Name: determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms
Uploaded: 2017-04-17T15:00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms at JoVE.com

Forfatterne takker Noah Ditto og Adam Miles til teknisk bistand på IBIS MX96.

<ol>
	<li>Cooper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+biosensors+in+drug+discovery.">Optical biosensors in drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).</li><li>Van Regenmortel, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+antigen-antibody+interactions+with+biosensors.">Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors.</a> J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).</li><li>Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+screening+of+antibodies+from+crude+hybridoma+samples+using+Biacore.">Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore.</a> Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).</li><li>Katsamba, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+a+high-affinity+antibody/antigen+interaction+performed+by+multiple+Biacore+users.">Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users.</a> Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).</li><li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+blocking+assays+using+Octet,+ProteOn,+and+Biacore+biosensors.">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).</li><li>Abdiche, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Epitope+Binning+Assays+on+Label-Free+Array-Based+Biosensors+Can+Yield+Exquisite+Epitope+Discrimination+That+Facilitates+the+Selection+of+Monoclonal+Antibodies+with+Functional+Activity.">High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity.</a> PLoS ONE. 9 (3), e92451 (2014).</li><li>Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+monoclonal+antibody+market.">The therapeutic monoclonal antibody market.</a> mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-throughput,+label-free,+real-time+molecular+interaction+analysis.">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li><li>Keighley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+need+for+high+throughput+kinetics+early+in+the+drug+discovery+process.">The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process.</a> Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).</li><li>Lad, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+kinetic+screening+of+hybridomas+to+identify+high-affinity+antibodies+using+bio-layer+interferometry.">High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry.</a> J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).</li><li>Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ProteOn+XPR36TM+Array+System-High+Throughput+Kinetic+Binding+Analysis+of+Biomolecular+Interactions.">The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions.</a> Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).</li><li>Eddings, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+continuous-flow+print+head+for+micro-array+deposition.">Improved continuous-flow print head for micro-array deposition.</a> Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet.</a> Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+ProteOn+XPR36+biosensor+into+a+36-ligand+array+expedites+protein+interaction+analysis.">Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis.</a> Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).</li><li>Rich, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+benchmark+study+using+affinity-based+biosensors.">A global benchmark study using affinity-based biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics.">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dataset+of+the+binding+kinetic+rate+constants+of+anti-PCSK9+antibodies+obtained+using+the+Biacore+T100+ProteOn+XPR36,+Octet+RED384,+and+IBIS+MX96+biosensor+platforms.">Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms.</a> Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).</li><li>Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+size-exclusion+separations+of+proteins+and+polymers+by+UHPLC.">Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC.</a> Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).</li></ol>

Offentliggørelse gebyrer for denne video-artikel blev betalt af Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals.

