Name: determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms
Uploaded: 2017-04-17T15:00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms at JoVE.com

Forfatterne takker Noah Ditto og Adam Miles for teknisk assistanse på IBIS MX96.

<ol>
	<li>Cooper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+biosensors+in+drug+discovery.">Optical biosensors in drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).</li><li>Van Regenmortel, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+antigen-antibody+interactions+with+biosensors.">Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors.</a> J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).</li><li>Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+screening+of+antibodies+from+crude+hybridoma+samples+using+Biacore.">Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore.</a> Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).</li><li>Katsamba, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+a+high-affinity+antibody/antigen+interaction+performed+by+multiple+Biacore+users.">Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users.</a> Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).</li><li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+blocking+assays+using+Octet,+ProteOn,+and+Biacore+biosensors.">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).</li><li>Abdiche, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+Epitope+Binning+Assays+on+Label-Free+Array-Based+Biosensors+Can+Yield+Exquisite+Epitope+Discrimination+That+Facilitates+the+Selection+of+Monoclonal+Antibodies+with+Functional+Activity.">High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity.</a> PLoS ONE. 9 (3), e92451 (2014).</li><li>Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+therapeutic+monoclonal+antibody+market.">The therapeutic monoclonal antibody market.</a> mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).</li><li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Higher-throughput,+label-free,+real-time+molecular+interaction+analysis.">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li><li>Keighley, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+need+for+high+throughput+kinetics+early+in+the+drug+discovery+process.">The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process.</a> Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).</li><li>Lad, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+kinetic+screening+of+hybridomas+to+identify+high-affinity+antibodies+using+bio-layer+interferometry.">High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry.</a> J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).</li><li>Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ProteOn+XPR36TM+Array+System-High+Throughput+Kinetic+Binding+Analysis+of+Biomolecular+Interactions.">The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions.</a> Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).</li><li>Eddings, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+continuous-flow+print+head+for+micro-array+deposition.">Improved continuous-flow print head for micro-array deposition.</a> Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).</li><li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor+the+Octet.">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet.</a> Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li><li>Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+the+ProteOn+XPR36+biosensor+into+a+36-ligand+array+expedites+protein+interaction+analysis.">Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis.</a> Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).</li><li>Rich, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+global+benchmark+study+using+affinity-based+biosensors.">A global benchmark study using affinity-based biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics.">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).</li><li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dataset+of+the+binding+kinetic+rate+constants+of+anti-PCSK9+antibodies+obtained+using+the+Biacore+T100+ProteOn+XPR36,+Octet+RED384,+and+IBIS+MX96+biosensor+platforms.">Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms.</a> Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).</li><li>Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+size-exclusion+separations+of+proteins+and+polymers+by+UHPLC.">Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC.</a> Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).</li></ol>

Publiserings avgifter for denne video-artikkelen ble betalt av Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals.

