+biosensor+into+a+36-ligand+array+expedites+protein+interaction+analysis.">Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis.</a> Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).</li><li>Rich, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+benchmark+study+using+affinity-based+biosensors.">A global benchmark study using affinity-based biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics.">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dataset+of+the+binding+kinetic+rate+constants+of+anti-PCSK9+antibodies+obtained+using+the+Biacore+T100+ProteOn+XPR36,+Octet+RED384,+and+IBIS+MX96+biosensor+platforms.">Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms.</a> Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).</li><li>Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+size-exclusion+separations+of+proteins+and+polymers+by+UHPLC.">Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC.</a> Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).</li></ol>

تم دفع رسوم النشر لهذا الفيديو المقال من قبل بورنغير إنغلهايم الصيدلة.

وتبين دراستنا المقارنة وجها لرئيس أن كل منصة جهاز الاستشعار البيولوجي لديه نقاط قوة ونقاط الضعف الخاصة بها. على الرغم من أن الشخصية ملزمة من الأجسام المضادة متشابهة من خلال المقارنة البصرية (أرقام 3-6)، وبالترتيب من الثوابت معدل الحركية المكتسبة ومتسقة للغاية عبر الصكوك (الشكل 7)، تظهر نتائجنا أن الصكوك SPR المستندة مع FLUIDICS تدفق مستمر) هي أفضل حل في التفاعلات عالية تقارب مع معدلات التفكك البطيء. ويلاحظ انحراف التصاعدي خلال مرحلة التفكك في قواعد البيانات (على سبيل المثال، ماب 2، ماب 5، وماب 9؛ الشكل 5) التي تم إنشاؤها من قبل حرة FLUIDICS-أداة BLI. ويمكن أن يعزى هذا الاستنتاج في جزء كبير منه إلى عينة تبخر مع مرور الوقت في صفيحة، وهو الحد الأساسي للنظام. مع هذا القيد الأصيل، ويقتصر الوقت التجريبية أيضا إلى أقل من 12 ساعة. لذا كانت مبرمجة التجارب مع شمرات orter (جمعية 500 ق و 30 دقيقة التفكك) مقارنة مع أولئك من منصات أخرى (جمعية 10 دقيقة و 45 دقيقة التفكك). ومع ذلك، وتقصير الوقت التجريبية لم تظهر للتخفيف من تأثير التبخر على نوعية البيانات / الاتساق، والثوابت معدل الناتجة عن أداة تستند BLI-تظهر أقل الخطي نتيجة للتقلبات في بعض من معدلات (الشكل 8C ). بالإضافة إلى عينة التبخر، وربما ساهمت الاختلافات في الكواشف القبض تستخدم أيضا للاختلافات في النتائج المتحصل عليها. في حين تم استخدام بروتين A / G في جميع منصات SPR الثلاث التي تتخذ من FLUIDICS، واستخدمت أجهزة الاستشعار AHC في منصة BLI غير FLUIDICS. منذ بروتين A / G من المحتمل أن يكون لها تقارب ضعف لMABS مما يفعل AHC، سطح جهاز الاستشعار البيولوجي القائم على الأجسام المضادة، وبعيدا عن معدلات مجمع ماب مستضد من البروتين A / أسطح G قد تظهر بشكل مصطنع أسرع من تلك التي تم الحصول عليها من سطح AHC. ويدعم هذا الاحتمال بذ البيانات التجريبية تبين أن قيم معدل خارج الناتجة عن منصة BLI كانت أقل باستمرار من تلك التي تم الحصول عليها من الأدوات الأخرى (الشكل 7، خط أحمر). ومع ذلك، فإن منصة BLI لها مزايا مختلفة على منصات أخرى. على سبيل المثال، هو درجة عالية من المرونة فيما يتعلق باختيار أجهزة الاستشعار والتكوين الفحص نظرا لمختلف أجهزة الاستشعار قبل المغلفة للاستخدام الفوري. في تجاربنا، واستخدام أجهزة الاستشعار AHC القضاء على الحاجة إلى اتخاذ خطوات يجند الشلل، مما يقلل من الوقت اللازم لإعداد. وعلاوة على ذلك، ومنصة BLI تتطلب صيانة أقل بكثير بالمقارنة مع منصات FLUIDICS SPR الأخرى، والتي تتميز معقدة أنابيب والتبديل قيمة تكوينات. هذه الميزة هي ميزة لالتجارب التي تنطوي على عينات الخام التي يمكن أن تسبب مشاكل انسداد والتلوث. حيث أن الطلب لتحديد كفاءة، سريع، ودقيق للزيادات المرشحين العلاجية، والحاجة إلى ثنائيةosensor الإنتاجية آخذ في الارتفاع أيضا. بين منصات جهاز الاستشعار البيولوجي الأربعة، والإنتاجية من جهاز الاستشعار البيولوجي قادرة