Name: determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms
Uploaded: 2017-04-17T15:00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms at JoVE.com

De auteurs danken Noah Ditto en Adam Miles voor technische bijstand aan de IBIS MX96.

<ol>
	<li>Cooper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+biosensors+in+drug+discovery.">Optical biosensors in drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).</li><li>Van Regenmortel, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+antigen-antibody+interactions+with+biosensors.">Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors.</a> J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).</li><li>Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+screening+of+antibodies+from+crude+hybridoma+samples+using+Biacore.">Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore.</a> Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).</li><li>Katsamba, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+a+high-affinity+antibody/antigen+interaction+performed+by+multiple+Biacore+users.">Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users.</a> Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).</li><li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+blocking+assays+using+Octet,+ProteOn,+and+Biacore+biosensors.">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).</li><li>Abdiche, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Epitope+Binning+Assays+on+Label-Free+Array-Based+Biosensors+Can+Yield+Exquisite+Epitope+Discrimination+That+Facilitates+the+Selection+of+Monoclonal+Antibodies+with+Functional+Activity.">High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity.</a> PLoS ONE. 9 (3), e92451 (2014).</li><li>Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+monoclonal+antibody+market.">The therapeutic monoclonal antibody market.</a> mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-throughput,+label-free,+real-time+molecular+interaction+analysis.">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li><li>Keighley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+need+for+high+throughput+kinetics+early+in+the+drug+discovery+process.">The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process.</a> Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).</li><li>Lad, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+kinetic+screening+of+hybridomas+to+identify+high-affinity+antibodies+using+bio-layer+interferometry.">High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry.</a> J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).</li><li>Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ProteOn+XPR36TM+Array+System-High+Throughput+Kinetic+Binding+Analysis+of+Biomolecular+Interactions.">The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions.</a> Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).</li><li>Eddings, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+continuous-flow+print+head+for+micro-array+deposition.">Improved continuous-flow print head for micro-array deposition.</a> Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet.</a> Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+ProteOn+XPR36+biosensor+into+a+36-ligand+array+expedites+protein+interaction+analysis.">Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis.</a> Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).</li><li>Rich, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+benchmark+study+using+affinity-based+biosensors.">A global benchmark study using affinity-based biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics.">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dataset+of+the+binding+kinetic+rate+constants+of+anti-PCSK9+antibodies+obtained+using+the+Biacore+T100+ProteOn+XPR36,+Octet+RED384,+and+IBIS+MX96+biosensor+platforms.">Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms.</a> Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).</li><li>Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+size-exclusion+separations+of+proteins+and+polymers+by+UHPLC.">Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC.</a> Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).</li></ol>

Publicatie vergoedingen voor deze video-artikel werd betaald door Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals.