Vores head-to-head sammenligning undersøgelse viser, at hver biosensor-platform har sine egne styrker og svagheder. Selvom bindingsprofiler- af antistofferne er ens ved visuel sammenligning (figur 3 - 6), og rangordenen af de overtagne kinetiske hastighedskonstanter er meget konsistent mellem instrumenterne (figur 7), viser vores resultater, at SPR-baserede instrumenter med kontinuerlige flow fluidik) er bedre til at løse høj affinitet interaktioner med langsomme dissociationshastigheder. Gradvise stigning i dissociationsfasen observeres i datasæt (fx mAb 2, mAb 5, og mAb 9; figur 5) genereres af BLI fluidik-fri instrument. Denne konstatering kan tilskrives en stor del prøvefordampning over tid i mikropladen, som er en primær begrænsning af systemet. Med denne iboende begrænsning, er det eksperimentelle tid også begrænset til mindre end 12 timer; forsøgene blev derfor programmeret med shOrter gange (500 associering og 30 min dissociation) sammenlignet med de øvrige platforme (10 min forening og 45 min dissociation). Imidlertid afkorte eksperimentelle tid ikke syntes at afbøde virkningerne af fordampning på data kvalitet / konsistens, som hastighedskonstanterne genereret af BLI-instrument udviser mindre linearitet som følge af udsving i nogle af off-rates (figur 8C ). Foruden prøvefordampning kan forskelle i indfangningsreagenserne anvendte også have bidraget til forskellene i de opnåede resultater. Mens protein A / G blev anvendt i alle tre fluidik-baserede SPR platforme blev AHC sensorer anvendes i den ikke-fluidik BLI platform. Da protein A / G er sandsynligvis har en svagere affinitet for mAb&#39;erne end agter AHC, et antistof-baserede biosensoroverflade, off-rates for mAb-antigen-komplekset fra protein A / G-overflader kan kunstigt forekomme hurtigere end opnået fra AHC overflade. Denne mulighed understøttes by de eksperimentelle data, der viser, at de off-rate værdier genereret af BLI platformen var konsekvent lavere end dem, der opnås fra de andre instrumenter (Figur 7, red line). Ikke desto mindre er det BLI platformen har forskellige fordele i forhold til de andre platforme. For eksempel er det meget fleksibel med hensyn til sensor valg og analysekonfiguration grund af de forskellige præcoatede sensorer til øjeblikkelig brug. I vores eksperimenter anvendelse af AHC sensorer elimineret behovet for ligand immobiliseringstrin, hvilket reducerer forberedelsestid. Endvidere BLI platform kræver meget mindre vedligeholdelse sammenlignet med de andre fluidik SPR platforme, som byder komplicerede slanger og værdi switch konfigurationer. Dette træk er en fordel for forsøg med rå prøver, der kan forårsage tilstopning og forureningsproblemerne. Da efterspørgslen efter effektiv, hurtig og nøjagtig identifikation af terapeutiske kandidater stiger, behovet for biosensor gennemløb stiger også. Blandt de fire biosensor platforme, gennemløbet fra biosensoren i stand til 96-ligandsamlingen trykning er den højeste, efterfulgt af biosensoren koblet til en kryds og tværs 36-ligand-formatet og BLI-baserede biosensor med 16-kanals samtidige udlæsning, som i sidste ende øge antallet af interaktioner målt i en enkelt binding cyklus til 96, 36 og 16, henholdsvis. Disse throughput kapaciteter er væsentligt højere end for den traditionelle SPR platform, som er begrænset ved at have kun fire flow-celler forbundet med en enkelt seriel strømning. Da vore forsøg involverede en relativt lille prøve sæt med 10 mAb&#39;er evalueret ved multiple overflade densiteter med lange dissociation gange, de instrumentale gennemløb spillede en moderat rolle ved bestemmelse af effektiviteten af ​​forsøgene. Der var ingen signifikante forskelle i de eksperimentelle tidspunkter af de tre high-throughput platforme, og i alle tilfælde forsøgene blev afsluttet på én dag. På den anden side, krævede de traditionelle serielle flow SPR eksperimenter 3 dage til at fuldføre, på trods af walk-away automatisering af datafangst efter opsætning. I andre undersøgelser, der involverer et stort antal prøver (dvs. i hundreder eller tusinder), for off-rate ranking / kinetisk screening eller epitop binning formål, gennemløbet en kritisk faktor. Skønt gennemløbet i IBIS MX96 er størrelsesordener højere end for de andre biosensorer og er derfor et optimalt valg til disse formål, det har et par mangler. Især arrayet trykning af CFM viser store overflader uoverensstemmelser (figur 1) og reducerede data reproducerbarhed (figur 8D og 8E). For præcise kinetiske målinger, mængden af ​​ligand på biosensoroverfladen er en kritisk parameter, der skal kontrolleres for at sikre, at de bindende reaktioner ikke forstyrres af sekundære faktorer, såsommassetransport eller sterisk hindring. For Biacore T100 og ProteOn XPR36 blev de optimale R L niveauer bestemmes baseret på standard beregning af sæt R max værdier som beskrevet i forskningen artiklen 17. På den anden side, for Oktet RED384 og IBIS MX96 platforme blev mAb capture niveauer opnås empirisk under anvendelse af en serie af 2-fold serielt fortyndede antistoffer ved konstante tider. Manglen på kendskab til eller kontrol opfangningstrinnet resulterede i en høj massefylde overflade og høje bindende svarsignaler (figur 2), der kan have kompromitteret nøjagtigheden af de kinetiske hastighedskonstanter. Endvidere adskillelsen af ​​printeren fra SPR detektoren præsenterer også en udfordring, når der udføres flere bindende cyklus målinger involverer regenereringer. Den eneste måde at udføre multi-cyklus kinetik setup var gennem direkte aminkobling af mAb&#39;erne, i modsætning til at fange gennem mAb Fc af det immobiliserede protein A / Goverflade i de andre tre biosensor platforme. Som et resultat blev en yderligere regenerering scouting eksperiment kræves for at bestemme de optimale regenereringsbetingelser. Resultatet af denne opsætning var knyttet til en ~ 90% lavere observerede overflade aktivitet sammenlignet med Fc capture metoden (figur 9), ud over en længere eksperimentel tid. For at udføre Fc capture metode blev et alternativ single-cyklus kinetisk indfaldsvinkel. Denne fremgangsmåde involverer sekventiel indsprøjtning af analyt ved stigende koncentrationer uden regenerering mellem hver injektion (figur 2). Denne yderst bekvem, men mindre almindeligt anvendt fremgangsmåde ikke blot forkortet den eksperimentelle og reduceret reagensforbruget men også produceret kinetiske hastighedskonstanter meget ligner dem fra de andre biosensorer (Figur 7). Derfor anvender dette med enkelt cyklus kinetik fremgangsmåde overvinder den iboende konfiguration begrænsning af instrumentet og præsenterer enmulighed for at opnå høj opløsning kinetiske hastighedskonstanter i en high-throughput måde. På trods af gennemløb være en stor begrænsning i Biacore T100, vores resultater viser kollektivt, at det genererede de mest konsistente data med den højeste kvalitet. Dette blev efterfulgt af ProteOn XPR36, som har ~ 10 fold højere gennemløb. Deres evne til at frembringe data af høj kvalitet bliver en fordel, når karakterisering høj affinitet antistof-antigen-interaktioner, der kan være teknisk udfordrende, når instrumenternes detektionsgrænser er nået. Mens de systematiske begrænsninger i instrumentering af Oktet RED384 hindrer nøjagtig måling af dissociationshastighedskonstanter (dvs. falder kort af følsomheden til at løse tilstrækkelig signal henfald til langsom off-satser), både Biacore T100 og ProteOn XPR36 kan tilvejebringe følsomme og pålidelige detektion til differentiering.