على 96 يجند طباعة مجموعة هي الأعلى، تليها جهاز الاستشعار البيولوجي إلى جانب ليتنقل شكل 36 يجند وجهاز الاستشعار البيولوجي استنادا BLI مع قراءات في وقت واحد 16 قناة، والتي تزيد في نهاية المطاف عدد التفاعلات قياس في دورة ملزمة واحدة إلى 96 و 36 و 16، على التوالي. هذه القدرات الإنتاجية هي أعلى بكثير من منصة SPR التقليدية، التي تقتصر من خلال وجود أربعة فقط تدفق الخلايا متصلة بواسطة تدفق تسلسلي واحد. منذ شملت تجاربنا مجموعة عينة صغيرة نسبيا من 10 MABS تقييم بكثافة سطح متعددة مع أوقات طويلة التفكك، لعبت دور فعال الانتاجية دورا معتدلا في تحديد كفاءة التجارب. لم تكن هناك فروق ذات دلالة إحصائية في الأوقات التجريبية للمنصات عالية الإنتاجية الثلاثة، وفي جميع الحالات تم الانتهاء من التجارب في يوم واحد. من ناحية أخرى، تتطلب التجارب التقليدية SPR تدفق التسلسلي 3 أيام لاستكمال، على الرغم من أتمتة سيرا على الأقدام من الحصول على البيانات بعد الإعداد. في الدراسات الأخرى التي تنطوي على عدد كبير من العينات (أي في مئات أو آلاف)، لأغراض ترتيب معدل خارج / الفحص الحركي أو binning حاتمة، تصبح الإنتاجية عاملا حاسما. على الرغم من أن الإنتاجية في IBIS MX96 هي أوامر من حجم أعلى من ذلك من أجهزة الاستشعار الأخرى، وبالتالي هي الخيار الأمثل لهذه الأغراض، ولديها بعض أوجه القصور. على وجه الخصوص، وطباعة مجموعة من CFM تظهر التناقضات سطح الكبيرة (الشكل 1) وانخفاض استنساخ البيانات (الشكل 8D و8E). لقياس حركية دقيقة، ومقدار يجند على سطح جهاز الاستشعار البيولوجي معلمة الحرجة التي تحتاج إلى رقابة لضمان أن ردود ملزمة ليست منزعجة من العوامل الثانوية مثلنقل الجماعي أو عائق الفراغية. لBiacore T100 وProteOn XPR36، تم تحديد مستويات L الأمثل R على أساس حساب معيار القيم ماكس مجموعة R كما هو موضح في المادة 17 البحوث. من ناحية أخرى، لمنصات محاذية RED384 وIBIS MX96، وتم تحقيق مستويات القبض ماب تجريبيا باستخدام سلسلة من الأجسام المضادة 2 أضعاف المخفف متسلسل في أوقات ثابتة. أدى عدم المعرفة أو السيطرة على خطوة القبض في سطح ذات الكثافة السكانية العالية وإشارات عالية ملزمة استجابة (الشكل 2) التي قد يؤثر سلبا على دقة الثوابت معدل الحركية. وعلاوة على ذلك، وفصل الطابعة من كشف SPR يعرض أيضا تحديا عند إجراء قياسات متعددة دورة الملزمة التي تنطوي على regenerations. وكانت الطريقة الوحيدة لتنفيذ الإعداد حركية متعددة دورة من خلال اقتران أمين المباشر للMABS، بدلا من القبض على طريق ماب التيسير من قبل يجمد بروتين A / Gالسطح في منصات جهاز الاستشعار البيولوجي الثلاثة الأخرى. ونتيجة لذلك، كان مطلوبا تجربة إضافية تجديد الكشفية لتحديد الظروف المثلى تجديد. ارتبط نتيجة هذا الإعداد إلى ~ انخفاض 90٪ النشاط الملحوظ سطح بالمقارنة مع التيسير طريقة القبض على (الشكل 9)، بالإضافة إلى وقت أطول التجريبية. لتنفيذ أسلوب القبض على التيسير، اعتمد هذا النهج الحركي البديلة دورة واحدة. وينطوي هذا النهج على حقن متتابعة من تحليلها إلى زيادة تركيزات دون تجديد بين كل حقنة (الشكل 2). هذا النهج مريحة للغاية، ولكن أقل تطبق عادة ليس فقط تقصير الوقت التجريبية وخفض استهلاك كاشف، ولكن أيضا إنتاج الثوابت معدل الحركية مشابهة جدا لتلك من أجهزة الاستشعار الأخرى (الشكل 7). ولذلك، فإن تطبيق هذا النهج حركية واحدة دورة يتغلب على قيد التكوين الطبيعي للدول الصك ويقدم لفرصة للحصول على عالية الدقة الحركية الثوابت معدل بطريقة عالية الإنتاجية. وعلى الرغم من الإنتاجية كونه قيدا رئيسيا في Biacore T100، نتائجنا تظهر بشكل جماعي أنها ولدت البيانات أكثر اتساقا مع أعلى مستويات الجودة. وأعقب ذلك في ProteOn XPR36، التي لديها أعلى ~ 10 أضعاف الإنتاجية. قدرتها على توليد بيانات عالية الجودة يصبح ميزة عند تميز عالية تقارب التفاعلات الضد مستضد التي يمكن أن يكون تحديا تقنيا عند الوصول إلى حدود الكشف الصكوك. في حين أن القيود المنهجية في الأجهزة من محاذية RED384 تعيق القياس الدقيق للثوابت معدل التفكك (أي مقصر من حساسية لحل كافية تسوس إشارة لبطء خارج الرسوم)، فإن كلا من Biacore T100 وProteOn XPR36 يمكن أن توفر حساسة وموثوق بها الكشف عن التمايز.