Vår head-to-head sammenligning studie viser at hver biosensor plattform har sine egne styrker og svakheter. Selv om bindingsprofilene av antistoffene er tilsvarende ved visuell sammenligning (figur 3 - 6), og den rangordningen av de ervervede kinetiske hastighetskonstantene er meget ensartet på tvers av instrumentene (figur 7), viser våre resultater at SPR-baserte instrumenter med kontinuerlige strømnings fluidics) er bedre ved å løse høy-affinitets interaksjoner med langsomme dissosiasjon priser. Drift oppover under dissosiasjon fasen observeres i datasett (f.eks mAb 2, 5 mAb, mAb og 9, figur 5) som genereres av den BLI fluidics-frie instrument. Dette funn kan tilskrives i stor grad til prøve fordampning over tid i mikroplaten, som er en primær begrensning av systemet. Med denne iboende begrensning, er den eksperimentelle tiden også begrenses til mindre enn 12 timer; forsøkene ble derfor programmert med shorter ganger (500 s forening og 30 min dissosiasjon) sammenlignet med de i de andre plattformer (10 min forening og 45 min dissosiasjon). Imidlertid forkorte den eksperimentelle tiden synes ikke å dempe virkningen av fordampning på datakvalitet / konsistens, som hastighetskonstantene genereres av BLI basert instrument vis mindre linearitet som følge av svingninger i noen av av hastighetene (Figur 8C ). I tillegg til prøve fordampning, kan forskjeller i oppbringelsesreagensene som anvendes har også bidratt til forskjellene i de oppnådde resultater. Selv om protein A / G ble anvendt i alle tre Fluidics baserte SPR plattformer, ble AHC sensorer som brukes i den ikke-fluidics BLI plattform. Siden protein A / G er sannsynlig å ha en svakere affinitet for mAbs enn betyr AHC, et antistoff-baserte biosensor overflate, off-hastigheter av mAb-antigen-komplekset fra protein A / G-overflater på kunstig vis kan vises hurtigere enn de som er oppnås fra AHC overflate. Denne mulighet er understøttet by de eksperimentelle data som viser at off-frekvensverdier generert av BLI plattformen var gjennomgående lavere enn de som oppnås fra de andre instrumenter (figur 7, rød linje). Likevel har BLI plattform forskjellige fordeler fremfor de andre plattformene. For eksempel, er den svært fleksibel med hensyn til valg sensor og analyse konfigurasjon på grunn av de forskjellige forbelagte sensorer for umiddelbar bruk. I våre eksperimenter bruk av AHC Sensorene bli eliminert behovet for liganden immobilisering trinn, noe som reduserer forberedelsestid. Videre krever BLI plattformen mye mindre vedlikehold sammenlignet med de andre lufthåndtering SPR-plattformer, som har kompliserte slange og verdien bryterkonfigurasjonene. Denne egenskap er en fordel for forsøk med rå prøver som kan føre til tilstopping og forurensningsproblemer. Ettersom behovet for en effektiv, rask og nøyaktig identifikasjon av terapeutiske kandidater øker, vil behovet for biosensor gjennomstrømning er også økende. Blant de fire biosensor plattformene, gjennomstrømningen fra biosensoren i stand til 96-ligand-matrise trykking er det høyeste, etterfulgt av biosensor koblet til en sikksakk 36-ligand-formatet og det BLI baserte biosensor med 16 kanaler samtidig utlesning, noe som til syvende og sist øker antall interaksjoner målt i et enkelt bindende syklus til 96, 36 og 16, henholdsvis. Disse gjennomløpskapasitet er betydelig høyere enn for den tradisjonelle SPR-plattformen, som er begrenset ved at bare fire strømningsceller forbundet med en enkelt seriestrømning. Siden våre eksperimenter involverte et relativt lite utvalg sett med 10 mAbs evaluert på flere overflate tettheter med lange dissosiasjon ganger, instrumentale throughputs spilt en moderat rolle i å bestemme effektiviteten av forsøkene. Det var ingen signifikante forskjeller i de eksperimentelle tider av de tre high-throughput plattformer, og i alle tilfeller forsøkene ble gjennomført på en dag. På den annen side, den tradisjonelle seriestrømnings SPR eksperimenter kreves 3 dager å fullføre, til tross for walk-away automatisering av datainnsamling etter oppsett. I andre studier som involverer et stort antall prøver (dvs. i flere hundre eller tusen), for off-rate rangerings / kinetisk screening eller epitop binning formål, blir gjennomstrømningen en kritisk faktor. Selv om gjennomstrømningen i IBIS MX96 er flere størrelsesordener høyere enn den for de andre biosensorer og er derfor et optimalt valg for disse formål, har det noen mangler. Spesielt rekken trykking av CFM viser store overflateuregelmessigheter (figur 1) og redusert data reproduserbarheten (figur 8D og 8E). For nøyaktige kinetiske målinger, er mengden av ligand på biosensor overflate er en kritisk parameter som må kontrolleres for å sikre at bindings responser ikke blir forstyrret av sekundære faktorer såsommasseoverføring eller sterisk hindring. For Biacore T100 og ProteOn XPR36 ble de optimale R-L-nivåene bestemt basert på standarden beregning av settet R max verdier som beskrevet i det forskningsartikkel 17. På den annen side, for de Oktett RED384 og IBIS MX96 plattformer, ble mAb fangstnivåer oppnås empirisk ved hjelp av en serie av 2-ganger seriefortynnede antistoffer i faste tider. Mangelen på kjennskap til eller kontroll av fangst trinn resulterte i en høy tetthet overflate og høy bindingsreaksjonssignaler (figur 2) som kan ha kompromittert nøyaktigheten av de kinetiske hastighetskonstantene. Videre er separeringen av skriveren fra SPR detektoren er også en utfordring når gjennomføre flere bindesyklus målinger som involverer regenereringer. Den eneste måten å utføre multi-syklus kinetikk oppsettet var ved direkte aminkobling av mAb&#39;ene, i motsetning til å fange opp gjennom mAb Fc av det immobiliserte protein A / Goverflate på de tre andre biosensor plattformer. Som et resultat ble en ytterligere regenerering rekognosering eksperiment er nødvendig for å bestemme de optimale regenereringsbetingelsene. Resultatet av dette oppsettet var knyttet til en ~ 90% lavere observerte overflateaktivitet sammenlignet med Fc fangst-metoden (figur 9), i tillegg til en lengre forsøks tid. For å utføre Fc fangstmetode, ble et alternativ single-syklus kinetisk tilnærming vedtatt. Denne fremgangsmåten omfatter den sekvensielle injeksjon av analytt ved økende konsentrasjoner uten regenerering mellom hver injeksjon (figur 2). Denne svært praktisk, men mindre vanlig anvendt tilnærming ikke bare forkortes den eksperimentelle tiden og redusert reagens forbruk, men også produsert kinetiske hastighetskonstanter høyt som ligner de fra de andre biosensorer (figur 7). Derfor er anvendelsen av denne enkelt-sykluskinetikken tilnærmingen overvinner den iboende begrensning konfigurasjon av instrumentet og viser enmulighet for å oppnå høy oppløsning kinetiske hastighetskonstanter i en high-throughput måte. Til tross for gjennomstrømningen være en stor begrensning i Biacore T100, våre resultater kollektivt viser at det genereres de mest konsistente data med høyeste kvalitet. Dette ble etterfulgt av ProteOn XPR36, som har ~ 10 ganger høyere gjennomstrømning. Deres evne til å generere høy-kvalitetsdata blir en fordel ved karakterisering av høy-affinitets antistoff-antigen-vekselvirkninger som kan være teknisk utfordrende når instrumentenes deteksjonsgrensene er nådd. Mens de systematiske begrensninger i instrumentering av Oktett RED384 hindre nøyaktig måling av dissosiasjon hastighetskonstanter (det vil si fallende kort av følsomheten for å løse tilstrekkelig signal forråtnelse for langsom off-priser), både Biacore T100 og ProteOn XPR36 kan gi følsom og pålitelig deteksjon for differensiering.