The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the "gold standard" for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7. 
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96's SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an "all-in-one" setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate "dip-and-read" use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument's fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a "one-shot" kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle. 
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, "Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics"17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biacore T100 System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28975001</td>
			<td>The T100 system has been upgraded to T200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM5 Sensor Chip&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIAevaluation&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Version 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T100 Control Software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>The T100 control software has been upgraded to T200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050&#160;</td>
			<td>It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBS-EP+ Buffer 10&#215;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100669</td>
			<td>Concentrated stock solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials, o.d. 7 mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100212&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps, type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100214&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1760100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteOn Manager Software&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1760200</td>
			<td>Version 3.1.0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLM Sensor Chip</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1765012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762410</td>
			<td>It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regeneration and Conditioning Kit and Buffers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762210</td>
			<td>It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 ml each solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L PBS/Tween/EDTA buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762730</td>
			<td>It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet RED384 System</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td></td>
			<td>Version 9.0.0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5060</td>
			<td>One tray of 96 biosensors&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well Tilted-Bottom Plate&#160;</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosensor Dispenser</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetics Buffer 10X</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-1092</td>
			<td>10X concentration. Contains ProClin 300.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBIS MX96 SPRi System</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensEye COOH-G chip</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>1-09-04-004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.19.3.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRint Data Analysis Software</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.15.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrubber 2</td>
			<td>BioLogic Software</td>
			<td></td>
			<td>Version 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein A/G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms

Label-free optiske biosensorer er stærke værktøjer i lægemiddelforskning til karakterisering af biomolekylære vekselvirkninger. I denne undersøgelse beskriver vi anvendelsen af ​​fire rutinemæssigt anvendte biosensor platforme i vores laboratorium for at evaluere bindingsaffinitet og kinetikken af ​​ti høj affinitet monoklonale antistoffer (mAb&#39;er) mod human proprotein konvertase subtilisin Kexin typen 9 (PCSK9). Mens både Biacore T100 og ProteOn XPR36 er afledt af den veletablerede overfladeplasmonresonans (SPR) teknologi, den tidligere har fire flow-celler forbundet med strømningskonfiguration serial, hvorimod de sidstnævnte præsenterer 36 reaktionsprodukter pletter i parallel gennem en improviseret 6 x 6 kryds og tværs mikrofluidkanal konfiguration. IBIS MX96 fungerer også baseret på den SPR sensor teknologi, med en ekstra billeddannende funktion, der giver detektion i rumlig orientering. Denne detektering teknik kombineret med den kontinuerlige strøm Microspotter (CFM) udvider gennemløbet betydeligt ved eKTIVERING multiplex matrix trykning og detektion af 96 reaktionsprodukter sport samtidigt. I modsætning hertil er den Oktet RED384 baseret på BioLayer interferometri (BLI) optisk princip, med fiberoptiske prober virker som biosensoren til påvisning interferensmønster ændringer ved binding interaktioner ved spidsen overflade. I modsætning til de SPR-baserede platforme, har BLI systemet ikke stole på kontinuerlig flow fluidik; stedet, sensorelementerne tips indsamle aflæsninger, mens de er nedsænket i analyt opløsninger af en 384-brønds mikroplade under orbital omrøring. Hver af disse biosensor platforme har sine egne fordele og ulemper. At tilvejebringe en direkte sammenligning af disse instrumenter evne til at levere kvalitet kinetiske data, de beskrevne protokoller illustrerer eksperimenter, der bruger samme assayformat og de samme reagenser af høj kvalitet til at karakterisere antistof-antigen kinetik der passer til den enkle 1: 1 molekylære interaktion model .

