Name: determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms
Uploaded: 2017-04-17T15:00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms at JoVE.com

Die Autoren danken Noah Ditto und Adam Miles für technische Hilfe bei der IBIS MX96.

<ol>
	<li>Cooper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+biosensors+in+drug+discovery.">Optical biosensors in drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).</li><li>Van Regenmortel, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+antigen-antibody+interactions+with+biosensors.">Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors.</a> J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).</li><li>Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. 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S. P., Koza, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+size-exclusion+separations+of+proteins+and+polymers+by+UHPLC.">Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC.</a> Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).</li></ol>

Publikationsgebühren für diese Video-Artikel wurden von Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals bezahlt.

Unsere Kopf-an-Kopf-Vergleichsstudie zeigt, dass jede Biosensor-Plattform ihre eigenen Stärken und Schwächen hat. Auch wenn die Bindungsprofile der Antikörper sind ähnlich durch einen visuellen Vergleich (Abbildungen 3 bis 6) und die Rangordnung der erworbenen kinetischen Geschwindigkeitskonstanten sind sehr konsistent über die Instrumente (Abbildung 7), unsere Ergebnisse zeigen , dass SPR-basierte Instrumente mit kontinuierlicher Fluss Fluidik) besser an hochaffine Wechselwirkungen Lösung mit langsamen Dissoziationsraten. Aufwärtsdrift während der Dissoziationsphase wird in Datensatz beobachtet (beispielsweise mAb 2, mAb 5 und mAb 9; Figur 5) , die durch das BLI Fluidik freies Instrument. Diese Feststellung kann zum großen Teil auf Probenverdampfung im Laufe der Zeit in der Mikroplatte zugeschrieben werden, die eine primäre Begrenzung des Systems ist. Mit dieser inhärenten Einschränkung wird die Versuchszeit auch auf weniger als 12 h begrenzt; Experimente wurden daher mit sh programmiertOrter Zeiten (500 s Assoziation und Dissoziation 30 min) im Vergleich zu denen der anderen Plattformen (10 min und 45 min Assoziation Dissoziation). Allerdings hat die Versuchszeit verkürzt wird nicht angezeigt , um die Auswirkungen der Verdampfung auf der Datenqualität / Konsistenz zu mildern, als die Rate erzeugt Konstanten , die durch das BLI-basierte Instrument zeigt weniger Linearität infolge von Schwankungen in einige der off-Raten (8C ). Neben Probe Verdunstung, Unterschiede in den Fangreagenzien verwendet haben auch in den Ergebnissen der Unterschiede beigetragen. Während Protein-A / G in allen drei Fluidik-basierten Plattformen SPR verwendet wurde, wurden AHC-Sensoren in der nicht-Fluidik BLI Plattform verwendet. Da Protein A / G ist wahrscheinlich eine schwächere Affinität für den mAbs haben, als dies der AHC, ein Antikörper-basierte Biosensor-Oberfläche, als diejenigen, die off-Raten des mAb-Antigen-Komplexes aus dem Protein A / G Oberflächen künstlich schneller erscheinen von der AHC Oberfläche erhalten. Diese Möglichkeit wird unterstützt by die experimentellen Daten , die zeigen , dass die off-Rate von der Plattform BLI erzeugten Werte als die von den anderen Instrumenten (7, rote Linie) erhalten durchweg niedriger waren. Dennoch hat die BLI-Plattform verschiedene Vorteile gegenüber den anderen Plattformen. Zum Beispiel ist es sehr flexibel in Bezug auf Sensor Auswahl und Assaykonfiguration aufgrund der verschiedenen vorbeschichtet Sensoren für den sofortigen Gebrauch. Verwendung der AHC-Sensoren In unseren Experimenten eliminiert die Notwendigkeit für Ligand Immobilisierung Schritte, die Verringerung der