The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the "gold standard" for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7. 
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96's SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an "all-in-one" setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate "dip-and-read" use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument's fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a "one-shot" kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle. 
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, "Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics"17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Biacore T100 System</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>28975001</td>
			<td>The T100 system has been upgraded to T200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CM5 Sensor Chip&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BIAevaluation&#160;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>Version 4.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biacore T100 Control Software</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td></td>
			<td>The T100 control software has been upgraded to T200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100050&#160;</td>
			<td>It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 ml 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBS-EP+ Buffer 10&#215;</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100669</td>
			<td>Concentrated stock solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials, o.d. 7 mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100212&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rubber Caps, type 3</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>BR100214&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1760100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ProteOn Manager Software&#160;</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1760200</td>
			<td>Version 3.1.0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GLM Sensor Chip</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1765012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amine Coupling Kit</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762410</td>
			<td>It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Regeneration and Conditioning Kit and Buffers</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762210</td>
			<td>It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 ml each solution&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 L PBS/Tween/EDTA buffer</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>1762730</td>
			<td>It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Octet RED384 System</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td></td>
			<td>Version 9.0.0.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5060</td>
			<td>One tray of 96 biosensors&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>384-Well Tilted-Bottom Plate&#160;</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Biosensor Dispenser</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-5016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kinetics Buffer 10X</td>
			<td>Fort&#233;Bio</td>
			<td>18-1092</td>
			<td>10X concentration. Contains ProClin 300.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IBIS MX96 SPRi System</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 2.0</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SensEye COOH-G chip</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>1-09-04-004</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Data Analysis Software</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.19.3.17</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SPRint Data Analysis Software</td>
			<td>Wasatch Microfluidics</td>
			<td></td>
			<td>Version 6.15.2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scrubber 2</td>
			<td>BioLogic Software</td>
			<td></td>
			<td>Version 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce Recombinant Protein A/G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>21186</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms

Label-free optiske biosensorer er kraftige verktøy i medisiner for karakterisering av biomolekylære interaksjoner. I denne studien, beskriver vi bruken av fire brukes rutinemessig biosensor plattformer i vårt laboratorium for å bedømme bindingsaffiniteten og kinetikken til ti høy-affinitets monoklonale antistoffer (mAbs) mot human proprotein konvertase subtilisin Kexin type 9 (PCSK9). Mens både Biacore T100 og ProteOn XPR36 er avledet fra den veletablerte overflate-plasmonresonans (SPR) teknologi, har den førstnevnte fire strømningsceller forbundet med seriestrømningsforhold, mens de sistnevnte presenterer 36 reaksjonssteder i parallell gjennom et improvisert 6 x 6 krysser mikrofluidkanalkonfigurasjonen. IBIS MX96 opererer også basert på SPR sensorteknologi, med et ytterligere avbildningsfunksjon som gir deteksjon i romlig orientering. Denne teknikk for bestemmelse av kombinert med kontinuerlig strømning Microspotter (CFM) utvider gjennomløps betraktelig ved enabling multiplex gruppe trykking og deteksjon av 96 reaksjons sport samtidig. I motsetning til dette er den Oktett RED384 basert på biolaget Interferometry (BLI) optisk prinsipp, med fiberoptiske sonder som virker som biosensor for å påvise interferensmønster endres ved binding interaksjoner på tuppoverflaten. I motsetning til SPR-baserte plattformer, gjør BLI systemet ikke er avhengig av kontinuerlige strømningslufthåndtering; I stedet sensor tips samle inn målinger mens de er nedsenket i analytt-løsninger av en 384-brønners mikroplate under orbital omrøring. Hver av disse biosensor plattformene har sine egne fordeler og ulemper. For å tilveiebringe en direkte sammenligning mellom de instrumentenes evne til å gi kvalitetskinetiske data, de beskrevne protokoller illustrerer eksperimenter som bruker den samme analyseformatet, og den samme høye kvalitet reagenser for å karakterisere antistoff-antigen-kinetikk som passer den enkle 1: 1 molekylær modell for gjensidig påvirkning .