Onze head-to-head vergelijking studie toont aan dat elke biosensor platform heeft zijn eigen sterke en zwakke punten. Hoewel de bindingsprofielen van de antilichamen vergelijkbaar door visuele vergelijking (figuren 3-6), en de rangorde van de verkregen kinetische snelheidsconstanten zeer consistent instrumenten (figuur 7), onze resultaten tonen aan dat SPR gebaseerde instrumenten continue stroom vloeistofcomponenten) zijn beter in oplossing met hoge affiniteit interacties met trage dissociatie tarieven. Toenemend verschil in de dissociatiefase waargenomen in datasets (bijvoorbeeld mAb 2, 5 mAb, mAb en 9 Figuur 5) gegenereerd door de BLI fluidics-vrij instrument. Deze bevinding kan grotendeels toegeschreven monster verdamping tijd in de microtiterplaat en een belangrijkste beperking van het systeem. Deze inherente beperking, worden experimentele keer ook beperkt tot minder dan 12 h; de experimenten werden daarom geprogrammeerd met shorter keer (500 s associatie- en dissociatie 30 min) vergeleken met die van andere platformen (10 min associatie- en dissociatie 45 min). Echter, het verkorten van de experimentele tijd niet lijken om de impact van de verdamping op de kwaliteit van de gegevens / consistentie te beperken, als de snelheid constanten die door de BLI-gebaseerde instrument tonen minder lineariteit als gevolg van fluctuaties in een aantal van de off-rates (Figuur 8C ). Naast monster verdamping, kunnen afwijkingen in de invangreagentia die hebben bijgedragen tot de verschillen in de resultaten. Terwijl proteïne A / G werd in alle drie fluidics SPR gebaseerde platforms werden AHC sensoren voor non-fluidics BLI platform. Omdat proteïne A / G zal waarschijnlijk een zwakkere affiniteit voor de mAbs dan doet de AHC, een antilichaam gebaseerde biosensor oppervlak, de off-rates van de mAb-antigeencomplex van het proteïne A / G oppervlakken kan kunstmatig lijkt sneller dan hebben verkregen uit het AHC oppervlak. Deze mogelijkheid wordt ondersteund by de experimentele gegevens die aantonen dat de off-rate waarden gegenereerd door de BLI platform constant lager dan die verkregen uit andere instrumenten (figuur 7, rode lijn). Toch is de BLI platform heeft verschillende voordelen ten opzichte van andere platformen. Zo is het zeer flexibel in sensor keuze en proefconfiguratie gevolg van de verschillende vooraf beklede sensoren voor onmiddellijk gebruik. In onze experimenten, het gebruik van de AHC sensoren langer nodig dat de ligand immobilisatie stappen, waardoor de voorbereidingstijd. Bovendien is de BLI platform vergt minder onderhoud vergeleken met de andere vloeistofcomponenten SPR platforms, die ingewikkeld slangen en waar switchconfiguraties voorzien. Dit kenmerk is een voordeel voor experimenten met ongezuiverde monsters die verstopping en vervuiling problemen kunnen veroorzaken. Omdat de vraag voor een efficiënte, snelle en nauwkeurige identificatie van therapeutische kandidaten toeneemt, neemt de behoefte aan biosensor throughput stijgt eveneens. Van de vier biosensor platforms, het debiet van de biosensor geschikt 96-ligand matrix printen is het hoogst, gevolgd door de biosensor gekoppeld met een kriskras 36-ligand formaat en het BLI-gebaseerde biosensor met 16-kanaals gelijktijdige uitlezing, wat uiteindelijk stijgen het aantal interacties gemeten in een bindcyclus 96, 36 en 16, respectievelijk. Deze throughput mogelijkheden zijn significant hoger dan die van de traditionele SPR platform, dat wordt begrensd doordat slechts vier stroomcellen verbonden door een seriële stroom. Aangezien onze experimenten betrof een relatief kleine steekproef stel 10 mAbs geëvalueerd op verschillende oppervlaktedichtheden met lange dissociatie maal de instrumentele doorvoer speelde matige rol bij het bepalen van de efficiëntie van de experimenten. Er waren geen significante verschillen in de experimentele tijden van de drie high-throughput platformen, en in alle gevallen werden de experimenten in één dag voltooid. Aan de andere kant, de traditionele seriële stroom SPR experimenten vereist 3 dagen in beslag, ondanks de walk-away automatisering van data-acquisitie na de installatie. In andere studies die een groot aantal monsters (dat wil zeggen in de honderden of duizenden) omvatten, voor off-rate ranking / kinetische screening of epitoop binning doeleinden, het debiet wordt een kritische factor. Hoewel de consumptie in IBIS MX96 is orden van grootte hoger dan die van de andere biosensoren en daarom een ​​optimale keuze voor deze doeleinden heeft enkele tekortkomingen. Met name de matrix drukken van de CFM toont groot oppervlak inconsistenties (figuur 1) en gereduceerde data reproduceerbaarheid (Figuur 8D en 8E). Voor nauwkeurige kinetische metingen de hoeveelheid ligand op de biosensor oppervlak een kritische parameter die moet worden geregeld zodanig dat de binding responsen niet worden verstoord door secundaire factoren zoalsmassaoverdracht of sterische hindering. Voor de Biacore T100 en Proteon XPR36 werden de optimale RL niveaus bepaald op basis van de standaardberekening van ingestelde Rmax waarden zoals beschreven in het onderzoek artikel 17. Anderzijds, voor Octet RED384 en IBIS MX96 platforms, het mAb capture niveaus werden bereikt empirisch met behulp van een reeks 2-voudig serieel verdunde antilichamen met constante tijd. Het gebrek aan kennis of controle van de vangstap resulteerde in een hoge dichtheid oppervlak en hoge binding responssignalen (figuur 2) dat de nauwkeurigheid van de kinetische snelheidsconstanten gevaar zouden brengen. Bovendien is de scheiding van de printer in de SPR detector presenteert ook een uitdaging bij het uitvoeren van meerdere metingen bindcyclus met regeneraties. De enige manier om de multi-cycle kinetiek instelling uit te voeren is door directe koppeling van het amine mAb, in tegenstelling tot het mAb Fc te vangen door het geïmmobiliseerde proteïne A / Goppervlak in de andere drie biosensor platforms. Als resultaat werd een extra regeneratie verkennende experimenten nodig om de optimale condities te bepalen regeneratie. Het resultaat van deze opstelling is verbonden met een -90% lager waargenomen oppervlakteactiviteit vergeleken met de Fc invangwerkwijze (figuur 9), naast een experimentele langere tijd. Om de Fc capture methode uit te voeren, werd een alternatief single-cycle kinetische benadering. Deze benadering omvat de achtereenvolgende injectie van analyt toenemende concentraties zonder regeneratie tussen elke injectie (figuur 2). Dit zeer gunstig, maar minder algemeen toegepaste benadering niet alleen verkort de experimentele tijd en verminderde reagensverbruik, maar produceerde ook kinetische snelheidsconstanten vrijwel gelijkwaardig aan die van de andere biosensoren (figuur 7). Daarom deze enkele cyclus kinetiek benadering overwint de inherente beperking configuratie van het instrument en fungeertmogelijkheid tot het verkrijgen van hoge-resolutie kinetische snelheidsconstanten in een high-throughput manier. Ondanks de doorvoer dat een belangrijke beperking in de Biacore T100, onze resultaten laten zien collectief dat het genereren van de meest consistente gegevens met de hoogste kwaliteit. Dit werd gevolgd door de Proteon XPR36 die ~ 10-voudig hogere doorvoer heeft. Hun vermogen om hoge kwaliteit te genereren wordt een voordeel bij het karakteriseren hoge affiniteit antilichaam-antigen interacties die technisch uitdagend zijn wanneer detectielimiet van het instrument bereikt. En de systematische beperkingen in instrumentatie van de Octet RED384 belemmeren de nauwkeurige meting van dissociatiesnelheidsconstanten (dat wil zeggen, achter bij de gevoeligheid voldoende verval van het signaal voor langzame off-rates te lossen), zowel de Biacore T100 en Proteon XPR36 kunnen gevoelig en betrouwbaar is detectie voor differentiatie.