Vorbereitungszeit. Darüber hinaus erfordert die BLI-Plattform viel weniger Wartung im Vergleich zu den anderen Fluidik SPR-Plattformen, die komplizierte Schläuche und Wert Switch-Konfigurationen verfügen. Diese Funktion ist ein Vorteil für Experimente mit rohen Proben, die Verstopfung und Verschmutzung Probleme verursachen kann. Da die Nachfrage nach effizienten, schnellen und genauen Identifizierung von therapeutischen Kandidaten erhöht, die Notwendigkeit biosensor Durchsatz steigt ebenfalls. Unter den vier Biosensorplattformen, der Durchsatz von dem Biosensor der Lage, 96-Liganden-Array-Druck ist am höchsten ist, durch den Biosensor gefolgt gekoppelt mit einem kreuz und quer durch 36-Liganden-Format und der BLI-basierten Biosensor mit 16-Kanal-Simultanauslese, die letztlich erhöhen die Anzahl der Wechselwirkungen in einem einzelnen Bindungszyklus gemessen auf 96, 36 bzw. 16. Diese Durchsatzkapazitäten sind deutlich höher als die der herkömmlichen SPR-Plattform, die sich durch nur vier Fließzellen begrenzt wird durch einen einzigen seriellen Fluss verbunden. Da unsere Experimente einen relativ kleinen Probensatz von 10 mAbs bewertet an mehreren Oberflächendichten mit langen Dissoziation Zeiten beteiligt, spielten die Instrumentaldurch eine moderate Rolle, die Effizienz der Versuche zu bestimmen. Es gab keine signifikanten Unterschiede in den experimentellen Zeiten der drei Hochdurchsatz-Plattformen und in allen Fällen wurden die Versuche in einem Tag abgeschlossen. Auf der anderen Seite sind die traditionellen seriellen Fluss SPR Experimente erforderlich 3 Tage in Anspruch nehmen, trotz der Walk-away Automatisierung der Datenerfassung nach dem Setup. In anderen Studien , die eine große Anzahl von Proben (dh in den Hunderten oder Tausenden), für die Off-Rate - Ranking / kinetischen Screening oder Epitop Binning Zwecke beinhalten, wird der Durchsatz ein kritischer Faktor. Obwohl der Durchsatz in der IBIS MX96 Größenordnungen höher ist als die der anderen Biosensoren und ist daher eine optimale Wahl für diese Zwecke hat es einige Mängel. Insbesondere zeigt das Array Drucken durch die CFM große Oberfläche Inkonsistenzen (Abbildung 1) und reduzierte Datenreproduzierbarkeit (8D und 8E). Für eine genaue kinetische Messungen wird die Menge an Liganden auf der Biosensoroberfläche ein kritischer Parameter, der gesteuert werden muss, um sicherzustellen, dass die Bindungsreaktionen nicht durch Sekundärfaktoren, wie beispielsweise gestörtMassentransfer oder sterische Hinderung. Für den Biacore T100 und PROTEON XPR36 wurden die optimalen Niveaus L R auf der Grundlage der Standardberechnung des Satzes R max - Werte bestimmt , wie 17 in der Forschung Artikel beschrieben. Auf der anderen Seite, für die die Oktett RED384 und IBIS MX96 Plattformen wurden die mAb capture Ebenen empirisch unter Verwendung einer Reihe von 2-fach seriell verdünnten Antikörper in konstanten Zeiten erreicht. Der Mangel an Wissen oder Steuerung des Einfangschritt führte zu einer hochdichten Oberfläche und hohen Bindungsantwortsignalen (Abbildung 2), die die Genauigkeit der kinetischen Geschwindigkeitskonstanten beeinträchtigt haben könnten. Darüber hinaus stellt die Trennung des Druckers aus dem SPR-Detektor auch eine Herausforderung, wenn mehrere Bindungszyklusmessungen die Regenerationen leiten. Der einzige Weg, um den Multi-cycle kinetics Setup durchzuführen war, durch direkte Kopplung des Amin mAbs, wie durch den mAb Fc durch das immobilisierte Protein A / G zu erfassen, im GegensatzOberfläche in den anderen drei Biosensorplattformen. Als Ergebnis wurde ein zusätzliches Regeneration Scouting Experiment erforderlich, um die optimalen Regenerationsbedingungen zu bestimmen. Das Ergebnis dieser Anordnung wurde auf eine ~ 90% niedriger beobachteten Oberflächenaktivität verknüpft verglichen mit dem