Name: determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms
Uploaded: 2017-04-17T15:00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms at JoVE.com

著者は、IBIS MX96の技術支援のためにノア・ディットとアダム・マイルズ感謝します。

<ol>
	<li>Cooper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+biosensors+in+drug+discovery.">Optical biosensors in drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).</li><li>Van Regenmortel, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+antigen-antibody+interactions+with+biosensors.">Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors.</a> J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).</li><li>Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+screening+of+antibodies+from+crude+hybridoma+samples+using+Biacore.">Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore.</a> Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).</li><li>Katsamba, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+a+high-affinity+antibody/antigen+interaction+performed+by+multiple+Biacore+users.">Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users.</a> Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).</li><li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+blocking+assays+using+Octet,+ProteOn,+and+Biacore+biosensors.">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).</li><li>Abdiche, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Epitope+Binning+Assays+on+Label-Free+Array-Based+Biosensors+Can+Yield+Exquisite+Epitope+Discrimination+That+Facilitates+the+Selection+of+Monoclonal+Antibodies+with+Functional+Activity.">High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity.</a> PLoS ONE. 9 (3), e92451 (2014).</li><li>Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+monoclonal+antibody+market.">The therapeutic monoclonal antibody market.</a> mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-throughput,+label-free,+real-time+molecular+interaction+analysis.">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li><li>Keighley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+need+for+high+throughput+kinetics+early+in+the+drug+discovery+process.">The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process.</a> Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).</li><li>Lad, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+kinetic+screening+of+hybridomas+to+identify+high-affinity+antibodies+using+bio-layer+interferometry.">High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry.</a> J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).</li><li>Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ProteOn+XPR36TM+Array+System-High+Throughput+Kinetic+Binding+Analysis+of+Biomolecular+Interactions.">The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions.</a> Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).</li><li>Eddings, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+continuous-flow+print+head+for+micro-array+deposition.">Improved continuous-flow print head for micro-array deposition.</a> Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet.</a> Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+ProteOn+XPR36+biosensor+into+a+36-ligand+array+expedites+protein+interaction+analysis.">Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis.</a> Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).</li><li>Rich, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+benchmark+study+using+affinity-based+biosensors.">A global benchmark study using affinity-based biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics.">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dataset+of+the+binding+kinetic+rate+constants+of+anti-PCSK9+antibodies+obtained+using+the+Biacore+T100+ProteOn+XPR36,+Octet+RED384,+and+IBIS+MX96+biosensor+platforms.">Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms.</a> Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).</li><li>Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+size-exclusion+separations+of+proteins+and+polymers+by+UHPLC.">Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC.</a> Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).</li></ol>