Figur 1 viser antistofarray billedet fra CFM og plettede mAb niveauer ved de to immobiliseringsmetoder, og figur 2 viser de tilsvarende bindende sensorgrammer frembragt i MX96 fra multicyklus kinetiske og med enkelt cyklus kinetiske målinger på disse mAb arrays . Realtid binding og kinetisk monteret kurver fra flere antistof-coatede overflader genereret i de fire biosensor platforme er vist i figurerne 3 - 6. Figur 7 viser sammenligningen af de endelige kinetiske satser og ligevægtsbindingskonstanter opnået fra den globale analyse af disse bindingskurver. Den individuelle association (ka), dissociation (Kd), og ligevægt (KD) bindingskonstanter er vist i tabel 1. For at demonstrere variationen af ​​data indhentet inden for samme instrument, <stRong&gt; Figur 8 viser plots af k a, k d, og KD ved forskellige mAb overflade tætheder, og Figur 9 sammenligner endvidere de beregnede bindingsaktiviteter af mAb overflader tværs biosensorelektroderne platforme. <img alt="figur 1" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" /> Figur 1. Multiplex Ligand Arrays of Amine-koblet (A) og Fc-indfanges (B) Antibody Surfaces fra CFM Udskrivning i IBIS MX96. Billeder af de trykte arrays er vist i de venstre paneler, hvor de grå områder, der afgrænses af røde firkanter indikerer tilstedeværelsen af antistof. De mørkere interspots placeret mellem de aktive antistof pletter anvendes som reference subtraktion. Hver søjle indeholder et antistof trykt på titreringsforsøg koncentrationer identificeret under og til venstre for billedet. Mængderne af de trykte antistoffer kvantificeret ved beregning af difference i løs skift mellem de aktive og referencestoffer steder er vist i de højre paneler. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="figur 2" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" /> Figur 2. Sammenligning af Real-time Binding sensorgrammer fra Multi-cyklus (A) og Single-cyklus (B) Kinetic Forsøg med IBIS MX96. De sekventielle injektioner af humant PCSK9 ved stigende koncentrationer på tværs af de 10 x 8 antistof arrays er bemærket ovenfor hver tilsvarende sensorgram segment. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="figur 3" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" /> <stRong&gt; Figur 3. Binding sensorgrammer af Captured Antistoffer Arbejde med human PCSK9 og 1: 1 Kinetiske Model Fit overlays i Biacore T100. Interaktionerne evalueret i høj- (toppaneler), mellemstor (midterste paneler) og lav (nederste paneler) densitet overflader. De overlejrede glatte sorte linjer repræsenterer den kinetiske pasform af de bindende svarsignaler på forskellige humane PCSK9 koncentrationer (farvede linjer) til en 1: 1 interaktion model. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="figur 4" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" /> Figur 4. Binding sensorgrammer af Captured Antistoffer Arbejde med human PCSK9 og 1: 1 Kinetiske Model Fit overlays i ProteOn XPR36. Interaktionerne evalueret i høj- (toppaneler), medium- (midterste paneler) og lav (bundpanel) overflader tæthed. De overlejrede glatte sorte linjer repræsenterer den kinetiske pasform af de bindende svarsignaler på forskellige humane PCSK9 koncentrationer (farvede linjer) til en 1: 1 interaktion model. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="figur 5" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" /> Figur 5. Binding sensorgrammer af Captured Antistoffer Arbejde med human PCSK9 og 1: 1 Kinetiske Model Fit overlays i Oktet RED384. Interaktionerne evalueret i høj- (toppaneler), mellemstor (midterste paneler) og lav (nederste paneler) densitet overflader. De overlejrede røde linjer repræsenterer den kinetiske pasform af de bindende svarsignaler på forskellige humane PCSK9 koncentrationer (farvede linjer) til en 1:<html> 1 interaktionsmodel. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="figur 6" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" /> Figur 6. Binding sensorgrammer af aminen-koblede (A) og Fc-tilfangetagne (B) Antistoffer Arbejde med human PCSK9 og 1: 1 Kinetiske Model Fit overlays i IBIS MX96. De bindende profiler er organiseret som 10 x 8 paneler, der følger array pladediagram i figur 1. De sorte linier repræsenterer de registrerede bindende svarsignaler på forskellige humane PCSK9 koncentrationer og de overlejrede røde linier repræsenterer de monterede kurver. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> gur 7&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55.659 / 55659fig7.jpg&quot; /&gt; Figur 7. Sammenligning af foreningen k a (A), Dissociation k d (B), og Ligevægt KD (C) bindingskonstanter kommer fra de fire Biosensor platforme. De kinetiske parametre afledt af global analyse af bindingskurverne i figurerne 3 - 6. Instrumenterne er repræsenteret som følger: Biacore T100 (blå), ProteOn XPR36 (grøn), Oktet RED384 (rød), IBIS MX96, amin-koblet (lilla), og IBIS MX96, Fc-indfanges (orange). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="figur 8" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" /> Figur 8. Sammenligning af Sammenhæng i kinetiske hastighedskonstanter over flere antistofoverfladen Tætheder i Biac<html> malm T100 (A), ProteOn XPR36 (B), Oktet RED384 (C), IBIS MX96, amin-koblet (D), og IBIS MX96, Fc-indfanges (E). De kinetiske parametre k a (top underfelter), k d (midterste underfelter), og KD (bottom underfelter) stammer fra gruppe analyse på individuel antistof overfladetæthed. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">Klik her for at se en større version af dette tal.</a> <img alt="figur 9" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" /> Figur 9. Bindende aktiviteter af antistoffet Overflader og deres standardafvigelser (fejlmargener) i fire Biosensor platforme. Værdierne beregnes under anvendelse af ligningerne beskrevet i forskningsartikler 17.large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Klik her for at se en større version af dette tal. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td> k en </td><td> k d </td><td> KD </td></tr><tr><td> (M-1s-1) </td><td> (s-1) </td><td> (nM) </td></tr><tr><td> mAb 1 </td><td> 11,7 (7,8) x 10 5 </td><td> 4,89 (4,18) x 10 -5 </td><td> 0,052 (0,05) </td></tr><tr><td> mAb 2 </td><td> 1,53 (0,28) x 10 5 </td><td> 1,30 (1,54) x 10 -5 </td><td> 0,092 (0,12) </td></tr><tr><td> mAb 3 </td><td> 11,4 (8,3) x 10 5 </td><td> 27,6 (11,0) x 10 -5 </td><td> 0,333 (0,20) </td></tr><tr><td> mAb 4 </td><td> 3,61 (1,6) x 10 5 </td><td> 20,1 (12,3) x 10 -5 </td><td> 0,659 (0,54) </td></tr><tr><td> mAb 5 </td><td> 0,59 (0,21) x 10 5 </td><td> 3,46 (2,50) x 10 -5 </td><td> 0,663 (0,46) </td></tr><tr><td> mAb 6 </td><td> 1,19 (0,78) x 10 5 </td><td> 7,21 (3,83) x 10 -5 </td><td> 0,894 (0,64) </td></tr><tr><td> mAb 7 </td><td> 1,29 (0,53) x 10 5 </td><td> 16,4 (5,63) x 10 -5 </td><td> 1,57 (1,02) </td></tr><tr><td> mAb 8 </td><td> 4,02 (2,23) x 10 5 </td><td> 22,8 (10,7) x 10 -5 </td><td> 0,768 (0,68) </td></tr><tr><td> mAb 9 </td><td> 4,20 (2,13) x 10 5 </td><td> 6,67 (4.3) x 10 -5 </td><td> 0,197 (0,16) </td></tr><tr><td> mAb 10 </td><td> 1,20 (0,49) x 10 5 </td><td> 12,5 (7,64) x 10 -5 </td><td> 1,27 (0,80) </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Kinetic priser og ligevægtsbindingskonstanterne på 10 mAbs opnås ved Global Montering af binding Kurver fra Fire Biosensor Instrumenter til 1: 1 Interaktion Model.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms at JoVE.com