Fc - Capture - Verfahren (Figur 9), zusätzlich zu einer längeren Versuchszeit. Zur Ausführung wurde die Fc-Capture-Methode ein alternativen Single-Cycle-kinetischer Ansatz angenommen. Dieser Ansatz beinhaltet die sequentielle Injektion von Analyten bei Konzentrationen ohne Regeneration zwischen jeder Injektion (Abbildung 2) zu erhöhen. Dieser sehr bequem, aber weniger häufig angewandt Ansatz nicht nur die Versuchszeit verkürzt und Reagenzienverbrauch reduziert, sondern auch die kinetischen Geschwindigkeitskonstanten sehr ähnlich zu denen von den anderen Biosensoren (Abbildung 7) hergestellt. Daher überwindet die inhärente Beschränkung Konfiguration dieses Single-Cycle-Kinetik Ansatz Anwendung des Instruments und stellt einMöglichkeit für die hochauflösende kinetische Geschwindigkeitskonstanten in einer Hochdurchsatz-Weise zu erhalten. Trotz des Durchsatz eine große Einschränkung in der Biacore T100 sein, unsere Ergebnisse zeigen gemeinsam, dass sie die meisten konsistenten Daten mit höchster Qualität erzeugt. Dies wurde von der PROTEON XPR36 gefolgt, das hat ~ 10-fach höheren Durchsatz. Ihre Fähigkeit, qualitativ hochwertige Daten zu erzeugen, wird ein Vorteil, wenn die Charakterisierung hochaffine Antikörper-Antigen-Wechselwirkungen, die technisch anspruchsvoll sein können, wenn die Nachweisgrenzen der Instrumente erreicht werden. Während die systematischen Einschränkungen in Instrumentierung des Octet RED384 die genaue Messung der Dissoziationsgeschwindigkeitskonstanten hindern (dh kurz die Empfindlichkeit fällt bei langsamer Off-Raten ausreichenden Signalabfall zu lösen), die beide der Biacore T100 und PROTEON XPR36 kann empfindlich und zuverlässig liefern Nachweis für die Differenzierung.

The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the "gold standard" for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7. 
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96's SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an "all-in-one" setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate "dip-and-read" use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument's fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a "one-shot" kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle. 
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, "Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics"17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biacore T100 System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28975001</td>
			<td>The T100 system has been upgraded to T200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM5 Sensor Chip&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIAevaluation&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Version 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T100 Control Software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>The T100 control software has been upgraded to T200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050&#160;</td>
			<td>It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBS-EP+ Buffer 10&#215;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100669</td>
			<td>Concentrated stock solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials, o.d. 7 mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100212&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps, type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100214&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1760100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteOn Manager Software&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1760200</td>
			<td>Version 3.1.0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLM Sensor Chip</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1765012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762410</td>