このビデオ記事の掲載料は、ベーリンガーインゲルハイム製薬によって支払われました。

私たちの頭に頭の比較研究では、各バイオセンサープラットフォームは、独自の長所と短所を持っていることを示しています。抗体の結合プロフィールは、視覚的な比較（ 図3から6）により類似しているにもかかわらず、取得した速度論的速度定数の順位（ 図7）機器を横切って非常に一貫している、我々の結果はとそのSPRベースの器具を示します連続流動流体工学）遅い解離速度を有する高親和性相互作用を解決するに優れています。解離相中上方ドリフトがデータセットで観察される（ 例えば 、モノクローナル抗体2、モノクローナル抗体5、およびmAb 9; 図5）BLIの流体フリー機器によって生成されました。この知見は、システムの主要な制限であるマイクロプレートに時間をかけて蒸発をサンプリングするために大部分起因すると考えることができます。この固有の制限で、実験時間はまた、12未満の時間に制限されます。実験は、そのためのshでプログラムされました他のプラットフォーム（10分間会合および45分間解離）のものと比較しorter時間（500秒会合および30分間解離）。 BLIベースの機器によって生成された速度定数は、オフレートのいくつかの変動の結果（ 図8Cのように少ない直線性を示ししかし、実験時間を短縮することは、データ品質/一貫性に蒸発の影響を緩和するようには見えませんでした）。サンプルの蒸発に加えて、使用される捕捉試薬の違いはまた、得られた結果の違いに寄与したかもしれません。プロテインA / Gは、全ての3つの流体ベースのSPRプラットフォームで使用されたが、AHCセンサは、非流体のBLIのプラットフォームで使用しました。プロテインA / GはAHC、抗体に基づくバイオセンサー表面、プロテインA / G表面からのmAb、抗原複合体のオフ速度が人工のものよりも速く表示されることよりも、モノクローナル抗体のために弱い親和性を有する可能性があるのでAHC表面から得られました。この可能性は、BがサポートされていますY BLIプラットフォームによって生成されたオフ速度値は、他の機器（ 図7、 赤線 ）から得られたものよりも一貫して低かったことを示す実験データ。それにも関わらず、BLIプラットフォームは、他のプラットフォームの上に別の利点があります。例えば、それが原因すぐに使用するための種々のプレコートセンサにセンサ選択およびアッセイ形態に関して非常に柔軟です。我々の実験では、AHCセンサの使用は、準備時間を短縮、リガンド固定化工程の必要性を排除しました。さらに、BLIプラットフォームは、複雑なチューブと値スイッチ構成を備え、他の流体工学SPRプラットフォームに比べてはるかに少ないメンテナンスを必要とします。この機能は、目詰まりや汚染の問題を引き起こす可能性があり、粗サンプルを伴う実験のために有利です。 治療の候補者が増加し、効率的、迅速、かつ正確な識別のための需要が、双方向の必要性として、osensorスループットも高まっています。 4つのバイオセンサプラットフォームのうち、96リガンドアレイ印刷が可能なバイオセンサーからのスループット、最終的に増加縦横に36リガンドフォーマットと16チャンネル同時読み出しとBLIベースのバイオセンサーに結合されたバイオセンサー、続いて、最高であります相互作用の数は、それぞれ96、36および16に単一の結合サイクルで測定します。これらスループット能力は、単一のシリアルフローによって接続のみ4つのフローセルを有することによって制限されている伝統的なSPRプラットフォームのそれよりも有意に高いです。我々の実験は、長い解離時間を持つ複数の面密度で評価した10のmAbの比較的小さなサンプルセットを関与するので、楽器のスループットは、実験の効率を決定する際に、適度な役割を果たしました。そこ3つの高スループットプラットフォームの実験回数に有意差はなかった、とすべてのケースでの実験は、一日で完成しました。一方、従来のシリアルフローSPR実験は、セットアップ後のデータ収集のウォークアウェイ自動化にもかかわらず、完了するまでに3日を要しました。オフ率ランキング/動態スクリーニングまたはエピトープビニングの目的のために、（数百または数千でIE）多数のサンプルを必要とする他の研究では、スループットが重要な要因となります。 IBIS MX96でのスループットは他のバイオセンサーに比べて桁違いに高くなっているため、これらの目的のために最適な選択ですが、それはいくつかの欠点があります。具体的には、CFMによってアレイ印刷は、大きな表面の不整合（ 図1）と低減されたデータの再現性（ 図8D及び8E）を示します。正確な速度論的測定のために、バイオセンサー表面上のリガンドの量は、結合応答が等の二次的要因によって妨害されないように制御される必要がある重要なパラメータであります物質移動や立体障害。ビアコアT100とのProteon XPR36ため、最適なRのLレベルは、研究第17条に記載されるように設定されたR max値の標準的な計算に基づいて決定しました。一方、オクテットRED384とIBIS MX96プラットフォームのため、モノクローナル抗体の捕捉レベルは一定の時間で2倍連続希釈した抗体の系列を用いて実験的に達成されました。捕捉工程の知識又は制御の欠如は、動力学的速度定数の精度を妥協している場合があり、高密度表面と高い結合応答信号（ 図2）が得られました。再生のに関与する複数の結合サイクル測定を行う場合、さらに、SPR検出器からプリンタの分離はまた、課題を提示します。固定化されたプロテインA / GでのmAbのFcを通じてキャプチャとは対照的に、マルチサイクル速度設定を実行する唯一の方法は、mAbの直接アミン結合を介しました他の三つのバイオセンサープラットフォームで表面。結果として、追加の再生スカウト実験は、最適な再生条件を決定するために必要でした。この設定の結果は、より長い実験時間に加えたFc捕捉方法（ 図9）と比較して〜90％低い観察表面活性に連結しました。 Fc捕捉方法を実行するために、別の単一サイクル運動アプローチを採用しました。このアプローチは、各注射（ 図2）との間で再生することなく、漸増濃度での分析物の連続注入を含みます。この利便性の高い、あまり一般的に適用されるアプローチでは、実験時間を短縮し、試薬の消費量を低減するだけでなく、他のバイオセンサー（ 図7）からのものと非常に類似した動力学的速度定数を生じました。したがって、このシングルサイクルの動力学アプローチを適用することは、器具の固有の構成の制限を克服し、提示しますハイスループットな方法で高解像度の反応速度定数を得るための機会。 スループットはビアコアT100の主要な制約にもかかわらず、我々の結果をまとめ、それが最高の品質で最も一貫性のあるデータを生成することを示しています。これは〜10倍高いスループットを持っているのProteon XPR36、続きました。器具検出限界に達したときに技術的に困難であることができる高親和性の抗体 - 抗原相互作用を特徴づける場合、高品質のデータを生成する能力が利点となります。オクテットRED384の計測における体系的な制限は、解離速度定数の正確な測定を妨げている間（ すなわち 、オフ速度が遅いために十分な信号減衰を解決するための感度の短い落下）、ビアコアT100とのProteon XPR36の両方を高感度かつ信頼性の高い提供することができます分化の検出。