The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the "gold standard" for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7. 
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96's SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an "all-in-one" setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate "dip-and-read" use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument's fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a "one-shot" kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle. 
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, "Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics"17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biacore T100 System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28975001</td>
			<td>The T100 system has been upgraded to T200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM5 Sensor Chip&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIAevaluation&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Version 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T100 Control Software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>The T100 control software has been upgraded to T200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050&#160;</td>
			<td>It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBS-EP+ Buffer 10&#215;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100669</td>
			<td>Concentrated stock solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials, o.d. 7 mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100212&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps, type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100214&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1760100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteOn Manager Software&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1760200</td>
			<td>Version 3.1.0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLM Sensor Chip</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1765012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762410</td>
			<td>It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regeneration and Conditioning Kit and Buffers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762210</td>
			<td>It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 ml each solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L PBS/Tween/EDTA buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762730</td>
			<td>It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet RED384 System</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td></td>
			<td>Version 9.0.0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5060</td>
			<td>One tray of 96 biosensors&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well Tilted-Bottom Plate&#160;</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosensor Dispenser</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetics Buffer 10X</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-1092</td>
			<td>10X concentration. Contains ProClin 300.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBIS MX96 SPRi System</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensEye COOH-G chip</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>1-09-04-004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.19.3.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRint Data Analysis Software</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.15.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrubber 2</td>
			<td>BioLogic Software</td>
			<td></td>
			<td>Version 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein A/G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms

Label-vrije optische biosensoren zijn krachtige hulpmiddelen in drug discovery voor de karakterisering van biomoleculaire interacties. In deze studie beschrijven we het gebruik van vier routinematig biosensor platforms in ons laboratorium om de bindingsaffiniteit en kinetiek van tien hoge affiniteit monoklonale antilichamen (mAbs) tegen humaan subtilisine proprotein convertase Kexin Type 9 (PCSK9) te evalueren. Terwijl zowel Biacore T100 en Proteon XPR36 zijn afgeleid van de gevestigde Surface Plasmon Resonance (SPR) technologie, de eerstgenoemde vier stroomcellen verbonden door seriële stroom configuratie, terwijl laatstgenoemde stelt 36 reactiemengsel spots in parallel via een geïmproviseerde 6 x 6 kruiselings microfluïdische kanaalconfiguratie. IBIS MX96 werkt ook op basis van de SPR sensortechnologie, met een extra imaging functie die detectie bepaalt ruimtelijke oriëntatie. Deze detectietechniek combinatie met de continue toediening Microspotter (CFM) breidt de doorvoersnelheid pernabling multiplex matrix printen en detectie van 96 reactie sport tegelijkertijd. Daarentegen wordt het Octet RED384 basis van de BioLayer interferometrie (BLI) optisch principe met optische probes als de biosensor aan interferentiepatroon detecteren verandert na binding interacties op het tipoppervlak. In tegenstelling tot de SPR-gebaseerde platforms, heeft de BLI-systeem niet vertrouwen op continue stroom fluidics; in plaats daarvan de sensor tips verzamelen metingen terwijl ze in analytoplossingen van een 384-putjes microplaat worden ondergedompeld tijdens orbitaal roeren. Elk van deze biosensor platforms heeft zijn eigen voor- en nadelen. 1 moleculair interactiemodel: een directe vergelijking van het vermogen van deze instrumenten om kwaliteit kinetische gegevens, de beschreven protocollen illustreren experimenten die dezelfde test formaat en dezelfde hoge kwaliteit reagens om antilichaam-antigen kinetiek die de simpele 1 stop karakteriseren bieden .