			<td>It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regeneration and Conditioning Kit and Buffers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762210</td>
			<td>It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 ml each solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L PBS/Tween/EDTA buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762730</td>
			<td>It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet RED384 System</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td></td>
			<td>Version 9.0.0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5060</td>
			<td>One tray of 96 biosensors&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well Tilted-Bottom Plate&#160;</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosensor Dispenser</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetics Buffer 10X</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-1092</td>
			<td>10X concentration. Contains ProClin 300.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBIS MX96 SPRi System</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensEye COOH-G chip</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>1-09-04-004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.19.3.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRint Data Analysis Software</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.15.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrubber 2</td>
			<td>BioLogic Software</td>
			<td></td>
			<td>Version 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein A/G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms

Markierungsfreie optische Biosensoren sind leistungsfähige Werkzeuge in der Wirkstoffforschung für die Charakterisierung von biomolekularen Wechselwirkungen. In dieser Studie beschreiben wir die Verwendung von vier routinemäßig verwendet Biosensorplattformen in unserem Labor die Bindungsaffinität und Kinetik von zehn hochaffine monoklonale Antikörper (mAb) gegen menschliche Proproteinkonvertase Subtilisin Kexin Typ 9 (PCSK9) zu bewerten. Während beiden Biacore T100 und PROTEON XPR36 vom etablierten Oberflächenplasmonresonanz (SPR) -Technologie abgeleitet werden, haben die erstere vier Strömungszellen durch Reihenströmungskonfiguration verbunden ist, während die letztere präsentieren 36 Reaktionsstellen parallel durch ein improvisiertes 6 x 6-Gewirr Mikrofluidik-Kanalkonfiguration. Die IBIS MX96 arbeitet auf der SPR-Sensortechnik, mit einem zusätzlichen Abbildungsmerkmal auch basiert, die Erkennung in der räumlichen Orientierung bietet. Diese Erfassungstechnik in Verbindung mit der Continuous Flow Microspotter (CFM) erweitert den Durchsatz signifikant durch enabling Multiplexreihendruck und der Nachweis von 96 Reaktionssport gleichzeitig. Im Gegensatz dazu ist das Oktett RED384 basierend auf der Bioschicht Interferometry (BLI) optische Prinzip, mit faseroptischen Sonden als Biosensor wirkende Interferenzmuster zu erfassen, wechselt auf Wechselwirkungen an der Spitzenoberfläche zu binden. Im Gegensatz zu den SPR-basierten Plattformen, das BLI-System beruht nicht auf kontinuierlichem Fluss Fluidik; Stattdessen sammeln die Sensorspitzen Lesungen, während sie in Analyt-Lösungen einer 384-Well-Mikroplatte während der umlaufenden Bewegung eingetaucht sind. Jede dieser Biosensorplattformen hat seine eigenen Vor- und Nachteile. Um eine Fähigkeit, einen direkten Vergleich dieser Instrumente Qualität kinetische Daten zur Verfügung zu stellen, die beschriebenen Protokolle zeigen Experimente, die das gleiche Assay-Format und die gleichen hochwertigen Reagenzien verwenden, um Antikörper-Antigen-Kinetik zu charakterisieren, die das einfache 1 passen: 1 molekulare Interaktionsmodell .