The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the "gold standard" for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7. 
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96's SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an "all-in-one" setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate "dip-and-read" use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument's fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a "one-shot" kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle. 
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, "Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics"17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biacore T100 System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28975001</td>
			<td>The T100 system has been upgraded to T200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM5 Sensor Chip&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIAevaluation&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Version 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T100 Control Software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>The T100 control software has been upgraded to T200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050&#160;</td>
			<td>It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBS-EP+ Buffer 10&#215;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100669</td>
			<td>Concentrated stock solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials, o.d. 7 mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100212&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps, type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100214&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1760100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteOn Manager Software&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1760200</td>
			<td>Version 3.1.0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLM Sensor Chip</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1765012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762410</td>
			<td>It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regeneration and Conditioning Kit and Buffers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762210</td>
			<td>It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 ml each solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L PBS/Tween/EDTA buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762730</td>
			<td>It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet RED384 System</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td></td>
			<td>Version 9.0.0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5060</td>
			<td>One tray of 96 biosensors&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well Tilted-Bottom Plate&#160;</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosensor Dispenser</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetics Buffer 10X</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-1092</td>
			<td>10X concentration. Contains ProClin 300.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBIS MX96 SPRi System</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensEye COOH-G chip</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>1-09-04-004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.19.3.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRint Data Analysis Software</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.15.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrubber 2</td>
			<td>BioLogic Software</td>
			<td></td>
			<td>Version 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein A/G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms

ラベルフリー光学バイオセンサは、生体分子の相互作用の特徴付けのため、創薬における強力なツールです。本研究では、人間のプロタンパク質転換酵素サブチリシンケキシン9型（PCSK9）に対する10高親和性モノクローナル抗体（mAb）の結合親和性と動態を評価するために私たちの研究室で4つの日常的に使用バイオセンサープラットフォームの使用を記載しています。ビアコアT100とのProteon XPR36双方が十分に確立された表面プラズモン共鳴（SPR）技術から派生しているが、後者は即興6×6十字を介して並列に36個の反応スポットを呈するのに対し、前者は、直列流れ構成で接続された4つのフローセルを有しますマイクロ流体チャネル構成。 IBIS MX96は、空間方向で検出を提供する付加的な撮像機能と、SPRセンサ技術に基づいて動作します。連続流Microspotter（CFM）と結合され、この検出技術は、電子によって著しくスループットを拡張します同時に96反応スポーツの多重配列印刷および検出をnabling。対照的に、オクテットRED384は、光ファイバプローブは、先端面での結合相互作用に干渉パターンの変化を検出するバイオセンサーとして作用して、生物層干渉法（BLI）の光学原理に基づいています。 SPRベースのプラットフォームとは異なり、BLIシステムは、連続流動流体に依存していません。彼らは軌道攪拌中384ウェルマイクロプレートの検体溶液中に浸漬している間代わりに、センサチップは、測定値を収集します。 これらのバイオセンサープラットフォームは、それぞれ独自の長所と短所があります。 1分子間相互作用モデル：品質動態データを提供するために、これらの機器の能力の直接比較を提供するために、記載されているプロトコルは、単純な1に適合し、抗体 - 抗原動態を特徴づけるために、同じアッセイフォーマットを使用した実験と同じ高品質の試薬を示して。