The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the "gold standard" for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7. 
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96's SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an "all-in-one" setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate "dip-and-read" use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument's fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a "one-shot" kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle. 
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, "Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics"17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biacore T100 System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28975001</td>
			<td>The T100 system has been upgraded to T200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM5 Sensor Chip&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIAevaluation&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Version 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T100 Control Software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>The T100 control software has been upgraded to T200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050&#160;</td>
			<td>It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBS-EP+ Buffer 10&#215;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100669</td>
			<td>Concentrated stock solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials, o.d. 7 mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100212&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps, type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100214&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1760100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteOn Manager Software&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1760200</td>
			<td>Version 3.1.0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLM Sensor Chip</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1765012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762410</td>
			<td>It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regeneration and Conditioning Kit and Buffers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762210</td>
			<td>It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 ml each solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L PBS/Tween/EDTA buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762730</td>
			<td>It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet RED384 System</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td></td>
			<td>Version 9.0.0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5060</td>
			<td>One tray of 96 biosensors&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well Tilted-Bottom Plate&#160;</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosensor Dispenser</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetics Buffer 10X</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-1092</td>
			<td>10X concentration. Contains ProClin 300.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBIS MX96 SPRi System</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensEye COOH-G chip</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>1-09-04-004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.19.3.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRint Data Analysis Software</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.15.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrubber 2</td>
			<td>BioLogic Software</td>
			<td></td>
			<td>Version 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein A/G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms

أجهزة الاستشعار البصرية خالية من التسمية هي أدوات قوية في اكتشاف الأدوية لتوصيف التفاعلات الجزيئية البيولوجية. في هذه الدراسة، وصفنا استخدام أربع منصات جهاز الاستشعار البيولوجي تستخدم بشكل روتيني في مختبرنا لتقييم تقارب وحركية عشرة الأجسام المضادة وحيدة النسيلة عالية تقارب (MABS) ضد طليعة البروتين الإنسان كونفيرتاز سبتيليزين نوع كيكسن 9 (PCSK9) ملزمة. بينما تستمد كلا Biacore T100 وProteOn XPR36 من الرنين راسخة بلازمون السطحية (SPR) والتكنولوجيا، الرئيس السابق لديه أربعة تدفق الخلايا متصلة بواسطة التكوين تدفق المسلسل، في حين أن يعرض الأخيرة 36 ​​نقاط رد الفعل في موازاة ذلك من خلال مرتجلة 6 × 6 تتقاطع التكوين قناة ميكروفلويديك. وIBIS MX96 أيضا تعمل على أساس تكنولوجيا الاستشعار SPR، مع ميزة التصوير الإضافية التي تقدم كشف في التوجه المكاني. هذه التقنية الكشف عن جانب التدفق المستمر Microspotter (CFM) توسع الإنتاجية بشكل كبير عن طريق البريدnabling متعددة طباعة مجموعة والكشف عن 96 رياضية رد فعل في وقت واحد. في المقابل، يستند محاذية RED384 على BioLayer التداخل (BLI) مبدأ البصرية، مع تحقيقات الألياف البصرية بوصفها جهاز الاستشعار البيولوجي للكشف عن نمط التداخل التغييرات على التفاعلات ملزم على سطح الحافة. على عكس المنصات المرتكزة SPR، لا تعتمد على نظام BLI على FLUIDICS تدفق مستمر. بدلا من ذلك، نصائح استشعار جمع القراءات بينما هم منغمسين في حلول تحليلها من صفيحة 384 بئر خلال التحريض المداري. كل من هذه المنصات جهاز الاستشعار البيولوجي مزاياه وعيوبه. لتوفير المقارنة المباشرة من قدرة هذه الصكوك على توفير البيانات الحركية الجودة، والبروتوكولات المذكورة توضح التجارب التي تستخدم نفس الشكل فحص ونفس الكواشف ذات جودة عالية للتميز حركية الضد مستضد التي تناسب بسيط 1: 1 نموذج التفاعل الجزيئي .