Abbildung 1 zeigt die Antikörperarray Bild aus dem CFM und das beschmutzte mAb Ebenen durch die beiden Immobilisierungsverfahren, und Abbildung 2 zeigt die entsprechenden Bindungssensorgramme, die in dem MX96 aus dem Mehrzyklus kinetischen und der Einzelzyklus kinetische Messungen an diesem mAb - Arrays . Die Echtzeit - Bindung und kinetisch angepaßte Kurven von verschiedenen Antikörpern-beschichteten Oberflächen in den vier Biosensorplattformen erzeugt werden , in den Figuren 3 bis 6. Abbildung 7 zeigt den Vergleich der endgültigen kinetischen Raten und Gleichgewichtsbindungskonstanten von der globalen Analyse dieser Bindungskurven erhalten. Die einzelne Association (k a), Dissoziation (k d), und das Gleichgewicht (K D) Bindungskonstanten ist in Tabelle 1 dargestellt. die Variabilität der Datensätze innerhalb des gleichen Instrument erzeugt Um zu demonstrieren, <stRong&gt; 8 zeigt Diagramme von k a, k d, K und D bei Dichten verschiedener mAb Oberfläche, und Figur 9 vergleicht weiter die berechneten Bindungsaktivitäten der mAb Oberflächen über die Biosensor - Plattformen. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" /> Abbildung 1. Multiplex Ligand Arrays von Amin-gekoppelte (A) und Fc-erfasst (B) Antikörper Surfaces von CFM Drucken im IBIS MX96. Bilder der gedruckten Arrays werden in den linken Tafeln gezeigt, wo die grauen Bereiche von roten Quadrate zeigen die Anwesenheit von Antikörper eingeschlossen. Die dunkleren interspots zwischen den aktiven Antikörperstellen befinden Referenz Subtraktion verwendet. Jede Spalte enthält einen Antikörper, an den Titration Konzentrationen unterhalb und links von dem Bild identifiziert gedruckt. Die Mengen der gedruckten Antikörper quantitativ bestimmt, indem die Berechnung difference in bulk Verschiebungen zwischen den aktiven und Referenzstellen sind in den rechten Platten gezeigt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" /> Abbildung 2. Vergleich von Echtzeit - Bindung Sensogramme von Multi-Zyklus (A) und Einzelzyklus (B) Kinetische Experimente im IBIS MX96. Die aufeinanderfolgenden Injektionen von menschlichen PCSK9 bei Konzentrationen über den 10 x 8-Antikörper-Arrays erhöht, sind oberhalb jedem entsprechenden Sensorgramm Segment festgestellt. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 3" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" /> <stRong&gt; Figure 3. Bindung Sensorgramme der aufgenommenen Antibodies Interagieren mit Menschen PCSK9 und 1: 1 kinetisches Modell Fit Overlays in dem Biacore T100. Die Interaktionen werden über Hoch- (Toppanels) bewertet, Mittel- (mittlere Felder) und Low- (Bodenplatten) Dichte Oberflächen. Die überlagerten glatten schwarzen Linien stellen die kinetische Passung der Bindungsantwortsignale bei verschiedenen menschlichen PCSK9 Konzentrationen (farbige Linien) zu einem 1: 1-Interaktionsmodell. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 4" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" /> Abbildung 4. Bindung Sensorgramme der aufgenommenen Antibodies Interagieren mit Menschen PCSK9 und 1: 1 kinetisches Modell Fit Overlays in der PROTEON XPR36. Die Wechselwirkungen werden über Hoch- (Toppanels) ausgewertet, mediUm- (mittlere Felder) und Low- (Bodenplatten) Dichte Oberflächen. Die überlagerten glatten schwarzen Linien stellen die kinetische Passung der Bindungsantwortsignale bei verschiedenen menschlichen PCSK9 Konzentrationen (farbige Linien) zu einem 1: 1-Interaktionsmodell. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 5" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" /> Abbildung 5 : Bindung der aufgenommenen Sensorgramme Antibodies Interagieren mit Menschen PCSK9 und 1: 1 kinetisches Modell Fit Overlays in dem Octet RED384. Die Interaktionen werden über Hoch- (Toppanels) bewertet, Mittel- (mittlere Felder) und Low- (Bodenplatten) Dichte Oberflächen. Die überlagerten roten Linien stellen die kinetische Passung der Bindungsantwortsignale bei verschiedenen menschlichen PCSK9 Konzentrationen (farbige Linien) zu einem 1:<html> 1 Interaktionsmodell. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 6" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" /> Abbildung 6. Die Bindung Sensorgramme der Amingekoppelten (A) und Fc-erfasst (B) Antikörper Interagieren mit Menschen PCSK9 und 1: 1 kinetisches Modell Fit Overlays im IBIS MX96. Die Bindungsprofile als 10 x 8 organisiert Platten, die die Anordnungsplatte Karte in Abbildung 1 folgen. Die schwarzen Linien stellen die aufgezeichneten Bindungsantwortsignale bei verschiedenen menschlichen PCSK9 Konzentrationen, und die überlagerten roten Linien stellen die angepaßten Kurven. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> Abbildung 7&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg&quot; /&gt; Abbildung 7 : Vergleich des Verbandes k a (A), Dissociation k d (B) und Equilibrium K D (C) Bindungskonstanten , die durch die vier Biosensorplattformen. Die kinetischen Parameter werden von den globalen Analyse der Bindungskurven in den Fig abgeleitet von 3 bis 6. Die Instrumente werden wie folgt dargestellt: Biacore T100 (blau), PROTEON XPR36 (grün), Octet RED384 (rot), IBIS MX96, Amin-gekoppelt (lila) und IBIS MX96, Fc-erfasst (orange). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Abbildung 8" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" /> Abbildung 8. Vergleich der Konsistenz von Geschwindigkeitskonstanten über mehr Antikörper Oberflächendichten in der Biac<html> ore T100 (A), PROTEON XPR36 (B), Octet RED384 (C), IBIS MX96, Amin-gekoppelt (D), und IBIS MX96, Fc-erfasst (E). Die kinetischen Parameter k a (oben-Subfelder), k d (mittlere Teilplatten) und K D (untere Teilplatten) aus Gruppenanalyse an einzelnen Antikörperoberflächendichte abgeleitet. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="9" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" /> Abbildung 9. Bindungsaktivitäten der Antikörper Oberflächen und deren Standardabweichungen (Fehlerbalken) in den vier Biosensorplattformen. Die Werte werden unter Verwendung der Gleichungen in dem Forschungs Artikel 17 beschrieben , berechnet.large.jpg“target =‚_ blank‘&gt; Bitte hier klicken, um eine größere Version dieser Figur zu sehen. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td> k a </td><td> Kd </td><td> K D </td></tr><tr><td> (M -1 s -1) </td><td> (s -1) </td><td> (nM) </td></tr><tr><td> mAb 1 </td><td> 11,7 (7,8) x 10 5 </td><td> 4,89 (4,18) x 10 -5 </td><td> 0,052 (0,05) </td></tr><tr><td> mAb 2 </td><td> 1,53 (0,28) x 10 5 </td><td> 1,30 (1,54) x 10 -5 </td><td> 0,092 (0,12) </td></tr><tr><td> mAb 3 </td><td> 11,4 (8,3) x 10 5 </td><td> 27,6 (11,0) x 10 -5 </td><td> 0,333 (0,20) </td></tr><tr><td> mAb 4 </td><td> 3,61 (1,6) x 10 5 </td><td> 20,1 (12,3) x 10 -5 </td><td> 0,659 (0,54) </td></tr><tr><td> mAb 5 </td><td> 0,59 (0,21) x 10 5 </td><td> 3,46 (2,50) x 10 -5 </td><td> 0,663 (0,46) </td></tr><tr><td> mAb 6 </td><td> 1,19 (0,78) x 10 5 </td><td> 7,21 (3,83) x 10 -5 </td><td> 0,894 (0,64) </td></tr><tr><td> mAb 7 </td><td> 1,29 (0,53) x 10 5 </td><td> 16,4 (5,63) x 10 -5 </td><td> 1,57 (1,02) </td></tr><tr><td> mAb 8 </td><td> 4,02 (2,23) x 10 5 </td><td> 22,8 (10,7) x 10 -5 </td><td> 0,768 (0,68) </td></tr><tr><td> mAb 9 </td><td> 4,20 (2,13) x 10 5 </td><td> 6,67 (4,3) x 10 -5 </td><td> 0,197 (0,16) </td></tr><tr><td> mAb 10 </td><td> 1,20 (0,49) x 10 5 </td><td> 12,5 (7,64) x 10 -5 </td><td> 1,27 (0,80) </td></tr></tbody></table> Tabelle 1: Kinetische Preise und Equilibrium Bindungskonstanten von 10 mAbs Erhalten von Global Einbau von Bindungskurven von vier Biosensor Instruments zum 1: 1 - Interaktionsmodell.

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