図1は、2つの固定化方法によってCFMとスポットのmAbレベルから抗体配列画像を示し、 図2は、マルチサイクル運動からMX96で生成対応する結合センサーグラム及びこれらのmAbアレイ上の単一サイクル動態測定を示します。 6 - 4つのバイオセンサプラットフォームで生成された複数の抗体でコーティングされた表面からのリアルタイム結合および動力学的近似曲線は、 図3に示されています。 図7は、これらの結合曲線のグローバル分析から得られた最終的な反応速度および平衡結合定数の比較を示します。個々のアソシエーション（k）は 、解離（K d）は 、平衡（K D）の結合定数を表1に示します。同じ楽器内で生成されたデータセットの変動性を実証するために、 <st栄&gt;図8は、異なるmAbの表面密度でk個のA、K dおよびK Dのプロットを示し、 図9は、さらに、バイオセンサプラットフォーム間のmAb表面の計算結合活性を比較します。 <img alt="図1" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" /> IBIS MX96でCFM印刷から図1アミン結合（A）の多重リガンド配列およびFc捕捉（B）抗体表面。印刷されたアレイの画像は赤四角で囲まれた灰色領域は抗体の存在を示し、左のパネルに示されています。活性抗体スポットの間に位置する暗いinterspots基準減算のために使用されます。各列は、以下で特定滴定濃度で、画像の左側に印刷された抗体を含有します。ジを計算することによって定量印刷抗体の量アクティブと参照位置との間のバルクシフトのfferenceは右パネルに示されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図2" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" /> IBIS MX96におけるマルチサイクル（A）とシングルサイクル（B）速度論的実験からのリアルタイム結合センサーグラムを図2の比較。 10×8抗体アレイを横切って濃度を増加でヒトPCSK9の連続注射は、それぞれ対応するセンサーグラムセグメント上述されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図3" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" /> <stビアコアT100 1つの動力学モデルに合わせるオーバーレイ：栄&gt;図3は、ヒトPCSK9と1との対話キャプチャ抗体のセンサーグラムの結合します。相互作用は、高（ 上部パネル）、中（ 中央パネル）、及び低（ 下のパネル）密度面にわたって評価されます。 1相互作用モデル：重ね滑らかな黒い線は、1とは異なるヒトPCSK9濃度（色付きの線）での結合応答信号の動的フィットを表します。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図4" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" /> ProteonのXPR36 1つの動力学モデルに合わせるオーバーレイ：図4のヒトPCSK9と1との対話キャプチャ抗体のセンサーグラムの結合。相互作用は、高（ 上部パネル）、MEDIにわたって評価されていますum-（ 中央パネル）、及び低（ 下のパネル）密度面。 1相互作用モデル：重ね滑らかな黒い線は、1とは異なるヒトPCSK9濃度（色付きの線）での結合応答信号の動的フィットを表します。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図5" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" /> オクテットRED384 1つの動力学モデルに合わせるオーバーレイ：図5.ヒトPCSK9と1との対話キャプチャ抗体のセンサーグラムの結合。相互作用は、高（ 上部パネル）、中（ 中央パネル）、及び低（ 下のパネル）密度面にわたって評価されます。重ね赤い線は1に異なるヒトPCSK9濃度（色付きの線）での結合応答信号の動的フィットを表します。<html> 1つの相互作用モデル。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図6" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" /> IBIS MX96 1つの動力学モデルに合わせるオーバーレイ：図6.ヒトPCSK9と1との対話アミン結合（A）およびFc捕捉（B）抗体のセンサーグラムの結合。結合プロファイルは図1のアレイプレートマップに従って10×8パネルとして編成されます。黒線は、異なるヒトPCSK9濃度で記録された結合応答信号を表し、重ね赤線が近似曲線を表します。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> グレ7&quot; SRC = &quot;/ファイル/ ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg&quot; /&gt; アソシエーション・K（A）の図7の比較、解離の K d（B）、および4つのバイオセンサープラットフォームによって生成平衡K D（C）結合定数。 6 -速度論的パラメータは、 図3における結合曲線のグローバル分析に由来します。バイアコアT100（青）のProteon XPR36（緑）、オクテットRED384（赤）、IBIS MX96、アミン結合（紫）、およびIBIS MX96は、Fc捕捉（オレンジ）を次のように器具が示されています。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図8" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" /> BIACの複数の抗体表面密度以上の反応速度定数の一貫性の図8の比較<html>鉱石T100（A）のProteon XPR36（B）、オクテットRED384（C）、IBIS MX96、アミン結合（D）、及び捕捉のFc IBIS MX96、（E）。速度論的パラメータ（ トップサブパネル）をK、 の K d（ 中間サブパネル）、及びK D（ 底サブパネル）は個々の抗体の面密度で基分析に由来します。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。</a> <img alt="図9" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" /> 図 四バイオセンサープラットフォームにおける抗体表面とその標準偏差（エラーバー）の 9 結合活性。値は、研究論文17で説明した式を用いて計算されます。large.jpg」ターゲット= 『_空白』&gt;この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td> kは </td><td> K D </td><td> K D </td></tr><tr><td> （M -1 S -1） </td><td> （S -1） </td><td> （NM） </td></tr><tr><td> モノクローナル抗体1 </td><td> 11.7（7.8）10 5 xは</td><td> 4.89（4.18）10 -5 xは</td><td> 0.052（0.05） </td></tr><tr><td> モノクローナル抗体2 </td><td> 1.53（0.28）10×5 </td><td> 1.30（1.54）10 -5 xは</td><td> 0.092（0.12） </td></tr><tr><td> モノクローナル抗体3 </td><td> 11.4（8.3）10 5 xは</td><td> 27.6（11.0）10 -5 xは</td><td> 0.333（0.20） </td></tr><tr><td> モノクローナル抗体4 </td><td> 3.61（1.6）10 5 xは</td><td> 20.1（12.3）10 -5 xは</td><td> 0.659（0.54） </td></tr><tr><td> モノクローナル抗体5 </td><td> 0.59（0.21）10×5 </td><td> 3.46（2.50）10 -5 xは</td><td> 0.663（0.46） </td></tr><tr><td> モノクローナル抗体6 </td><td> 1.19（0.78）10×5 </td><td> 7.21（3.83）10 -5 xは</td><td> 0.894（0.64） </td></tr><tr><td> モノクローナル抗体7 </td><td> 1.29（0.53）10×5 </td><td> 16.4（5.63）10 -5 xは</td><td> 1.57（1.02） </td></tr><tr><td> モノクローナル抗体8 </td><td> 4.02（2.23）10×5 </td><td> 22.8（10.7）10 -5 xは</td><td> 0.768（0.68） </td></tr><tr><td> モノクローナル抗体9 </td><td> 4.20（2.13）10×5 </td><td> 6.67（4.3）10 -5 xは</td><td> 0.197（0.16） </td></tr><tr><td> モノクローナル抗体10 </td><td> 1.20（0.49）×10 5 </td><td> 12.5（7.64）10 -5 xは</td><td> 1.27（0.80） </td></tr></tbody></table> 表1：1 相互作用モデル：反応速度と平衡は1〜フォーバイオセンサーインスツルメンツから結合曲線のグローバルフィッティングにより得られた10のmAbの結合定数。