Figur 1 viser antistoffarrangement med bildet fra CFM og flekket monoklonalt antistoff nivåene av de to immobilisering metoder, og Figur 2 viser de tilsvarende bindings sensorgrams som genereres i MX96 fra multi-syklus kinetiske og den en-cyklus kinetiske målinger på disse mAb-arrays . Den sanntids-binding og kinetisk montert kurver fra multiple antistoff-belagte overflater som genereres i de fire biosensor plattformene er vist i Figurene 3 - 6. Figur 7 viser sammenligningen av de endelige kinetiske rater og Likevektsbinding konstanter oppnådd fra den globale analyse av disse bindingskurver. Den enkelte assosiasjon (k a), dissosiasjon (k d), og likevekt (KD) bindingskonstanter er presentert i tabell 1. For å demonstrere variabiliteten av datasett generert innenfor samme instrument, <stRong&gt; Figur 8 viser plott av k a, k d, og K D ved forskjellige mAb overflate tettheter, og Figur 9 sammenligner de beregnede bindingsaktiviteter for de mAb flatene på tvers av biosensor plattformene ytterligere. <img alt="Figur 1" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" /> Figur 1. Multipleks ligand Arrays av amin-koblet (A) og Fc-fanget (B) Antistoff Overflater fra CFM Printing i IBIS MX96. Bilder av de trykte arrays er vist i den venstre paneler, hvor de grå områdene omgitt av røde firkanter indikerer tilstedeværelse av antistoff. De mørkere interspots plassert mellom de aktive antistoff-stedene blir brukt for referanse subtraksjon. Hver kolonne inneholder et antistoff som er trykt på titrerings-konsentrasjonene angitt nedenfor, og til venstre i bildet. Mengdene av de trykte antistoffene kvantifisert ved å beregne difference i bulk forskyvninger mellom de aktive og referanse steder er vist i høyre panel. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" /> Figur 2. Sammenligning av Real-time Binding Sensorgrams fra Multi-syklus (A) og en-cyklus (B) Kinetiske Forsøk i IBIS MX96. Den sekvensielle injeksjoner av human PCSK9 ved økende konsentrasjoner på tvers av de 10 x 8 antistoff-matriser er angitt over hver tilsvarende sensorgram segment. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 3" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" /> <stRong&gt; Figur 3. Binding Sensorgrams av de fangede antistoffer i samspill med human PCSK9 og 1: 1 Kinetiske modelltilpasning overlegg i Biacore T100. Vekselvirkningen er evaluerte over høy- (øvre paneler), middels (midtre panel), og med lav (bunnflatene) tetthets overflater. De kledde glatte sorte linjer representerer den kinetiske anfall av bindingsresponssignaler ved forskjellige humane PCSK9 konsentrasjoner (fargede linjer) til en 1: 1-modell for gjensidig påvirkning. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 4" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" /> Figur 4. Binding Sensorgrams av de fangede antistoffer i samspill med human PCSK9 og 1: 1 Kinetiske modelltilpasning overlegg i ProteOn XPR36. Vekselvirkningen er evaluerte over høy- (øvre paneler), medium- (midtre panel), og med lav (bunnflatene) tetthets overflater. De kledde glatte sorte linjer representerer den kinetiske anfall av bindingsresponssignaler ved forskjellige humane PCSK9 konsentrasjoner (fargede linjer) til en 1: 1-modell for gjensidig påvirkning. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 5" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" /> Figur 5. Binding Sensorgrams av de fangede antistoffer i samspill med human PCSK9 og 1: 1 Kinetiske modelltilpasning overlegg i Oktett RED384. Vekselvirkningen er evaluerte over høy- (øvre paneler), middels (midtre panel), og med lav (bunnflatene) tetthets overflater. De klædd med røde linjer representerer den kinetiske anfall av bindingsresponssignaler ved forskjellige humane PCSK9 konsentrasjoner (fargede linjer) til en 1:<html> En modell for gjensidig påvirkning. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 6" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" /> Figur 6. Binding Sensorgrams av aminet koplede (A) og Fc-fangede (B) Antistoffer samspill med human PCSK9 og 1: 1 Kinetiske modelltilpasning overlegg i IBIS MX96. Bindingsprofiler er organisert som 10 x 8 paneler som følger matrise plate kartet på figur 1. De sorte linjer representerer de registrerte bindende svarsignaler på forskjellige humane PCSK9 konsentrasjoner, og som er lagt over røde linjer representerer de monterte kurver. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> gur 7&quot; src = &quot;/ files / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg&quot; /&gt; Figur 7. Sammenligning av Association k en (A), Dissosiasjon k d (B), og Equilibrium K D (C) bindingskonstanter som frembringes av fire biosensor plattformer. De kinetiske parametere er avledet fra global analyse av bindingskurvene i figur 3 - 6. Instrumentene er representert som følger: Biacore T100 (blå), ProteOn XPR36 (grønn), Oktett RED384 (rød), IBIS MX96, amin-koblet (purpur), og IBIS MX96, Fc-fanget (oransje). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 8" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" /> Figur 8. Sammenligning av konsistensen av Kinetic hastighetskonstanter over flere Antistoff Surface densiteter i Biac<html> malm T100 (A), ProteOn XPR36 (B), Oktett RED384 (C), IBIS MX96, amin-koblet (D), og IBIS MX96, Fc-fanget (E). De kinetiske parameterne k a (topp underpanel), k d (midterste underpanel), og K D (bunnunderpanel) er avledet fra gruppeanalyse ved individuell antistoff overflatetetthet. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a> <img alt="Figur 9" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" /> Figur 9. Bindingsaktivitetene av antistoffet overflater og deres standardavvik (feilfelt) i de fire biosensor plattformer. Verdiene er beregnet ved hjelp av ligninger beskrevet i vitenskapelige artikler 17.large.jpg&quot; target = &#39;_ blank&#39;&gt; Klikk her for å se en større versjon av dette tallet. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td> k en </td><td> k d </td><td> K D </td></tr><tr><td> (M-1S-1) </td><td> (e -1) </td><td> (nM) </td></tr><tr><td> mAb 1 </td><td> 11,7 (7,8) x 10 5 </td><td> 4,89 (4,18) x 10 -5 </td><td> 0,052 (0,05) </td></tr><tr><td> mAb 2 </td><td> 1,53 (0,28) x 10 5 </td><td> 1,30 (1,54) x 10 -5 </td><td> 0,092 (0,12) </td></tr><tr><td> mAb 3 </td><td> 11,4 (8,3) x 10 5 </td><td> 27,6 (11,0) x 10 -5 </td><td> 0,333 (0,20) </td></tr><tr><td> mAb 4 </td><td> 3,61 (1,6) x 10 5 </td><td> 20,1 (12,3) x 10 -5 </td><td> 0,659 (0,54) </td></tr><tr><td> mAb 5 </td><td> 0,59 (0,21) x 10 5 </td><td> 3,46 (2,50) x 10 -5 </td><td> 0,663 (0,46) </td></tr><tr><td> mAb 6 </td><td> 1,19 (0,78) x 10 5 </td><td> 7,21 (3,83) x 10 -5 </td><td> 0,894 (0,64) </td></tr><tr><td> mAb 7 </td><td> 1,29 (0,53) x 10 5 </td><td> 16,4 (5,63) x 10 -5 </td><td> 1,57 (1,02) </td></tr><tr><td> mAb 8 </td><td> 4,02 (2,23) x 10 5 </td><td> 22,8 (10,7) x 10 -5 </td><td> 0,768 (0,68) </td></tr><tr><td> mAb 9 </td><td> 4,20 (2,13) x 10 5 </td><td> 6,67 (4,3) x 10 -5 </td><td> 0,197 (0,16) </td></tr><tr><td> mAb 10 </td><td> 1,20 (0,49) x 10 5 </td><td> 12,5 (7,64) x 10 -5 </td><td> 1,27 (0,80) </td></tr></tbody></table> Tabell 1: Kinetic priser og Equilibrium Binding konstanter av 10 mAbs innhentet av Global Montering av binding Curves fra fire biosensor instrumenter til 1: 1 Interaksjon Model.