ويبين الشكل 1 صورة الأجسام المضادة مجموعة من CFM ومستويات ماب رصدت من قبل وسائل تجميد اثنين، ويبين الشكل 2 sensorgrams ملزم المقابلة ولدت في MX96 من متعدد دورة الحركية ودورة واحدة القياسات الحركية على هذه المصفوفات ماب . وتظهر في الوقت الحقيقي ملزمة ومنحنيات المجهزة حركيا من الأسطح المغلفة الأجسام المضادة متعددة ولدت في منصات جهاز الاستشعار البيولوجي الأربعة في الأرقام 3-6. ويبين الشكل 7 مقارنة بين معدلات الحركية نهائية وملزمة التوازن الثوابت التي تم الحصول عليها من التحليل على المستوى العالمي من هذه المنحنيات ملزمة. جمعية الفردية (ك أ)، التفكك (ك د)، وتوازن (K D) يتم عرض ثوابت ملزمة في الجدول 1. للتدليل على تنوع قواعد البيانات المتولدة داخل الصك نفسه، <stرونغ&gt; ويبين الشكل 8 قطع ك لذلك، ك د، وK D على مختلف الكثافة السطحية ماب، والشكل 9 يقارن أيضا الأنشطة ملزمة حساب الأسطح ماب عبر منصات جهاز الاستشعار البيولوجي. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" /> الشكل 1. متعددة يجند صالحة للأمين يقترن (A) و FC القبض على (B) الأجسام المضادة السطوح من CFM الطباعة في IBIS MX96. وتظهر الصور من صفائف المطبوعة في لوحات اليسرى، حيث المناطق الرمادية محاطة المربعات الحمراء تشير إلى وجود الأجسام المضادة. وتستخدم interspots قتامة تقع بين البقع الأجسام المضادة النشطة للالطرح المرجعية. يحتوي كل عمود جسم مضاد المطبوعة في تركيزات المعايرة المحددة أدناه وعلى يسار الصورة. كميات الأجسام المضادة المطبوعة كميا عن طريق حساب ديوترد fference في نوبات السائبة بين المواقع النشطة ومرجعية في لوحات اليمين. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" /> الشكل 2. مقارنة في الوقت الحقيقي Sensorgrams ملزم من متعدد دورة (A) ودورة واحدة (B) التجارب الحركية في IBIS MX96. يشار إلى أن حقن متتابعة من PCSK9 الإنسان إلى زيادة تركيزات عبر 10 × 8 صفائف الضد فوق كل شريحة sensorgram المقابلة. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" /> <stرونغ&gt; الشكل 3. ملزم Sensorgrams من الأجسام المضادة القبض على التفاعل مع PCSK9 الإنسان و1: 1 الحركية نموذج صالح الأغطية في Biacore T100. يتم تقييم التفاعلات عبر عالية (لوحات أعلى) ومتوسطة (لوحات الوسطى)، والمنخفضة (لوحات أسفل) الأسطح كثافة. خطوط سوداء ناعمة مضافين تمثل تناسب الحركية للإشارات استجابة ملزمة في تركيزات مختلفة PCSK9 الإنسان (خطوط ملونة) إلى 1: نموذج التفاعل 1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (4)" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" /> الشكل 4. ربط Sensorgrams من الأجسام المضادة القبض على التفاعل مع PCSK9 الإنسان و1: 1 الحركية نموذج صالح الأغطية في ProteOn XPR36. يتم تقييم التفاعلات عبر عالية (أعلى لوحات)، ميديum- (لوحات الوسطى)، والمنخفضة (لوحات أسفل) الأسطح كثافة. خطوط سوداء ناعمة مضافين تمثل تناسب الحركية للإشارات استجابة ملزمة في تركيزات مختلفة PCSK9 الإنسان (خطوط ملونة) إلى 1: نموذج التفاعل 1. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 5" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" /> الشكل 5. ربط Sensorgrams من الأجسام المضادة القبض على التفاعل مع PCSK9 الإنسان و1: 1 الحركية نموذج صالح الأغطية في محاذية RED384. يتم تقييم التفاعلات عبر عالية (لوحات أعلى) ومتوسطة (لوحات الوسطى)، والمنخفضة (لوحات أسفل) الأسطح كثافة. الخطوط الحمراء مضافين تمثل تناسب الحركية للإشارات استجابة ملزمة في تركيزات مختلفة PCSK9 الإنسان (خطوط ملونة) إلى 1:<html> 1 نموذج التفاعل. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (6)" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" /> الشكل 6. ربط Sensorgrams للأمين يقترن (A) والقت القبض على التيسير (B) الأجسام المضادة التفاعل مع PCSK9 الإنسان و1: 1 الحركية نموذج صالح الأغطية في IBIS MX96. ويتم تنظيم لمحات ملزمة إلى 10 × 8 لوحات التي تتبع خريطة لوحة مجموعة في الشكل 1. خطوط سوداء تمثل إشارات استجابة ملزمة سجلت في تركيزات مختلفة PCSK9 الإنسان، والخطوط الحمراء مضافين تمثل منحنيات المجهزة. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> جوري 7 &quot;SRC =&quot; / ملفات / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg &quot;/&gt; الرقم 7. مقارنة بين جمعية K على (A)، التفكك ك د (B)، والاتزان K D (C) الثوابت الملزمة منشأ بواسطة أربع منصات جهاز الاستشعار البيولوجي. وتستمد المعلمات الحركية من تحليل عالمي للمنحنيات ملزمة في أرقام 3-6. يتم تمثيل الموجودات على النحو التالي: Biacore T100 (الأزرق)، ProteOn XPR36 (الأخضر)، محاذية RED384 (الحمراء)، IBIS MX96، يقترن أمين (اللون الأرجواني)، وIBIS MX96، FC-القبض على (برتقالي). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 8" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" /> الشكل 8. مقارنة بين تناسق الحركية الثوابت تقييم مدى متعددة كثافات سطح الأجسام المضادة في BIAC<html> خام T100 (A)، ProteOn XPR36 (B)، محاذية RED384 (C)، IBIS MX96، يقترن أمين (D)، وIBIS MX96، التيسير القبض على (E). المعلمات الحركية K و(أعلى فريقي الباطن)، ك د (المتوسطة وحات فرعية)، وK D (أسفل لوحات فرعية) مستمدة من تحليل مجموعة في كثافة سطح الأجسام المضادة الفردية. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الرقم 9" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" /> الشكل 9. الأنشطة ملزمة من الأجسام المضادة السطوح ومنها ستاندرد انحرافات (أشرطة الخطأ) في أربع منصات جهاز الاستشعار البيولوجي. يتم حساب القيم باستخدام المعادلات الموضحة في مقالات أبحاث 17.large.jpg &quot;الهدف =&quot; _ فارغة &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td> ك ل </td><td> ك د </td><td> K D </td></tr><tr><td> (M -1 ق -1) </td><td> (ق -1) </td><td> (نانومتر) </td></tr><tr><td> ماب 1 </td><td> 11.7 (7.8) × 10 5 </td><td> 4.89 (4.18) × 10 -5 </td><td> 0،052 (0.05) </td></tr><tr><td> ماب 2 </td><td> 1.53 (0.28) × 10 5 </td><td> 1.30 (1.54) × 10 -5 </td><td> 0،092 (0.12) </td></tr><tr><td> ماب 3 </td><td> 11.4 (8.3) × 10 5 </td><td> 27.6 (11.0) × 10 -5 </td><td> 0،333 (0.20) </td></tr><tr><td> ماب 4 </td><td> 3.61 (1.6) × 10 5 </td><td> 20.1 (12.3) × 10 -5 </td><td> 0،659 (0.54) </td></tr><tr><td> ماب 5 </td><td> 0.59 (0.21) × 10 5 </td><td> 3.46 (2.50) × 10 -5 </td><td> 0،663 (0.46) </td></tr><tr><td> ماب 6 </td><td> 1.19 (0.78) × 10 5 </td><td> 7.21 (3.83) × 10 -5 </td><td> 0،894 (0.64) </td></tr><tr><td> ماب 7 </td><td> 1.29 (0.53) × 10 5 </td><td> 16.4 (5.63) × 10 -5 </td><td> 1.57 (1.02) </td></tr><tr><td> ماب 8 </td><td> 4.02 (2.23) × 10 5 </td><td> 22.8 (10.7) × 10 -5 </td><td> 0،768 (0.68) </td></tr><tr><td> ماب 9 </td><td> 4.20 (2.13) × 10 5 </td><td> 6.67 (4.3) × 10 -5 </td><td> 0،197 (0.16) </td></tr><tr><td> ماب 10 </td><td> 1.20 (0.49) × 10 5 </td><td> 12.5 (7.64) × 10 -5 </td><td> 1.27 (0.80) </td></tr></tbody></table> الجدول 1: الحركية الأسعار والتوازن ملزم الثوابت من 10 MABS التي تحصل عليها تركيب العالمي للمنحنيات تجليد من أربعة أجهزة الاستشعار البيولوجي إلى 1: التفاعل نموذج 1.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms at JoVE.com