Figuur 1 het antilichaam matrix beeld van CFM en gespot mAb niveaus van beide immobilisatie werkwijzen en figuur 2 toont het overeenkomstige bindende sensorgrammen gegenereerd in de MX96 van multicyclische kinetische en de single-cycle kinetische volgende mAb arrays . De real-time binding en kinetisch ingerichte curven van verschillende met antilichaam beklede oppervlakken gevormd in de vier biosensor platforms zijn getoond in figuren 3-6. Figuur 7 toont de vergelijking van de uiteindelijke kinetische prijzen en equilibrium bindingsconstanten verkregen uit de globale analyse van deze bindingscurven. De afzonderlijke associatie (ka), dissociatiesnelheid (kd) en evenwicht (KD) bindende constanten worden in tabel 1. Om de variabiliteit van datasets gegenereerd binnen hetzelfde instrument aan te tonen, <strong&gt; Figuur 8 toont grafieken van ka, kd en KD met verschillende mAb oppervlaktedichtheden, en Figuur 9 vergelijkt verder de berekende bindingsactiviteiten van het mAb oppervlakken over de bio platforms. <img alt="Figuur 1" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" /> Figuur 1. Multiplex Ligand geïncorporeerde Amine-gekoppelde (A) en Fc-ingevangen (B) antilichaam oppervlakken van CFM afdrukken in de IBIS MX96. Beelden van de gedrukte arrays worden weergegeven in de linker panelen, waar de grijze gebieden omsloten door rode vierkanten wijzen op de aanwezigheid van het antilichaam. De donkere interspots gelegen tussen actief antilichaam vlekken worden als referentie aftrekken. Elke kolom bevat een antilichaam afgedrukt titratie concentraties beneden en links van de afbeelding aangegeven. De hoeveelheden van de gedrukte antilichamen gekwantificeerd door het berekenen van de difference in bulk verschuivingen tussen de actieve en de referentie locaties worden getoond in de rechterpanelen. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 2" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" /> Figuur 2. Vergelijking van real-time Binding sensorgrammen van multi-cyclus (A) en gedurende één cyclus (B) Kinetische experimenten in IBIS MX96. De opeenvolgende injecties van humaan PCSK9 bij toenemende concentraties over de 10 x 8 antilichaam arrays zijn boven elke corresponderende sensorgram segment genoteerd. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="figuur 3" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" /> <strong&gt; Figuur 3. Binding sensorgrammen van de gevangen antilichamen Interactie met Menselijke PCSK9 en 1: 1 Kinetic Model Geschikte bekledingen in Biacore T100. De interacties worden bestudeerd over hoge (bovenste panelen), middellange (middelste panelen) en lage (bodempanelen) dichtheid oppervlakken. De bedekt gladde zwarte lijnen de kinetische passing van de binding antwoordsignalen bij verschillende concentraties humaan PCSK9 (gekleurde lijnen) in een 1: 1 interactiemodel. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="figuur 4" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" /> Figuur 4. Binding sensorgrammen van de gevangen antilichamen Interactie met Menselijke PCSK9 en 1: 1 Kinetic Model Geschikte bekledingen in Proteon XPR36. De interacties worden geëvalueerd over hoge (bovenste panelen), medium- (middelste panelen) en lage (bodempanelen) dichtheid oppervlakken. De bedekt gladde zwarte lijnen de kinetische passing van de binding antwoordsignalen bij verschillende concentraties humaan PCSK9 (gekleurde lijnen) in een 1: 1 interactiemodel. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="figuur 5" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" /> Figuur 5. Binding sensorgrammen van de gevangen antilichamen Interactie met Menselijke PCSK9 en 1: 1 Kinetic Model Geschikte bekledingen in Octet RED384. De interacties worden bestudeerd over hoge (bovenste panelen), middellange (middelste panelen) en lage (bodempanelen) dichtheid oppervlakken. De overlay rode lijnen de kinetische passing van de binding antwoordsignalen bij verschillende concentraties humaan PCSK9 (gekleurde lijnen) in een 1:<html> 1 interactiemodel. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="figuur 6" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" /> Figuur 6. Binding sensorgrammen van de amine-gekoppelde (A) en Fc-ingevangen (B) antilichamen Interactie met Menselijke PCSK9 en 1: 1 Kinetic Model Geschikte bekledingen in IBIS MX96. De bindingsprofielen zijn georganiseerd als 10 x 8 panelen die de relateringstabel plaat figuur 1 te volgen. De zwarte lijnen de geregistreerde binding antwoordsignalen bij verschillende concentraties humaan PCSK9 en bedekt rode lijnen stellen de gemonteerde bochten. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> guur 7&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg&quot; /&gt; Figuur 7. Vergelijking van de vereniging ka (A), dissociatie kd (B) en Equilibrium KD (C) Binding Constanten Gegenereerd door vier Biosensor platforms. De kinetische parameters worden afgeleid uit de globale analyse van de bindingskrommes in figuren 3-6. De instrumenten worden als volgt vertegenwoordigd: Biacore T100 (blauw), Proteon XPR36 (groen), Octet RED384 (rood), IBIS MX96, amine gekoppeld (paars) en IBIS MX96, Fc-gevangen (oranje). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="Figuur 8" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" /> Figuur 8. Vergelijking van de Consistentie van de Kinetic snelheidsconstanten over meerdere Antibody Surface dichtheden in de Biac<html> ore T100 (A), Proteon XPR36 (B), Octet RED384 (C), IBIS MX96, amine-gekoppelde (D) en IBIS MX96, Fc-ingevangen (E). De kinetische parameters ka (bovenste subpanelen), kd (middelste subpanelen), en KD (bottom subpanelen) afgeleid uit groep analyse op individuele oppervlakte-antilichaam dichtheid. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.</a> <img alt="figuur 9" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" /> Figuur 9. Binding Activiteiten van het antilichaam oppervlakken en hun standaarddeviaties (foutbalken) in het Four Biosensor Platforms. De berekening vindt plaats via vergelijkingen in de onderzoeksartikelen 17 beschreven.large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Klik hier om een ​​grotere versie van deze afbeelding te bekijken. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td> ka </td><td> kd </td><td> K D </td></tr><tr><td> (M-1 s-1) </td><td> (S-1) </td><td> (nM) </td></tr><tr><td> mAb 1 </td><td> 11,7 (7,8) x 10 5 </td><td> 4.89 (4.18) x 10 -5 </td><td> 0,052 (0,05) </td></tr><tr><td> mAb 2 </td><td> 1,53 (0,28) x 10 5 </td><td> 1.30 (1.54) x 10 -5 </td><td> 0,092 (0,12) </td></tr><tr><td> mAb 3 </td><td> 11,4 (8,3) x 10 5 </td><td> 27,6 (11,0) x 10 -5 </td><td> 0,333 (0,20) </td></tr><tr><td> mAb 4 </td><td> 3,61 (1,6) x 10 5 </td><td> 20,1 (12,3) x 10 -5 </td><td> 0,659 (0,54) </td></tr><tr><td> mAb 5 </td><td> 0,59 (0,21) x 10 5 </td><td> 3,46 (2,50) x 10 -5 </td><td> 0,663 (0,46) </td></tr><tr><td> mAb 6 </td><td> 1,19 (0,78) x 10 5 </td><td> 7,21 (3,83) x 10 -5 </td><td> 0,894 (0,64) </td></tr><tr><td> mAb 7 </td><td> 1,29 (0,53) x 10 5 </td><td> 16,4 (5,63) x 10 -5 </td><td> 1,57 (1,02) </td></tr><tr><td> mAb 8 </td><td> 4,02 (2,23) x 10 5 </td><td> 22,8 (10,7) x 10 -5 </td><td> 0,768 (0,68) </td></tr><tr><td> mAb 9 </td><td> 4.20 (2.13) x 10 5 </td><td> 6,67 (4,3) x 10 -5 </td><td> 0,197 (0,16) </td></tr><tr><td> mAb 10 </td><td> 1,20 (0,49) x 10 5 </td><td> 12.5 (7.64) x 10 -5 </td><td> 1.27 (0.80) </td></tr></tbody></table> Tabel 1: Kinetic tarieven en Equilibrium Binding constanten van 10 mAbs Verkregen door Global Fitting bindingskrommes van Four Biosensor Instruments aan de 1: 1 Interaction Model.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms at JoVE.com