Watch this Scientific Journal Video about Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms at JoVE.com

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Vi beskriver her protokoller for måling av antistoff-antigen-bindende affiniteten og kinetikk ved hjelp av fire som vanligvis brukes biosensor plattformer.

Bestemmelse av høy-affinitets antistoff-antigen-bindingskinetikken ved hjelp av fire Biosensor plattformer

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Mapping the Binding Site of an Aptamer on ATP Using MicroScale Thermophoresis

Kartlegging av bindingssetet på en Aptamer på ATP Bruke mikro termodiffusjon

Characterization of molecular interactions in terms of basic binding parameters such as binding affinity, stoichiometry, and thermodynamics is an ...

Quantification of Bacterial Histidine Kinase Autophosphorylation Using a Nitrocellulose Binding Assay

Kvantifisering av bakteriell histidin kinase Autofosforylering Ved hjelp av en Nitrocellulose bindingsanalyse

We demonstrate a useful method for quantifying autophosphorylation of purified bacterial histidine kinases. Histidine kinases are known for their ...

Identification of Plant Ice-binding Proteins Through Assessment of Ice-recrystallization Inhibition and Isolation Using Ice-affinity Purification

Identifisering av Plant is-bindende proteiner ved å bedømme is-rekrystallisasjon inhibering og isolering ved bruk av is-affinitetsrensing

Ice-binding proteins (IBPs) belong to a family of stress-induced proteins that are synthesized by certain organisms exposed to subzero temperatures. In ...

Detection of Small GTPase Prenylation and GTP Binding Using Membrane Fractionation and  GTPase-linked Immunosorbent Assay

Påvisning av små GTPase Prenylation og GTP bindende ved hjelp av membran fraksjoneres og GTPase-koblede Immunosorbent analysen

The Rho GTPase family belongs to the Ras superfamily and includes approximately 20 members in humans. Rho GTPases are important in the regulation of ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

Analysere dynamisk Protein komplekser sammen på og løslatt fra Biolayer Interferometry Biosensor massespektrometri og elektronmikroskop

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

Dissipative Microgravimetry to Study the Binding Dynamics of the Phospholipid Binding Protein Annexin A2 to Solid-supported Lipid Bilayers Using a Quartz Resonator

Dissipative Microgravimetry å studere Binding dynamikken i Phospholipid bindende Protein Annexin A2 til Solid-støttet Lipid Bilayers bruker et Quartz-Resonator

The dissipative quartz crystal microbalance technique is a simple and label-free approach to measure simultaneously the mass uptake and viscoelastic ...

High Sensitivity Measurement of Transcription Factor-DNA Binding Affinities by Competitive Titration Using Fluorescence Microscopy

Høy følsomhet måling av transkripsjon faktor-DNA Binding slektskap av konkurransedyktige titrering bruker fluorescens mikroskopi

Accurate quantification of transcription factor (TF)-DNA interactions is essential for understanding the regulation of gene expression. Since existing ...

Visualizing Surface T-Cell Receptor Dynamics Four-Dimensionally Using Lattice Light-Sheet Microscopy

Visualisere Surface T-cell reseptor Dynamics firedimensjonalt ved hjelp av gitter lysark mikroskopi

The signaling and function of a cell are dictated by the dynamic structures and interactions of its surface receptors. To truly understand the ...

SUMO-Binding Entities (SUBEs) as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-Binding Entities SUBEs as Tools for the Enrichment, Isolation, Identification, and Characterization of the SUMO Proteome in Liver Cancer

SUMO-bindende enheter (SUBEs) som verktøy for berikelse, isolasjon, identifisering og karakterisering av SUMO proteom i leverkreft

Post-translational modification is a key mechanism regulating protein homeostasis and function in eukaryotic cells. Among all ubiquitin-like proteins in ...