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

نحن هنا وصف البروتوكولات لقياس الأجسام المضادة مستضد تقارب وحركية باستخدام أربع منصات جهاز الاستشعار البيولوجي تستخدم عادة ملزمة.

تصميم عالية تقارب الأجسام المضادة مستضد حركية ملزم باستخدام أربعة منصات جهاز الاستشعار البيولوجي

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

رسم خريطة الموقع ملزم لأبتمر على ATP عن طريق الميكروسكيل Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

الكمي للبكتيريا الحامض الأميني كيناز Autophosphorylation باستخدام الفحص النيتروسليلوز التجليد

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

تحديد البروتينات النباتية الجليد ملزمة من خلال تقييم تثبيط الآيس التبلور وعزل عن طريق الآيس تقارب تنقية

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

الكشف عن برينيليشن جتباسي صغيرة وأنشئ ملزمة باستخدام تجزئة غشاء ومقايسة الممتز GTPase مرتبطة

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

تحليل البروتين الحيوي المجمعات تجميعها على والإفراج عن بيوسينسور بيولايير قياس التداخل باستخدام الطيف الكتلي والمجهر الإلكتروني

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

ميكروجرافيميتري المسرف لدراسة ديناميات ملزمة فسفوليبيد ملزمة البروتين أنيكسين A2 إلى بليرس الدهن الصلب-يؤيد استخدام جهاز رنان مرو

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

قياس حساسية عالية من الانتماءات الملزمة الحمض النووي عامل النسخ بالتنافسية معايرة باستخدام مجهر الأسفار

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

تصور سطح T-خلية مستقبلات ديناميات رباعية الأبعاد باستخدام شعرية الضوء ورقة المجهر

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

كيانات السومو الملزمة (SUBEs) كاداات لإثراء وعزل وتحديد وتوصيف بروتين السومو في سرطان الكبد

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...