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Vi beskriver her protokoller til måling af antistof-antigen-bindingsaffinitet og kinetik ved anvendelse af fire almindeligt anvendte biosensor platforme.

Bestemmelse af høj-affinitet antistof-antigen Bindende Kinetics Brug Fire Biosensor Platforme

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Kortlægning af bindingssted en aptamer på ATP Brug mikroskala Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantificering af Bakteriel Histidin kinase Autophosphorylering Ved hjælp af en Nitrocellulose-bindingsassay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifikation af Plant Ice-bindende Proteiner Gennem Vurdering af Ice-omkrystallisation inhibering og isolering ved hjælp af is-affinitet Oprensning

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Påvisning af små GTPase Prenylation og GTP bindende ved hjælp af membran fraktionering og GTPase-forbundet Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analysere dynamisk proteinkomplekser samles på og frigivet fra Biolayer interferometri Biosensor ved hjælp af massespektrometri og elektronmikroskopi

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Antistatiske Microgravimetry at studere bindende dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til fast-understøttet Lipid dobbeltlag ved hjælp af et Quartz Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høj følsomhed måling af transskription faktor-DNA bindende tilhørsforhold ved konkurrencedygtige titrering med Fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisere Surface T-Cell Receptor Dynamics Fire-Dimensionelt Ved hjælp af gitter light-sheet mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende enheder (SUBEs) som værktøjer til berigelse, isolation, identifikation og karakterisering af SUMO Proteome i leverkræft

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...