Watch this Scientific Journal Video about Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms at JoVE.com

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

私たちは4つの一般的に使用されるバイオセンサープラットフォームを使用して、抗体 - 抗原結合親和性および動態の測定のために、ここでのプロトコルを記述します。

四バイオセンサープラットフォームを用いた高親和性抗体の抗原結合速度の決意

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

マイクロスケールの熱泳動を使用してATPのアプタマーの結合部位のマッピング

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

ニトロセルロース結合アッセイを用いて細菌ヒスチジンキナーゼ自己リン酸化の定量化

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

アイスアフィニティー精製を用いた氷再結晶阻害とアイソレーションの評価による植物の氷結合タンパク質の同定

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

小さい gtp アーゼ プレニル化および分子量 GTP 結合を使用して膜分画と gtp アーゼ抗体法の検出

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

動的タンパク質複合体の分析の組み立てし、質量分析法と電子顕微鏡を用いた Biolayer 干渉法によるバイオ センサーから解放

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

散逸の Microgravimetry 結合タンパク質アネキシン A2 への水晶振動子を用いた固相担脂質膜リン脂質の結合動態を研究するには

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

蛍光顕微鏡を使用して競争力のある滴定による転写因子の DNA 結合親和性の高感度測定

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

格子光シート顕微鏡による表面T細胞受容体ダイナミクスの可視化4次元的な研究

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

肝癌における相撲プロテオームの濃縮、単離、同定、特性評価のためのツールとしての相撲結合エンティティ(SES)

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...