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

We beschrijven hier protocollen voor het meten van antilichaam-antigeen-bindende affiniteit en kinetiek met vier gebruikelijke biosensor platforms.

Bepaling van antilichaam met hoge affiniteit antigeen-bindend Kinetics met behulp van vier Biosensor Platforms

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

In kaart brengen van de bindingsplaats van een aptameer op ATP gebruik van microschaal Thermophoresis

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kwantificering van bacteriële histidine kinase autofosforylering Met een Nitrocellulose bindingsassay

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identificatie van Plant Ice-bindende eiwitten Through Beoordeling van Ice-herkristallisatie inhibitie en isolatie met behulp van Ice-affiniteitszuivering

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Detectie van kleine GTPase Prenylation en GTP bindend gebruiken membraan fractionering en GTPase-linked Immunosorbent Assay

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analyseren van de dynamische eiwitcomplexen op gemonteerd en vrijgelaten uit Biolayer interferometrie Biosensor met behulp van spectrometrie van de massa en elektronenmicroscopie

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipatief Microgravimetry te bestuderen van de dynamiek van de Binding van de fosfolipide bindend proteïne Annexine A2 aan lipide Solid-ondersteund Bilayers met behulp van een Resonator Quartz

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Hoge gevoeligheid meten van transcriptie Factor-DNA-bindende affiniteiten concurrerende getitreerd wordt met behulp van fluorescentie microscopie

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualiseren van Surface T-Cell Receptor Dynamics vierdimensionaal met behulp van Rooster Light-Sheet Microscopie

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende entiteiten (SUBEs) als hulpmiddelen voor de verrijking, isolatie, identificatie en karakterisering van de SUMO proteome in leverkanker

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...